细胞培养基中添加巯基乙醇需要过滤吗

有影响 一定有影响 培养基的量高了，培养基溶液的的浓度就高，相对于细胞内部的浓度也会高，在细胞内外的压力差就大（外>内），一定量的大有利于细胞的吸收营养物质，大的过多就不利于细胞的生长，好比吃饭，填鸭似得吃，不能过多， 培养基的量。

凝胶过滤和Native-PAGE测定分子量时蛋白并不变性，说明活性状态下蛋白是200kD，SDS-PAGE时由于SDS的存在，蛋白都会变性，打开成为肽链。但SDS并不能打开二硫键，因为二硫键是共价键。所以在二硫键存在的情况下蛋白是100kD。当有beta-ME时，二硫键被还原成半胱氨酸，此时分子量是40kD和60kD。综上，说明这个复合物有两种蛋白组成，分别为40kD和60kD。这两种亚基各有两份，在不同种的亚基之间由二硫键链接。下图就是一种可能的情况。

可以的。

DTT和2-ME（2-mercaptoethanol的简称，下同）都属于巯基试剂。

也就是说DTT和2-ME的作用是一样的：可以防止蛋白质或酶等分子中的巯基氧化成二硫键，维持体系的还原性环境。

β-巯基乙醇和DTT都是还原剂，防止蛋白质被氧化，β-巯基乙醇常用浓度为5-20MMOL/L，DTT为0.5-1MMOL/L。因为β-巯基乙醇加入缓冲液后24小时易被氧化，其后加速蛋白质的失活，而DTT氧化后形成稳定的分子内二硫健，并不危及蛋白的巯基，所以在蛋白制备中常用β-巯基乙醇，而长期储存用DTT。还有其上提到的试剂浓度均指终浓度。

至于使用浓度，DTT和2-ME的工作浓度一般为1-5mM，如果2-ME的浓度是1mM，由于DTT的氧化能力强于2-ME，DTT的浓度用0.5-1mM就可以了。

原理:

分离要用的主要试剂是层析液。层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂。叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同：溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢。

层析分离叶绿体中的色素：将纸条画有滤液细线的一端置于烧杯中的层析液中，注意千万不要将滤液细线浸没在层析液中，否则会使色素溶解而导致试验失败。层析液是挥发性较强的有机溶剂，并且具有一定的毒性，所以在操作中要尽量用培养皿盖住烧杯口。

观察实验结果：最后滤纸条上将分离出四条色素带，颜色从上往下分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色，四种色素分别是胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。

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注意事项:

1.减去角:

为了尽量让层析液在滤纸上的扩散速度相等

2.加入二氧化硅:

为了研磨的充分，加碳酸钙是为了防止研磨时色素被破坏,加入丙烯来溶解色素。

3.加入酒精:

因为叶绿素溶于有机溶剂,所以要加酒精,就是用来溶解的啊!!

4.加入CaCo3:

为了保护叶绿素分子不受损伤.

叶绿素不稳定的,容易被活细胞里的有机酸破坏

(老师教我们记这点的时候说:你们给我记住了!!"盖世太保"("钙是太保")保护叶绿素啊..汗汗...

)

Principle:

Separation of the main reagent is to use liquid chromatography. Liquid chromatography is a kind of fat-soluble strong organic solvent. The chloroplasts pigment in liquid chromatography the solubility of different: high solubility with liquid chromatography in the filter paper spread fastLow solubility with liquid chromatography in the filter paper spread slowly.

Chromatography separation in the chloroplasts pigment: will note the picture has filtrate fine line end in beaker of chromatography liquid, pay attention to don't will filtrate fine wire submerged in liquid chromatography, or you will make pigment solution and lead to test failure. Liquid chromatography is volatile strong organic solvents, and has certain toxicity, so in the operation to try to use petri dish cover glass mouth.

