培养细菌加乙醇对有影响吗

文章在下面，具体自己看，图本来有5张，但是不知道怎么都传上来，所以只把最关键的图给你了，希望有用

乙醇连续发酵一渗透汽化耦合系统发酵动力学研究

乙醇连续发酵动力学

乙醇作为一种可再生燃料资源引起了广泛关注，这不仅是因为石油储量的日益减少，更是由于乙醇比石油类燃料更环保。发酵法生产乙醇是一个产品抑制过程，连续移走产物乙醇可减弱甚至消除其抑制作用，得到较高的乙醇体积产率。目前所采用的原位分离技术有：真空蒸馏、吸附、萃取、膜蒸馏以及渗透汽化等。其中渗透汽化与乙醇发酵耦合因其低耗高效且对细胞无毒害而受到国内外许多学者的重视和广泛探讨。Mori等人[1]利用PTFE-silicone平板膜构成的渗透汽化膜生物反应器进行直接用未经蒸煮的淀粉为原料的乙醇间歇补料发酵。与传统发酵相比，淀粉利用率大大提高，乙醇产率增加2．25倍。但其选用菌种的乙醇生产能力较酿酒酵母低很多，故乙醇体积产率只有0．36g·h L- 。Ikegami等人[。]和Nomura等人[。]也都采用渗透汽化与发酵耦合系统，以工业用干酵母为实验菌种对乙醇连续发酵进行实验。由于选用的硅沸石膜对乙醇有很高的选择性，得到的乙醇产品浓度分别达到70％ (wt)和98.2％ (wt)，但由于膜通量太小，且膜污染问题严重，在一定程度上限制了其向更大规模发展。本实验室通过自制的平板PDMS复合膜组件及发酵系统来构造硅橡胶膜生物反应系统，使乙醇产率较传统间歇发酵有很大提高，且整个实验过程中未出现膜污染及膜性能下降等问题。此次在前期实验基础上进行放大实验，由前期圆形膜器扩大膜面积为矩形膜器，发酵规模也扩大了一倍。以相

同条件进行乙醇连续发酵与渗透汽化耦合实验，分析乙醇发酵动力学问题，对进一步扩大连续发酵生产乙醇规模有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验菌株及培养基

菌种：实验所选菌种是湖北安琪酵母股份有限公司生产的工业用耐高温酿酒活性干酵母(thermophilic

alcohol active dry yeast(TH—AADY))，具有耐高糖和乙醇的特点。取4g干酵母在温度为35－40℃的自来水中复活20min作为种子液备用。

培养液：培养液的组成(g／L自来水)：CaClz 0．15、酵母膏8．0、(NH4)2 SO4 5．0、葡萄糖100、KH2Po41．5、MgSo4·7HzO 0．55

其中葡萄糖为工业级，其它化学药剂为分析纯，高温灭菌培养液，并冷却到常温后混合备用。

1.2 膜

PDMS复合膜：本实验中采用自制的厚度为128 m(硅橡胶活性皮层厚度为8 m；多孔支撑层为聚酰胺微孔膜，厚度为120gm，平均孔径为0．45um)的硅橡胶(PDMS)复合膜。矩形平板膜组件：膜器为板框式结构，尺寸为300×300mm，单张膜有效面积为0.08m2，可通过叠加多张膜增大有效面积，本实验采用单张膜。该膜器为一维平板薄层流道，其模型溶液(5 乙醇水溶液)的渗透汽化实验已在肖泽仪等[4]的文章中有详细说明。前期实验采用的圆形膜器直径200mm，有效膜面积为0．024m2，一维环形流道。

1．3 反应器系统及流程

发酵一渗透汽化膜生物反应器实验系统如图1所示，在有效体积为5L发酵罐中加入预先配好的发酵培养基，接人种子液进行发酵，并在发酵前期对发酵液进行鼓氧，使细胞快速生长。发酵温度控制在35±1℃，pH值通过滴加氨水调节，使其稳定在4.5±0.5，并通过滴加葡萄糖液维持发酵罐中葡萄糖浓度和发酵液体积。下游冷阱温度设为-30℃，当发酵液中乙醇达到一定浓度时，发酵与渗透汽化过程耦合，在膜下游真空泵作用下，保持1.067kPa真空度。发酵液通过循环泵以110L/h叫的流量在膜上游与发酵罐间循环，并在膜器内进行渗透汽化，透过膜的乙醇蒸汽在冷阱中冷凝下来。发酵过程中71h到l16h进行了45h发酵与渗透汽化耦合连续过程，其它时间采取白天耦合、夜间无基质加入及产物取出的纯发酵方式。本系统运行到第12天，活细胞比率降至50 9／5以下，且发酵罐中乙醇浓度降至18．8g·I ～ ，葡萄糖消耗量也明显下降，以此判断到达发酵终点，整个发酵过程持续269h。

