苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理,以及这三者的作用是什么

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS（十二烷基磺酸钠）将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。

DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。

离心后有机溶剂在试管底层（有机相），DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚–氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾.

氯仿的作用有多个方面,一是作为有机溶剂变性蛋白,使其沉淀并通过离心除去,同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚,很多自己配试剂提的方法也用苯酚,抽提蛋白时也会用到苯酚）,苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去会损伤核酸,需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等）,起到一定除杂作用

通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25）,减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫,影响后续操作,不过个人经验感觉加不加没什么太大区别,也许是我的样品里蛋白不多吧

异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样.只不过用量少一点,0.6V~1V就够了,不像乙醇沉淀需要至少2V,一般需要2.5倍体积.在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀.不过感觉效果不如乙醇,偶尔会有沉淀不出来东西的时候

tris饱和酚酚可以抽提掉DNA中的蛋白，分层后上层tirs中含有DNA，而下层苯酚中含有蛋白。

水饱和酚可以抽提掉RNA中的蛋白质，分层后上层水相中含有RNA，而下层苯酚中含有蛋白。

苯酚是很强的蛋白质变性剂，所以溶于其中的蛋白都是变了性的蛋白。

可以60℃下水浴加热成液体，先配置80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

配置方法:将装有苯酚的试剂瓶放在40~50度的水浴中，待苯酚融化有液体生成，然后乘热用滴管吸出滴在放置在天平上并去皮的烧杯中，称取一定质量的苯酚，然后加入一定体积的水，混匀即可。

扩展资料

苯酚的危害：

1、苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。急性中毒：吸入高浓度蒸气可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。

2、环境危害：对环境有严重危害，对水体和大气可造成污染。

3、燃爆危险：该品可燃，高毒，具强腐蚀性，可致人体灼伤

参考资料来源：百度百科—苯酚

希望对你有帮助！

DNA的提取方法有7种：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备。

DNA的提取原则

1、保证核酸一级结构的完整性；

2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

提取DNA的注意事项

1、 各操作步骤要轻柔，尽量减少DNA的人为降解。

2、注意防止非核酸类成分干扰。

3、 要减少DNA的降解，促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

4、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

5、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

参考资料来源：百度百科-dna提取

1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：

1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。

5

min

2．溶解DNA：

3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢

4．过滤：取黏稠物

5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3

min

6．过滤：取滤液。

7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5

min

8．DNA的鉴定：沸水浴5min

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DNA提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。

将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

2.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法②化学试剂法：用SDS处理细胞③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

3.DNA提取的几种方法

(1).浓盐法

A.

利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M

氯

纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的

氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA

钠盐沉淀出来.

B.

也可用0.15

MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA

时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA

的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA

的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.

（2）.阴离子去污剂法

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA

.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA

（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA

联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA

的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA

。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态

（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%

，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.

本实验采用的0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。

剧烈振荡可使DNA断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢地颠倒混匀。

要获得高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。

DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有吸收峰。当纯度比值小于1.6时，应考虑进行再次纯化。

整个实验须接触多种有毒、有腐蚀性试剂，故应注意操作规范安全。