To observe the experimental results: the article filter paper will separate the four pigment belt, color from up to down respectively is orange, yellow, turquoise and kelly, four kinds of pigment were carotene, lutein, chlorophyll a and chlorophyll b.

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Note:

1. Minus the Angle:

In order to try to get chromatography liquid in the filter paper on the diffusion velocity equal

2. Add silica:

In order to fully grinding, add calcium carbonate is to prevent the grinding pigment is destroyed, join propylene to dissolve the pigment.

3. Add alcohol:

Because the chlorophyll soluble in organic solvents, so want to add alcohol, is used to dissolve!!

4. Join CaCo3:

In order to protect the chlorophyll molecule is not damaged.

Chlorophyll is not stable, easy to live in the cells of organic acid damage

(the teacher taught us to remember this: you give me remember!! "gestapo" (" calcium is boyz ") to protect the chlorophyll ah.. sweat | | | sweat...)

番茄金色花叶病毒Tomato.golden.mosaic.virus（TGMV）。接种本氏烟.后15～20d采收系统发病叶，用病组织重量的2倍体积的pH7.0、0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液匀浆（内含0.75%亚硫酸钠、5mmol/L.Na-EDTA、1%2-巯基乙醇、0.325%抗坏血酸），加入匀浆液体积2.5%的Triton.X-100，在4℃下搅拌16h，经尼龙丝袜过滤，滤液低速离心，取上清液经40000r/min，离心2h，用pH7.0、0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（内含1mmol/L.Na-EDTA、0.05%2-巯基乙醇）悬浮沉淀，经20%蔗糖溶液（用pH7.0、0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液配制）40000r/min，离心2h，再用pH7.0、0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液悬浮沉淀（提纯的病毒在-20℃下储藏，其侵染性至少可保持2年）。病毒的进一步提纯是用10%～50%的蔗糖密度梯度20000r/min，离心16h，离心管中出现3层环状带，取最下面的带，经氯化铯等密度（起始密度为1.34g/ml）梯度，35000r/min，离心24h（Stein.et.al.，1983）。

随着社会经济的发展,生活水平的提高,人们的消费观念、健康观念发生了较大变化。消费者的自我保健意识日益增强,对保健食品的需求越来越高,这为保健食品产业的发展提供了一个重要的契机。我国的保健食品市场是一个存在巨大发展潜力的市场。但是保健食品行业存在着低水平竞争,重公告轻研发,行业信誉差等严重的问题。为了保证食品的安全，下面是我为大家整理的关于：保健食品标识规定。欢迎阅读!

保健食品标识规定

第一条　为了加强对保健食品标识和产品 说明书 的监督管理，根据《中华人民共和国食品卫生法》(以下简称《食品卫生法》和《保健食品管理办法》的有关要求，特制定本规定。

第二条　本规定适用于在国内销售的一切国产和进口保健食品。

第三条　本规定所用定义如下：

保健食品：系指表明具有特定保健功能的食品。即适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的食品。

功效成分：指保健食品中产生保健作用的组分。

食品标识：即通常所说的食品标签，包括食品包装上的文字、图形、符号以及说明物。借以显示或说明食品的特征、作用、保存条件与期限、食用人群与食用 方法 ，以及其他有关信息。

最小销售包装：指销售过程中，以最小交货单元交付给消费者的食品包装。

主要展示版面：指消费者选购商品时，在包装标签上最容易看到或展示面积最大的表面，一般的食品销售包装至少有一个表面可用作主要展示版面。

信息版面：是紧接“主要展示版面”右侧的包装表面。如果因包装设计原因，紧接“主要展示版面”右侧的“信息版面”不能满足标签标示的要求(如折叠的包装袋)时，则“信息版面”可选择右侧版面右侧的下一个版面。