同时，以相同的培养基以及葡萄糖初始浓度进行间歇发酵实验，实验过程中除取样少量消耗，无其

它基质及产物的取出。基质和产物浓度均稳定不变后发酵达到终点。

1．4 分析方法

取样时将一定体积的发酵液用孔径0．8gm的微孔膜过滤掉细胞后蒸馏，然后分别测定馏出液中

乙醇浓度和蒸馏残液中葡萄糖浓度，并由此推算发酵罐中乙醇和葡萄糖浓度。蒸馏后乙醇和葡萄糖浓度均用密度仪(DMA45O0，Anton Paar，Austria)测定。      细胞浓度用两种方法测定：将一定体积发酵液用孔径0．8um微孔膜过滤截留细胞，在60℃下烘干后用精度为0.001mg的电子天平(AR2130／COHAUS USA)称干重；酵母数(个／mL)用血细胞计数板通过荧光显微镜(BI-220 ASC MOTIC)计数，并通过用亚甲基蓝溶液对细胞染色来计算酵母活细胞比率。

2 结果与讨论

实验计算数据如表1所示，按照纯发酵过程和发酵与渗透汽化耦合过程以及综合过程三种情况分

析实验数据。其中乙醇得率系数Yp／s由公式Yp／s=rp／rs得到；细胞得率系数Y s由公式Y s—rx／rs计算；乙醇转化率为：乙醇实际得率系数／乙醇理论得率系数；乙醇理论得率系数按照lmol葡萄糖转化生成2mol乙醇可计算得0.511。由表中可以看出，通过渗透汽化连续移走发酵液中生成的乙醇，可使上游乙醇浓度维持在40g/L。而渗透液中乙醇浓度可达190 g/L左右，浓缩近5倍。且连续发酵乙醇体积产率比间歇发酵提高2．5倍，其中耦合阶段乙醇体积产率更是比间歇发酵提高了4．5倍，发酵液中酵母浓度也为间歇发酵的2．3倍。由此说明连续发酵比间歇发酵环境有较大改善。连续发酵过程中，耦合过程比纯发酵过程细胞得率系数高60%，耦合过程的发酵状况明显好于纯发酵过程。但由于细胞自身代谢消耗基质，乙醇得率系数较间歇发酵有所降低。矩形膜器与圆形膜器相比，各参数都略有提高，但变化不大。说明乙醇发酵与渗透汽化耦合稳定，同步增大发酵规模和膜面积达到大规模连续发酵是可行的。而且发酵环境随着膜器的改进也有所改善，更利于发酵向生成乙醇的方向进行。

葡萄糖是本实验中酵母细胞生长的唯一碳源，在发酵液中缺乏或者过量都可能对细胞生长造成不良影响。伍勇[5]等通过三水平正交实验得到在葡萄糖浓度在10一60g/L 范围内对细胞生长无明显基质抑制现象，故在考察硅橡胶膜生物反应器中的细胞生长动力学时，可不计基质抑制效应的影响。但可能存在基质限制问题，即糖浓度过低，导致细胞处于饥饿状态，最终影响乙醇产率。

乙醇是细胞生长代谢产物，其在发酵液中的积累会抑制酵母细胞的生长。实验证明，在乙醇浓度达到90g/L时，酵母细胞的生长被完全抑制。要使发酵过程能够连续进行必须保持发酵液中乙醇浓度处于较低水平。乙醇连续发酵动力学曲线如图2所示。发酵48h后，发酵罐中乙醇浓度达到70g/L、细胞浓度达到10g/L叫便因抑制不再增加，从此时乙醇发酵与硅橡胶膜渗透汽化过程进行耦合。乙醇浓度随着渗透汽化的进行迅速降低，维持在40g/I 以下，对细胞生长抑制作用明显减弱，细胞浓度又开始增大，并在lOOh后达到20g·L- ，发酵状态稳定后一直维持在20一25g·L一，最高细胞浓度达到27.5g/L 。从图2日间耦合、夜间纯发酵阶段可以看出，通过夜间的纯发酵过程，乙醇浓度在白天渗透汽化开启之前都有一个增长过程，随着渗透汽化的进行，发酵液中乙醇浓度又有很明显的下降趋势，由此可知膜渗透汽化速度大于乙醇生成速度。71h到116h系统连续运行详细情况如图3所示。在45h无间断耦合过程中，发酵及渗透汽化性能稳定，随着渗透汽化的连续作用，乙醇浓度持续下降，并最终达到稳定状态35g/L，相应的膜下游乙醇产品浓度也由25 (wt)下降并最终稳定在17 (wt)左右，说明这个时候乙醇的生成速率与渗透汽化分离速率达到平衡。

提高发酵液中菌体浓度也是实现高强度乙醇连续发酵的一个重要方面。在实验中以4h为单位时

间计算得到酵母细胞比生长率随发酵及渗透汽化作用的进行而变化的情况如图4所示。在前25h内酵

母以较大比生长率快速繁殖，但由于乙醇抑制作用，比生长率快速下降，直至降到0，即细胞停止生长。在渗透汽化作用下比生长率又有所升高，细胞浓度开始快速升高，并最终达到20g/L 以上。在随后的过程中虽然比生长率有或高或低波动，但浮动幅度比较小，基本稳定在0，即细胞浓度在稳定的发酵一渗透汽化过程中长时间维持不变，说明进入稳定状态后，细胞的生长速率和死亡速率达到动态的平衡。在提高菌浓度的同时还要考虑菌体活性，随着实验的进行，细胞的老化是不可避免的，如何实现细胞更新，保持发酵罐内细胞的高活性将是下一步实验需要解决的问题。