保健食品专用名称：表明保健食品的主要原料、产品物理形态、主要加工工艺等食品属性的名称。

保健食品作用名称：在保健食品名称中，用于表明保健食品主要作用的名称部分。

保健作用声明 短语 ：以短语形式，对保健作用的简单介绍或描述。

第四条　保健食品标识与产品说明书的所有标识内容必须符合下列基本原则：

保健食品名称、保健作用、功效成分、适宜人群和保健食品批准文号必须与卫生部颁发的《保健食品批准证书》所载明的内容相一致。

应科学、通俗易懂，不得利用封建迷信进行保健食品宣传。

应与产品的质量要求相符，不得以误导性的文字、图形、符号描述或暗示某一保健食品或保健食品的某一性质与另一产品的相似或相同。

不得以虚假、夸张或欺骗性的文字、图形、符号描述或暗示保健食品的保健作用，也不得描述或暗示保健食品具有治疗疾病的功用。

第五条　保健食品标识与产品说明书的标示方式必须符合以下基本原则：

保健食品标识不得与包装容器分开、所附的产品说明书应置于产品外包装内。

各项标识内容应按本办法的规定标示于相应的版面内，当有一个“信息版面”不够时，可标于第二个“信息版面”。

保健食品标识和产品说明书的文字、图形、符号必须清晰、醒目、直观、易于辨认和识读。背景和底色应采用对比色。

保健食品标识和产品说明书的文字、图形、符号必须牢固、持久，不得在流通和食品过程中变得模糊甚至脱落。

必须以规范的汉字为主要文字，可以同时使用汉语拼音、少数民族文字或外文，但必须与汉字内容有直接的对应关系，并书写正确。所使用的汉语拼音或外国文字不得大于相应的汉字。

计量单位必须采用国家法定的计量单位。

第六条　保健食品标识与产品说明书必须标示本《办法》附件1所规定的各项内容，其标示方式必须符合本《办法》附件1所规定的相应要求。

第七条　凡保健食品标识和产品说明书的标示内容或标示方式不符合本《办法》者，依照《食品卫生法》第四十五、四十六条处罚。

第八条　本规定由卫生部负责解释。

第九条　本规定自颁布之日起实施。

保健食品功能学评价程序和检验方法

1.主题内容和适用范围

本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的统一程序和检验方法。

本程序和检验方法适用于评价食品的免疫调节、延缓衰老、改善记忆、促进生长发育、抗疲劳、减肥、耐缺氧、抗辐射、抗突变、抑制肿瘤、调节血脂、改善性功能等作用。

本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的人体试食试验规程。

2.进行食品保健作用评价的基本要求

2.1对受试物的要求

2.1.1提供受试物的物理、化学性质(包括化学结构、纯度、稳定性等)等有关资料。

2.1.2受试物必须是规格化的产品，即符合既定的生产工艺、配方及质量标准。

2.1.3提供受试物安全性毒理学评价的资料，受试物必须是已经过食品安全性毒理学评价确认为安全的物质。

2.2对实验动物的要求

2.2.1根据各种试验的具体要求，合理选择实验动物。常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系动物。

2.2.2 动物的性别不限，可根据试验需要进行选择。动物的数量的要求为小鼠每组至少10只(单一性别)，大鼠每组至少8只(单一性别)。动物的年龄可根据具体试验需要而定。

2.2.3 动物应达到二级实验动物的要求。

2.3 给受试物的剂量及时间

2.3.1 各种试验至少应设3个剂量组，1个对照组，必要时可设阳性对照组。剂量选择应合理，尽可能找出最低有效剂量。在3个剂量组中，其中一个剂量应相当于人推荐摄入量的5-10倍左右。