乙醇连续发酵过程的269h内，发酵罐中乙醇浓度保持在比较理想的范围50—30g/L，尤其在系统稳定后，基本维持在35—45g/L，这就保证了整个系统在较长时间内在低产物抑制的状态下稳定运行。前期实验[6]已证明，在发酵液复杂产物中乙醇产量比其它挥发性产物至少高3个数量级，分析计算时可将发酵产物看作只有乙醇，但长时间连续发酵一渗透汽化过程还是需要解决副产物积累对发酵的抑制问题。

连续发酵过程中硅橡胶膜表现出良好分离性能，在发酵液乙醇浓度范围为70一30g/L 时得到

浓度为28.2—16.5 (wt)的乙醇产品。渗透总通量达到1226—707g·m-2/h，乙醇渗透通量达到

292.3一l16.6g·m-2/h。，分离因子为8.5—4.9。由图3中可以看出，随着渗透汽化的进行，分离因子在正常范围内波动，但总通量和乙醇通量都有所下降，这是由于膜的分离能力大于发酵产出乙醇能力，随着分离作用的不断进行，上游乙醇浓度不断降低，导致下游通量的下降。这说明要与膜的分离能力相匹配，上游的发酵规模可以更大。前期圆形膜器实验中，在发酵液乙醇浓度范围为92.7—38.9g/L时，下游渗透总通量达到149O一1164g·m-2/h，分离因子为7.8—6.9，扩大实验规模后渗透汽化参数无不利变化。下一步实验将通过采用两级冷凝收集乙醇的方式提高二级乙醇产品浓度，以大幅度降低生产无水乙醇所需能耗。

3 结论

通过乙醇连续发酵一渗透汽化耦合实验和发酵动力学研究发现，渗透汽化膜选择性分离出产物乙

醇，将发酵液中乙醇浓度降低并保持在40g/L左右，减弱甚至消除了乙醇对酵母细胞的抑制作用，大大延长了一批细胞的发酵时间，并显著提高了发酵罐内的细胞浓度、乙醇体积产率和基质消耗速率。发酵一渗透汽化连续耦合阶段的乙醇体积产率维持在3．4g/h/L。，显著高于间歇发酵值。通过圆形膜器与矩形膜器的比较，发酵性能参数以及渗透汽化参数基本不变，说明扩大发酵一渗透汽化耦合实验规模并未对发酵环境以及渗透汽化作用产生不良影响，且通过对发酵规模和膜面积的相应放大来扩大整个连续发酵过程是可行的，这对于进一步扩大连续发酵规模具有重要指导意义。

系统运行过程中膜性能稳定，但长时间操作使得发酵罐内非挥发性副产物积累及细胞活性降低，

导致乙醇体积产率有所下降。进一步实验将考虑对发酵液进行定期部分更新，以维持更好的发酵环境。

参考文献

[1] Y．Mori；T．Inaba，Ethanol production from starch in a pervaporation membrane bioreactor using dostridium thermohydrosulfuricam，Bioteehnology and Bioengineering，1990，36l849- 853

[2]T．Ikegami；H．Yanagishita；n Kitarnoto；H．Negishi，Coneentration of fermented ethanol by oervaooration using silicalite menlbran~coated with silicone rubber，Desalination，2002，149：49-'-54

[3]M. Nomura；T. Bin；S Nakao，Selective ethanol extraction from fermentation broth using a silicalite membrane，Separation and purification technology，2002，27：59．一66

[4]肖泽仪；汤明；黄卫星；等，PDMS复合膜薄层流动膜组件中的渗透蒸发传质动力学，四川大学学报(工程科学版)，2005，37(6)：46—51

Is]伍勇；肖泽仪；黄卫星；等，酿酒酵母在硅橡胶膜生物反应器中连续发酵的生长动力学，现代化工，2004，24(1)：34—39

[6]Wu Yong；Xiao zeyi ；Huang Weixing；et a1．，Mass transfer inpervaooration of active fermentation broth with a composite PDMS membrane。Separation and purification technology，2005，42：47— 53

食醋是我国劳动人民在长期的生产实践中制造出来的一种酸性调味品。它能增进食欲，帮助消化，在人们饮食生活中不可缺少。在我国的中医药学中醋也有一定的用途。全国各地生产的食醋品种较多。著名的山西陈醋、镇江香醋、四川麸醋、东北白醋、江浙玫瑰米醋、福建红曲醋等是食醋的代表品种。食醋按加工方法可分为合成醋、酿造醋、再制醋三大类。其中产量最大且与我们关系最为密切的是酿造醋，它是用粮食等淀粉质为原料，经微生物制曲、糖化、酒精发酵、醋酸发酵等阶段酿制而成。其主要成分除醋酸(3%～5%)外，还含有各种氨基酸、有机酸、糖类、维生素、醇和酯等营养成分及风味成分，具有独特的色、香、味。它不仅是调味佳品，长期食用对身体健康也十分有益。