2.3.2 给受试物的时间应根据具体试验而定，原则上至少1个月。

3.试验项目、试验原则及结果判定

3.1 免疫调节作用

3.1.1 试验项目

3.1.1.1.1 脏器/体重比值

胸腺/体重比值

脾脏/体重比值

3.1.1.1.2 细胞免疫功能测定

小鼠脾淋巴细胞转化实验

迟发型变态反应

3.1.1.1.3 体液免疫功能测定

抗体生成细胞检测

血清溶血素测定

3.1.1.1.4 单核-巨噬细胞功能测定

小鼠碳廓清试验

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

3.1.1.1.5 N细胞活性测定

3.1.1.2 人体试食试验

3.1.1.2.1 细胞免疫功能测定

外周血淋巴细胞转化试验

3.1.1.2.2 体液免疫功能试验

单向免疫扩散法测定IgG、IgA、IgM

3.1.1.2.3 非特异性免疫功能测定

吞噬与杀菌试验

3.1.1.2.4 N细胞活性测定

3.1.2 试验原则

要求选择一组能够全面反映免疫系统各方面功能的试验，其中细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞功能三个方面至少各选择1种试验，在确保安全的前提下尽可能进行人体试食试验。

3.1.3 结果判定

在一组试验中，受试物对免疫系统某方面的试验具有增强作用而对其他试验无抑制作用，可以判定该受试物具有该方面的免疫调节效应对任何一项免疫试验具有抑制作用可判定该受试物具有免疫抑制效应。

在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及N细胞功能检测中，如有两个以上(含两个)功能检测结果阳性，即可判定该受试物具有免疫调节作用。

3.2 延缓衰老作用

3.2.1 试验项目

3.2.1.1 动物试验

3.2.1.1.1 生存试验

小鼠生存试验

大鼠生存试验

果蝇生存试验

3.2.1.1.2 过氧化脂质含量测定

血(或组织)中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定

组织中脂褐质含量测定

3.2.1.1.3 抗氧化酶活力测定

血(或组织)中超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

血(或组织)中谷胱甘肽过氧化物酶(GS-PX)活力测定

3.2.1.2 人体试食试验

血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定

血中超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

血中谷胱甘肽过氧化物酶(GS-PX)活力测定

3.2.2 试验原则

衰老机制比较复杂，迄今尚无一种公认的衰老机制学说，因而无单一、简便、实用的衰老指标可供应用，应采用尽可能多的试验方法，以保证试验结果的可信性。动物试验，除上述生存试验，过氧化脂质含量测定、抗氧化酶活力测定3个方面各选一项必做外，可能时应多选择一些指标(如脑、肝组织中单胺氧化酶(MAO-B)活力测定等)加以辅助。生存试验是最直观、最可靠的实验方法，果蝇具有生长周期短、繁殖快、 饲养 简便等优点，通常多选果蝇作生存试验，但果蝇种系分类地位与人较远，故必须辅助过氧化脂质含量测定及抗氧化酶活力测定才能判断是否具有延缓衰老作用。生化指标测定应选用老龄鼠，除设老龄对照外，最好同时增设少龄对照，以比较受试物抗氧化的程度，必要时可将动物试验与人体试食试验相结合综合评价。

3.2.3 结果判定

若大鼠或小鼠生存试验为阳性，即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。

若果蝇生存试验，过氧化脂质和抗氧化酶三项指标均为阳性，即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。