1.1.1 生产原料

目前酿醋生产用的主要原料有：薯类 如甘薯、马铃薯等；粮谷类 如玉米、大米等；粮食加工下脚料 如碎米、麸皮、谷糠等；果蔬类 如黑醋栗、葡萄、胡萝卜等；野生植物 如橡子、菊芋等；其他 如酸果酒、酸啤酒、糖蜜等。

生产食醋除了上述主要原料外，还需要疏松材料如谷壳、玉米芯等，使发酵料通透性好，好氧微生物能良好生长。

1.1.2 酿造微生物

传统工艺酿醋是利用自然界中的野生菌制曲、发酵，因此涉及的微生物种类繁多。新法制醋均采用人工选育的纯培养菌株进行制曲、酒精发酵和醋酸发酵，因而发酵周期短、原料利用率高。

1） 淀粉液化、糖化微生物

淀粉液化、糖化微生物能够产生淀粉酶、糖化酶。使淀粉液化、糖化的微生物很多，而适合于酿醋的主要是曲霉菌。常用的曲霉菌种有：

甘薯曲霉AS 3.324 因适用于甘薯原料的糖化而得名，该菌生长适应性好、易培养、有强单宁酶活力，适合于甘薯及野生植物等酿醋；

东酒一号 它是AS 3.758的变异株，培养时要求较高的湿度和较低的温度，上海地区应用此菌制醋较多；

黑曲霉AS 3.4309(UV-11) 该菌糖化能力强、酶系纯，最适培养温度为32℃。制曲时，前期菌丝生长缓慢，当出现分生孢子时，菌丝迅速蔓延；

宇佐美曲霉 AS 3.758是日本在数千种黑曲霉中选育出来的其糖化力极强、耐酸性较高的糖化型淀粉酶菌种。菌丝黑色至黑褐色。孢子成熟时呈黑褐色。能同化硝酸盐，其生酸能力很强。对制曲原料适宜性也比较强。

此外还有米曲霉菌株：沪酿3.040、沪酿3.042(AS 3.951)、AS 3.863等。黄曲霉菌株：AS 3.800，AS 3.384等。

2） 酒精发酵微生物

生产上一般采用子囊菌亚门酵母属中的酵母，但不同的酵母菌株，其发酵能力不同，产生的滋味和香气也不同。北方地区常用1300酵母，上海香醋选用工农501黄酒酵母。K字酵母适用于以高梁、大米、甘薯等为原料而酿制普通食醋。AS 2.109、AS 2.399适用于淀粉质原料，而AS 2.1189、AS 2.1190适用于糖蜜原料。

3） 醋酸发酵微生物

① 醋酸菌的选择

醋酸菌是醋酸发酵的主要菌种。醋酸菌具有氧化酒精生成醋酸的能力，其形态为长杆状或短杆状细胞，单独、成对或排列成链状。不形成芽孢，革兰氏染色幼龄菌阴性，老龄菌不稳定，好氧，喜欢在含糖和酵母膏的培养基上生长。其生长最适温度为28~32℃，最适pH值为3.5~6.5。

醋厂选用的醋酸菌的标准为：氧化酒精速度快、耐酸性强、不再分解醋酸制品、风味良好的菌种。目前国内外在生产上常用的醋酸菌有：

奥尔兰醋杆菌(A. orleanense) 它是法国爱尔兰地区用葡萄酒生产醋的主要菌种。生长最适温度为30℃。该菌能产生少量的酯，产酸能力较弱，但耐酸能力较强。

许氏醋杆菌(A. schutzenbachii) 它是国外有名的速酿醋菌种，也是目前制醋工业较重要的菌种之一。在液体中生长的最适温度为25~27.5℃，固体培养的最适温度为28~30℃，最高生长温度37℃。该菌产酸高达11.5%。对醋酸没有氧化作用。

恶臭醋杆菌(A. rancens) 恶臭醋杆菌是我国酿醋常用菌株之一。该菌在液面处形成菌膜，并沿容器壁上升，菌膜下液体不浑浊。一般能产酸6~8%，有的菌株副产2%的葡萄糖酸，并能把醋酸进一步氧化成二氧化碳和水。

AS 1.41醋酸菌 它属于恶臭醋酸杆菌，是我国酿醋常用菌株之一。该菌细胞呈杆状，常呈链状排列，单个细胞大小为（0.3~0.4）μm×（1~2）μm，无运动性、无芽孢。在不良的环境条件下，细胞会伸长变成线形、棒形或管状膨大。平板培养时菌落隆起，表面平滑，菌落呈灰白色，液体培养时则形成菌膜。该菌生长的适宜温度为28~30℃，生成醋酸的最适宜的温度为28~33℃，最适PH3.5~6.0，耐受酒精浓度为8%（体积分数）。最高产醋酸为7~9%，产葡萄糖酸力弱。能氧化分解醋酸为二氧化碳和水。

沪酿1.01醋酸菌 它是从丹东速酿醋中分离得到的，是我国食醋工厂常用的菌种之一。该菌细胞呈杆形，常呈链状排列，菌体无运动性，不形成芽孢。在含酒精的培养液中，常在表面生长，形成淡青灰色薄层菌膜。在不良的条件下，细胞会伸长，变成线状或棒状，有的呈膨大状、分支状。该菌由酒精生成醋酸的转化率平均高达93~95%。

② 醋酸菌的培养及保藏

a 斜面试管培养基

下面是斜面试管培养基两例：

酒精(6%) 100ml 葡萄糖 0.3g 酵母膏 1g CaCO3 1.5g 琼脂 2.5g；

葡萄糖1g 酒精2ml 碳酸钙（CaCO3）1.5g 酵母膏1g 琼脂2.5g 水100ml。

PH值自然（各种成分先加热溶解后再将酒精加热）。

b 醋酸菌培养与保藏

斜面接种醋酸菌后置于30~32℃恒温箱内培养48h。醋酸菌因为没有孢子，所以容易被自己所产生的酸杀死。在醋酸菌中，特别能产生香酯的菌种每过十几天即死亡，因此宜保藏在0~4℃冰箱内备用。由于培养基中已加入碳酸钙，以中和产生的酸，所以保藏时间长一些。

1.1.3 固态法食醋生产

醋酸菌在充分供给氧的情况下生长繁殖，并把基质中的乙醇氧化为醋酸，这是一个生物氧化过程，其总反应式为：C2H5OH+O2=CH3COOH+H2O

1） 醋酸菌种制备工艺流程

斜面原种→斜面菌种(30~32℃，48h)→三角瓶液体菌种(一级种子30~32℃，振荡24h)→种子罐液体菌种(二级种子)→(30~32℃，通气培养22~24h)→醋酸菌种子

2） 工艺流程

麸曲、酵母

↓

薯干(或碎米、高粱等)→粉碎→加麸皮、谷糠混合→润水→蒸料→冷却→接种→入缸糖化发酵→拌糠接种→醋酸发酵→翻醅→加盐后熟→淋醋→贮存陈醋→配兑→灭菌→包装→成品

↑

醋酸菌

3） 生产工艺

① 原料配比及处理

甘薯或碎米、高粱等100kg，细谷糠80kg，麸皮120kg，水400kg，麸皮50kg，砻糠50kg，醋酸菌种子40kg，食盐3.75~7.5kg(夏多冬少)。

将薯干或碎米等粉碎，加麸皮和细谷糠拌合，加水润料后以常压蒸煮1h或在0.15MPa压力下蒸煮40min，出锅冷却至30~40℃。

② 发酵

原料冷却后，拌入麸曲和酒母，并适当补水，使醅料水分达60%~66%。入缸品温以24~28℃为宜，室温在25~28℃左右。入缸第二天后，品温升至38~40℃时，应进行第一次倒缸翻醅，然后盖严维持醅温30~34℃进行糖化和酒精发酵。入缸后5~7d酒精发酵基本结束，醅中可含酒精7%~8%，此时拌入砻糠和醋酸菌种子，同时倒缸翻醅，此后每天翻醅一次，温度维持37~39℃。约经12d醋酸发酵，醅温开始下降，醋酸含量达7.0%~7.5%时，醋酸发酵基本结束。此时应在醅料表面加食盐。一般每缸醋醅夏季加盐3kg，冬季加盐1.5kg。拌匀后再放两天，再经2d后醋醅成熟即可淋醋。

③淋醋

淋醋工艺采用三套循环法。先用二醋浸泡成熟醋醅20~24h，淋出来的是头醋，剩下的头渣用三醋浸泡，淋出来的是二醋，缸内的二渣再用清水浸泡，淋出三醋。如以头淋醋套头淋醋为老醋；二淋醋套二淋醋3次为双醋，较一般单淋醋质量为佳。

④ 陈酿及熏醋

陈酿是醋酸发酵后为改善食醋风味进行的储存、后熟过程。陈酿有两种方法，一种是醋醅陈酿，即将成熟醋醅压实盖严，封存数月后直接淋醋。或用此法贮存醋醅，待销售旺季淋醋出厂。另一种是醋液陈酿，即在醋醅成熟后就淋醋，然后将醋液贮入缸或罐中，封存1~2个月，可得到香味醇厚、色泽鲜艳的陈醋。有时为了提高产品质量，改善风味，则将部分醋醅用文火加热至70~80℃，24h后再淋醋，此过程称熏醋。

⑤ 配兑和灭菌

陈酿醋或新淋出的头醋都还是半成品，头醋进入澄清池沉淀，调整其浓度、成分、使其符合质量标准。除现销产品及高档醋外，一般要加入0.1%苯甲酸钠防腐剂后进行包装。陈醋或新淋的醋液应于85~90℃维持50min杀菌，但灭菌后应迅速降温后方可出厂。一般一级食醋的含酸量5.0%，二级食醋含酸量3.5%。