若过氧化脂质和抗氧化酶两项为阳性，可判定该受试物具有抗氧化作用，并提示可能具有延缓衰老作用。

3.3 改善记忆作用

3.3.1 动物试验

跳台试验

避暗试验

穿梭箱试验

水迷宫试验

3.3.1.2 人体试食试验

韦氏记忆量表

临订记忆量表

3.3.2 试验原则

3.3.2.1 试验应通过训练前、训练后及重测验前3种不同的给予受试物方法观察其对记忆全过程(记忆的获得、记忆巩固、记忆再现)的影响。

3.3.2.2 应采用一组(2个以上)行为学试验方法，以保证实验结果的可靠性。

3.3.2.3 人体试食试验为必做项目，并应在动物试验有效的前提下进行。

3.3.2.4 除上述试验项目外，还可以选用嗅觉厌恶试验、味觉厌恶试验、操作式条件反射试验，连续强化程序试验、比率程序试验、间隔程序试验。

3.3.3 结果判定

动物试验2项或2项以上的指标为阳性，且2次或2次以上的重复测试结果一致，可以认为该受试物具有改善该类动物记忆作用

若人体试食试验结果阳性，则可认为该受试物具有改善人体记忆作用。

3.4 促进生长发育作用

3.4.1 试验项目

3.4.1.1 胎仔情况 活胎数、?雄比例、死胎数、分娩胎仔总数。

3.4.1.2 体重及食物利用率 记录出生时及生后4、7、14、21、30、60d幼鼠的体重，计算断乳后幼鼠的食物利用率。

3.4.1.3 生理发育指标 记录耳廓分离、门齿萌出、开眼、长毛时间、阴道开放、睾丸下降时间。

3.4.1.4 神经反射指标 平面翻正、前肢抓力、悬崖回避、嗅觉定位、听觉警戒、负趋地性、回旋运动、视觉发育、空中翻正、 游泳 发育。

3.4.2 试验原则

3.4.2.1 给受试物的时间可根据具体情况选择在母鼠孕期或哺乳期至成年期。

3.4.2.2 在神经反射指标中应选择一组(5个以上)的行为学试验方法，以保证结果的可靠性。

3.4.3 结果判定

在胎仔情况、体重及食物利用率、生理发育、神经反射4类指标中有3类以上(含3类)指标为阳性，可认为受试物有促进生长发育的作用。

3.5 抗疲劳作用

3.5.1 试验项目

负重游泳试验

爬杆试验

血乳

血清尿素氮

肝/肌糖原测定

3.5.2 试验原则

运动试验与生化指标检测相结合。在进行游泳或爬杆试验前，动物应进行初筛。除以上生化指标外，还可检测血糖、乳酸胶氢、血红蛋白以及磷肌酸等指标。

3.5.3 结果判定

若1项以上(含1项)运动试验和2项以上(含2项)生化指标为阳性，即可以判断该受试物具有抗疲劳作用。

3.6 减肥作用

3.6.1 减肥原则

3.6.1.1 减除体现人多余的脂肪，不单纯以减轻体重为标准。

3.6.1.2 每日营养素的摄入量应基本保证机体正常生命活动的要求。

3.6.1.3 对机体健康无明显损害。

3.6.2 试验项目

3.6.2.1 动物试验

体重

体内脂肪重量(睾丸及肾周围脂肪垫)

3.6.2.2 人体试食试验

体重，体重指数，腰围，腹围，臀围

体内脂肪含量

3.6.3 试验原则

在进行减肥试验时，除以上指标必测外，还应进行机体营养状况检测，运动耐力测试以及与健康有关的 其它 指标的观察。人体试食试验为必做项目，动物试验与人体试食试验相结合，综合进行评价。