1.1.4 酶法液化通风回流制醋

1） 酶法液化通风回流制醋特点

酶法液化通风回流新工艺，是利用自然通风和醋汁回流代替倒醅的制醋新工艺。本法的特点是：α-淀粉酶制剂将原料进行淀粉液化后再加麸曲糖化，提高了原料的利用率；采用液态酒精发酵、固态醋酸发酵的发酵工艺；醋酸发酵池近底处设假底的池壁上开设通风洞，让空气自然进入，利用固态醋醅的疏松度使醋酸菌得到足够的氧，全部醋醅都能均匀发酵；利用假底下积存的温度较低的醋汁，定时回流喷淋在醋醅上，以降低醋温度醅调节发酵温度，保证发酵在适当的温度下进行。

2） 工艺流程

(细菌a-淀粉酶、氯化钙、碳酸钠)

水 ↓ 麸曲 （松醅、回流）

↓ ↓ ↓ ↓ ↓

碎米→浸泡→磨浆→调浆→加热→液化→糖化→冷却→液态酒精发酵→酒液→拌和入池→固态醋酸发酵→加盐→淋醋→加热灭菌→装坛→成品。 ↑ ↑

↑ 酒母 （麸皮 砻糠 醋酸菌种子）

食盐

3） 生产工艺

① 配料

碎米1200kg、麸皮1400kg、砻糠1650kg、碳酸钠1.2kg、氯化钙2.4kg、a-淀粉酶以每克碎米130酶活力单位计3.9kg，麸曲60kg、酒母500kg、醋酸菌种子200kg、食盐100kg、水3250kg(配发酵醪用)。

② 水磨与调浆

将碎米浸泡使米粒充分膨胀，将米与水1:1.5的比例送入磨粉机，磨成70目以上的细度粉浆。使粉浆浓度在20%~23%，用碳酸钠调至pH值6.2~6.4，加入氯化钙和α-淀粉酶后，送入糖化锅。

③ 液化和糖化

粉浆在液化锅内应搅拌加热，在85~92℃下维持10~15min，用碘液检测显棕黄色表示已达到液化终点，再升温至100℃维持l0min，达到灭菌和使酶失活的目的，然后送入糖化锅。将液化醪冷至60~65℃时加入麸曲，保温糖化35min，待糖液降温至30℃左右，送入酒精发酵容器。

④ 酒精发酵

将糖液加水稀释至7.5~8.0′Bx，调pH值至4.2~4.4接入酒母，在30~33℃下进行酒精发酵70h，得出约含酒精8.5%的酒醪，酸度在0.3~0.4左右。然后将酒醪送至醋酸发酵池。

⑤ 醋酸发酵

将酒醪与砻糠、麸皮及醋酸菌种拌合，送入有假底的发酵池，扒平盖严。进池品温35~38℃为宜，而中层醋醅温度较低，入池24h进行一次松醅，将上面和中间的醋陪尽可能疏松均匀，使温度一致。

当品温升至40℃时进行醋汁回流，即从假底放出部分醋液，再泼回醋醅表面，一般每天回流6次，发酵期间共回流120~130次，使醅温降低。醋酸发酵温度，前期可控制在42~44℃，后期控制在36~38℃。经20~25d醋酸发酵，醋汁含酸达6.5%~7.0%时，发酵基本结束。醋酸发酵结束，为避免醋酸被氧化成二氧化碳和水，应及时加入食盐以抑制醋酸菌的氧化作用。方法是将食盐置于醋醅的面层，用醋汁回流溶解食盐使其渗入到醋醅中。淋醋仍在醋酸发酵池内进行。再用二醋淋浇醋醅，池底继续收集醋汁，当收集到的醋汁含酸量降到5%时，停止淋醋。此前收集到的为头醋。然后在上面浇三醋，由池底收集二醋，最后上面加水，下面收集三醋。二醋和三醋共淋醋循环使用。

⑥ 灭菌与配兑

灭菌是通过加热的方法把陈醋或新淋醋中的微生物杀死；破坏残存的酶；使醋的成分基本固定下来。同时经过加热处理，醋的香气更浓，味道更和润。

灭菌后的食醋应迅速冷却，并按照质量标准配兑。

1.1.5 液体深层发酵制醋

液体深层发酵制醋是利用发酵罐通过液体深层发酵生产食醋的方法，通常是将淀粉质原料经液化、糖化后先制成酒醪或酒液，然后在发酵罐里完成醋酸发酵。液体深层发酵法制醋具有机械化程度高、操作卫生条件好、原料利用率高（可达65-70%）、生产周期短、产品的质量稳定等优点。缺点是醋的风味较差。

1） 工艺流程

麸曲 酒母 醋酸菌

↓ ↓ ↓

碎米→浸泡→磨浆→调浆→液化→糖化→酒精发酵→酒醪→醋酸发酵→醋醪→压滤→配兑→灭菌→陈醋→成品

2） 生产工艺

在液体深层发酵制醋过程中，到酒精发酵为止的工艺均与酶法液化通风回流制醋相同，不同的是从醋酸发酵开始，采用较大的发酵罐进行液体深层发酵，并需通气搅拌，醋酸菌种子为液态，即醋母。

醋酸液体深层发酵温度为32~35℃，通风量前期为1:0.13/min；中期为1:0.17/min；后期为1:0.13/min。罐压维持0.03MPa。连续进行搅拌。醋酸发酵周期为65~72h。经测定已无酒精，残糖极少，测定酸度不再增加说明醋酸发酵结束。