3.6.4 结果判定

在动物试验中，体重及体内脂肪垫2个指标均阳性，并且对机体健康无明显损害，即可初步判定该受试物具有减肥作用。

在人体试食试验中，体内脂肪量显著减少，且对机体健康无明显损害，可判定该受试物具有减肥作用。

3.7 耐缺氧作用

3.7.1 试验项目

小鼠常压耐缺氧实验

3.7.2 结果判定

耐缺氧实验阳性，说明该受试物具有耐缺氧作用。

3.8 抗辐射作用

3.8.1 试验项目

3.8.1.1 亚急性试验

30天存活率或平均存活时间

白细胞总数

3.8.1.2 亚慢性或慢性试验

小鼠睾丸染色体畸变试验

小鼠骨髓细胞微核试验

3.8.2 试验原则

较高剂量一次辐射，选择亚急性试验小剂量多次辐射，选择亚慢性或慢性试验。

3.8.3 结果判定

亚急性试验项目中2项结果为阳性，则可判定该受试物对较高剂量一次辐射有拮抗作用。

亚慢性或慢性试验中2项结果为阳性，则可判定该受试物对小剂量多次辐射有拮抗作用。

3.9 抗突变作用

3.9.1 试验项目

Ames试验或V79细胞基因突变试验

小鼠骨髓细胞微核试验

小鼠睾丸染色体畸变试验

3.9.2 试验原则

Ames试验与V79细胞基因突变试验任选一项，采用体内与体外试验相结合的原则。

3.9.3 结果判定

抗突变三项试验中有两项为阳性时，则可判定该受试物具有抗突变作用。

3.10 抑制肿瘤作用

3.10.1 试验项目

动物诱发性肿瘤试验

动物移植性肿瘤试验

免疫功能试验

N细胞活性测定

单核-巨噬细胞功能测定

3.10.2 试验原则

动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项中任选一项，同时必做2项免疫功能试验

3.10.3 结果判定

动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项试验中有一项为阳性，并且对免疫功能无抑作用，则可判定该受试物具有抑制肿瘤的作用。

3.11 调节血脂作用

3.11.1 试验项目

大鼠脂代谢紊乱模型法

人体试食试验

3.11.2 试验原则

尽可能动物试验和人体试食试验相结合，综合进行评价。

3.11.3 结果判定

大鼠脂代谢紊乱模型法：结果为阳性时，可初步判定该受试物具有调节血脂作用。

人体试食试验阳性，可判定该受试物对人体具有调节血脂作用。

3.12 改善性功能作用

3.12.1 试验项目

3.12.1.1 交配试验

大鼠交配试验

小鼠交配试验

3.12.1.2 勃起试验

3.12.2 试验原则

评价改善性功能作用，应主要观察是否增强性交功能及阴茎勃起功能。考虑到影响性功能的因素很多，而睾酮对性功能的维持具有重要意义，必要时可对血清睾酮水平进行测定。

3.12.3 结果判定

交配试验(大、小鼠交配试验任选一项)或勃起试验中有一项试验结果为阳性，即可判定该受试物具有改善性功能的作用。

3.13 人体试食试验规程

4.评价食品保健作用时要考虑的因素

4.1 人的可能摄入量除一般人群的摄入量外，还应考虑特殊的和敏感的人群(如 儿童 、孕妇及高摄入量人群)。

4.2 人体资料由于存在著动物与人之间的种属差异、在将动物试验结果外推到人时，应尽可能收集人群服用受试物的效应资料，若体外或体内动物试验未观察到或不易观察到食品的保健效应或观察到不同效应，而有关资料提示对人有保健作用时，在保证安全的前提下，应进行必要的人体试食试验。

4.3 在将本程序所列试验的阳性结果用于评价食品的保健作用时，应考虑结果的重复性和剂量反应关系，并由此找出其最小有作用剂量。

4.4 食品保健作用的检测及评价应由卫生部认定的保健食品功能学检验机构承担。

附加说明

本程序和检验方法由卫生部卫生监督司提出。

本程序和检验方法由卫生部食品卫生监督检验所《保健食品功能学评价程序和检验方法》起草小组负责起草。

本程序和检验方法由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。

进行未列入程序范围的保健食品功能学评价时，应由保健食品的研制生产者提出检验及评价方法，经保健食品功能学检验机构验证及卫生部食品卫生监督检验所组织专家评审，报卫生部批准后方可列入本程序。

本程序中无明确判定方法的人体试食试验结果，可由负责试验单位组织专家组(至少五人)，按本程序提出的原则要求共同予以评价，并提出判定结果。

免疫调节作用检验方法

动物试验

1.实验动物

选用小鼠。推荐使用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，6-8周龄，18-22g，雌雄均可，数量为单一性别每组至少10只。

2.给受试物的时间、剂量分组

经口给予受试物15-30d，设3个剂量组和1个对照组。3个剂量组中，其中1个剂量应相当于人推荐摄入量的10倍左右。

3.实验方法

3.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验

可任选下列方法之一

3.1.1 M法

3.1.1.1 原理

当淋巴细胞受ConA、PA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解　将M(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲月替(formazan)结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。