液体深层发酵制醋也可采用半连续法，即当醋酸发酵成熟时，取出三分之一成熟醪，再加三分之一酒醪继续发酵，如此每20~22h重复一次。目前生产上多采用此法。

A、乙醇和乙酸属于有机物，并且这些细菌生长在乙醇或乙酸作为唯一碳源的培养基中，说明它们不能自己合成有机物，属于异养型生物，A正确；

B、表格中看出，在碳源的浓度的条件下，细胞膜转运乙酸的转运速率快，B错误；

C、自由扩散方式运输物质时，物质运输的速率与细胞外浓度成正比，而表中乙酸的不成正比，说明可能是协助扩散或主动运输的方式，协助扩散和主动运输均需要载体的协助，C正确；

D、表格中乙醇的运输速率与碳源的浓度成正比，属于自由扩散，D正确．

故选：B．

多种微生物（如酵母菌，根霉，曲霉，某些细菌）能通过称为乙醇发酵的过程，将糖转变成乙醇和co2。乙醇发酵也分为同型乙醇发酵和异型乙醇发酵两类。

同型乙醇发酵:

酿酒酵母能够通过emp途径进行同型酒精发酵，即由emp途径代谢产生的丙酮酸经过脱羧放出co2，同时生成乙醛，乙醛接受糖酵解过程中释放的nadh+h+被还原成乙醇。这是一个低效的产能过程，大量能量仍然贮存于乙醇中，其总反应为：

葡萄糖

＋

2adp

+

2pi

-----

2乙醇

+

2

co2

+

2atp

运动发酵单胞菌能通过ed途径进行同型乙醇发酵，但只产生1个atp。

葡萄糖

＋

adp

+

pi

-----

2乙醇

+

2

co2

+atp

缺乏完整emp途径的少数细菌（假单胞菌，根瘤菌，农杆菌，粪肠球菌）利用ed途径替代emp途径产能。

异型乙醇发酵：

一些细菌能够通过hmp途径进行异型乳酸发酵产生乳酸、乙醇和co2等，我们也可以称其为异型乙醇发酵，例如串珠菌进行的异型乙醇发酵总反应式为：

葡萄糖

＋

adp

+

pi

-----

乳酸

+

乙醇

+

co2

+

atp

当今,石油、煤等化石能源正以很快的速度被消耗,估计在儿十年内将被耗尽.因此乙醇、甲烷、氢气等代替能源成为人们关注的重点.

国外的研究状况

传统的酒精生产采用酵母间歇式发酵,而酵母不能耐受高浓度乙醇,因此有必要寻找一种耐受高浓度乙醇的新菌种.运动发酵单胞菌被认为是较好的候选品种.它是由I_indne于1928年从墨西哥Pulgue酒中首先分离得到.它属于革兰氏阴性兼性厌氧杆菌,弧菌科,发酵单胞菌属.经过实验室及中试规模的发酵动力学比较研究,人们公认利用运动发酵单胞菌制酒精与酵母相比有以下一些优点1)糖的吸收速度要比酵母高l - 2倍.(2)酒精得率比酵母高.(3)生长过程完全不要氧气.(4)比酵母容易进行遗传工程处理,以获得耐高温、耐酒精和能利用多种碳源的优良工程菌.缺点是:现有菌株所能发酵底物局限于葡萄糖、果糖、蔗糖.

国外的研究分以下几方面:（1）菌种的改良.(2)工艺的研究.间隙式发酵、连续式发酵、混合发酵等.(3)底物的研究.木薯、小麦、玉米、西米、大米等.(4)工艺控制研究.如底物浓度、pH,氮源、温度等参数.

研究重点及研究方法：

当前发酵法制乙醇研究工作的重点是筛选优良的菌种,选择低成本的发酵底物和最适的发酵控制条件.通过诱变或基因工程选育优良菌株.把其它生物细胞的基因转移进运动发酵单胞菌.把运动发酵单胞菌的基因转移进其它生物细胞.间隙式发酵、连续式发酵、混合发酵等.

酵母菌的一般特性

子囊菌纲酵母属；单细胞微生物；圆形、椭圆形、细长或柠檬形；饱满、细胞壁薄、细胞质均一、透明无色为活性强的细胞；衰老和不良条件下的细胞壁厚、细胞质呈颗粒状.

酵母的特性：产酒精能力、产酒精效率、抗SO2能力.

酵母菌的生长周期

经典的微生物生长曲线:缓慢,对数,稳定,衰亡

繁殖阶段：2－5天,达107个/mL,很少超过2(5)×108

平衡阶段：持续8天左右,动态平衡

衰减阶段：持续几周,活细胞降至105

(1)温度.液态酵母的活动最适温度为20～30℃,当温度达到20℃时,酵母菌的繁殖速度加快,在30℃时达到最大值,而当温度继续升高达到35℃时,其繁殖速度迅速下降,酵母菌呈疲劳状态,酒精发酵有停止的危险.只要保持l～1.5h 40～45℃或保持10～15min60～65℃的温度就可杀死酵母菌.但干态酵母抗高温的能力很强,可忍受5min 115～120℃的高温.

①发酵速度与温度：在20～30℃的温度范围内,每升高l℃,发酵速度就可提高10％.因此,发酵速度(即糖的转化)随着温度的升高而加快.但是,发酵速度越快,停止发酵越早,因为在这种情况下,酵母菌的疲劳现象出现较早.

②发酵温度与产酒精效率：在一定范围内,温度越高,酵母菌的发酵速度越快,产酒精效率越低,而生成的酒度就越低.因此,如果要获得高酒度的葡萄酒,必须将发酵温度控制在足够低的水平；当温度＜35时,温度越高,开始发酵越快；温度越低,糖分转化越完全,生成的酒度越高.

③发酵临界温度：当发酵温度达到一定值时,酵母菌不再繁殖,并且死亡,这一温度就称为发酵临界温度.如果超过临界温度,发酵速度就迅速下降,并引起发酵停止.由于发酵临界温度受许多因素如通风、基质的含糖量、酵母菌的种类及其营养条件等的影响,所以很难将某一特定的温度确定为发酵临界温度.在实践中常用“危险温区”这一概念来警示温度的控制,在一般情况下,发酵危险温区为32～35℃.

对于红葡萄酒,发酵最佳温度为25～30℃,而对于白葡萄酒和桃红葡萄酒,发酵的最佳温度为18～20℃左右.

(2)通风.酵母菌繁殖需要氧,在完全的无氧条件,酵母菌只能繁殖几代,然后就停止.这时,只要给予少量的空气,它们又能出芽繁殖.如果缺氧时间过长,多数酵母菌就会死亡.

在进行酒精发酵以前,对葡萄的处理(破碎、除梗、泵送以及对白葡萄汁的澄清等)保证了部分氧的溶解.在发酵过程中,氧越多,发酵就越快、越彻底.因此,在生产中常用倒罐的方式来保证酵母菌对氧的需要.

(3)酸度.酵母菌在个性或微酸性条件下,发酵能力最强,如在pH4.0的条件下,其发酵能力比在pH3.0时更强.在pH很低的条件下,酵母菌活动生成挥发酸或停止活动.可见,酸度高并不利于酵母菌的活动,但却能抑制其他微生物(如细菌)的繁殖.

乙醇的七种制备方法如下。

一、制备方法

1、发酵法

糖质原料（如糖蜜、亚硫酸废液等）和淀粉原料（如甘薯、玉米、高梁等）发酵。

发酵法的原料可以是含淀粉的农产品，如谷类、薯类或野生植物果实等；也可用制糖厂的废糖蜜；或者用含纤维素的木屑、植物茎秆等。这些物质经一定的预处理后，经水解（用废蜜糖作原料不经这一步）、发酵，即可制得乙醇。

2、乙烯水化法

乙烯直接水化法，就是在加热、加压和有催化剂存在的条件下，是乙烯与水直接反应，生产乙醇：CH2═CH2 + H─OH→C2H5OH

此法中的原料—乙烯可大量取自石油裂解气，成本低，产量大，这样能节约大量粮食，因此发展很快。

3、煤化工

工业制乙醇还主要是通过乙烯氢化制得，而适合中国国情的技术就是利用煤化工技术，将煤转化为合成气，直接或者间接的合成乙醇。

4、联合生物加工

利用生物能源转化技术生产乙醇能缓解非再生化石能源日渐枯竭带来的能源压力。联合生物加工技术，一体化程度高，能有效降低生产成本，未来发展前景广阔。

5、合成法

以乙烯为原料生产乙醇。该法生产的乙醇中夹杂着异构高碳醇，对人有麻痹作用，不宜作食品、饮料、医药和香料等。

6、分批萃取精馏法

7、分子筛固定床吸附法（简称分子筛法）

分子筛是一种无色、无臭、无毒的新材料

二、乙醇

乙醇分子是由乙基和羟基两部分组成，可以看成是乙烷分子中的一个氢原子被羟基取代的产物，也可以看成是水分子中的一个氢原子被乙基取代的产物。乙醇分子中的碳氧键和氢氧键比较容易断裂。

无水乙醇指的是纯乙醇，里面不含有水或其他物质，一般在一些化学试验中用到。酒清一般是指含有一部分水，比如一般纯酒精指的是95%的酒精（里面有5%的水）医用酒精是75%的酒精，只有75%的洒精才有杀菌作用。浓度过高或过低都起不到杀菌作用。

酒精发酵基质是细胞质基质。酵母菌是真核细胞，酵母菌是理想的酒精发酵菌种，其产生酒精的场所是细胞质基质，在工业生产中可通过重离子束处理酵母菌获得有氧呼吸缺陷型酵母菌菌种来提高酿酒纯度。

不用除去曲霉。 曲霉的生长不影响品主发酵。

制曲一般多用于白酒和一些调味料(比如酱油)的生产,在这些生产工艺中都不需要除去曲霉.

乙醇发酵现在主要都是液体发酵,用淀粉酶来糖化,没有用曲霉的.

如果非要除去,因为曲霉是真菌,而发酵乙醇一般用的是酵母,是细菌,可以添加一些抑制真菌而不抑制细菌的,比如制霉菌素.