3.1.1.2 仪器和材料

RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、M、Hanks液、PBS缓冲液(p7.2-7.4)

200目筛网、24孔培养板，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、酶联免疫检测仪、超净工作台

3.1.1.3 实验步骤

完全培养液 RPMI1640 培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺(200mmol/L)，青霉素(100U/ml)，链霉素(100ug/L)及5×10-5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的Cl或1mol/L的NaO调p至7.0-7.2，即完全培养液。

ConA液 用双蒸水配制成100ug/ml的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(-20℃)保存。

无菌Hanks液 用前以3.5%的无菌NaCO3调p7.2-7.4。

M液 将5mgM溶于1ml p7.2的PBS中，现配现用。

酸性异丙醇溶液 96ml 异丙醇中加入4ml 1mo1/L的C1，临用前配制。

3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min (1000r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，调整细胞浓度为2×106个/ml。

3.1.1.3.3淋巴细胞增殖反应

将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加50ul ConA液(相当5ug/ml)，另一孔作为对照，置5%CO2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入M(5mg/ml)50u1/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装6孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入1ml比色杯中，在721分光光度计上比色测定，波长570nm。

3.1.1.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析进行数据统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值，即可判定该项试验结果阳性。

3.1.2 同位素掺入法

3.1.2.1 原理

淋巴细胞在有丝分裂原PA、ConA等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入3-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞和放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。

3.1.2.2 仪器和材料

RPMI-1640细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A (ConA)、Hanks液 、PBS缓冲液(p7.2-7.4)、3H-TdR、闪烁液[2.5-二苯基恶唑(PPO) 0.5g、1，4-双-(5-苯基恶唑基)-苯(POPOP)0.25g、二甲苯500ml混匀]

200目筛网，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。

3.1.2.3 实验步骤

3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，最后RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×105个/ml。

3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应：

将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA(5ug/ml)，另3个孔不加ConA作为对照。置5% CO2，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入3H-TdR 20u1，使其终浓度为(3.7-18.5)×104Bq/ml。用多头细胞取集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7ml闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。

3.1.2.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析进行数据统计。以每分钟脉冲数(cpm)表示增殖程度，用刺激指数(SI)来表示试验孔cpm 。

① 方法概要：在pH值＝10的氨性缓冲液中，用酸性铬蓝K

为指示剂，以乙二胺四乙酸二钠 （EDTA）标准溶液螯合滴定钙镁

离子合量，从中减去钙量即为镁离子含量。

② 试剂：5％酒石酸钾钠溶液，1＋2三乙醇胺水溶液，氯化

铵，试剂级萘酚绿B；氨水；试剂级酸性铬蓝K；巯基乙醇 （硫代

乙醇酸）；硝酸钾。

③ 准备工作

a.氨性缓冲溶液 （pH 值＝10）。称取67.5g氯化铵溶于

200mL水中，加入570mL浓氨水，用水稀释至1L。最好用酸度计

核对pH值。

b.酸性铬蓝K萘酚酞绿B混合指示剂。称取0.1g酸性铬蓝K和0.15g萘酚绿B置于研钵中，加10g干燥硝酸钾，研磨均匀；

贮于磨口瓶中。或直接使用市售的酸性铬蓝K萘酚绿B试纸。

c.0.01mol／LEDTA标准溶液。配制和标定见循环水中钙离

子的测定方法。

④ 试验步骤：吸取经中速滤纸过滤后的水样50mL置于

250mL锥形瓶中，加入10mL氨性缓冲溶液。

若水样中含有铁铝离子，可在加入氨性缓冲溶液前加入5％酒

石酸钾钠2mL，1＋2三乙醇胺2mL。若水样中含有锌，则在加入

缓冲溶液前，先加入抗坏血酸0.1g，巯基乙醇0.5mL，然后加1＋

2三乙醇胺2～3mL。