有用三氯乙酸沉淀分离蛋白的吗

正常沉淀蛋白用的是15％三氯乙酸溶液，样品与15％三氯乙酸溶液体积比、沉淀温度、沉淀时间、离心时间都会影响蛋白质含量的测定，最佳的试验参数是样品与15％三氯乙酸溶液的体积比1：3，沉淀温度35℃，沉淀时间10 min，离心时间30 min。

三氯乙酸沉淀蛋白质不可逆。

三氯乙酸在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐，作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀。

三氯乙酸用作化学试剂、蛋白质沉淀及色谱分析试剂；三磷酸腺苷、细胞色素丙和胎盘脂多糖提取剂和农药除草剂；是杀虫剂毒死蜱的中间体，也是医药中间体；是医药上的除疣剂和收敛剂。

三氯乙酸沉淀蛋白方法：

加1/4体积的 TCA+DOC于蛋白质组分（置1.5-ml聚丙烯微量离心管中），至TCA的终浓度为20%（w/v），震荡混合，冰上解育20~30 min。

微型离心机，室温离心15 min。沉淀物如可见，为粘稠的带黄褐色的胶状物。用一精细的巴氏吸管吸出上清。努力除去尽可能多的上清。如取100ul样品进行沉淀，沉淀物将是可见的。

加3倍体积原样品体积的丙酮（室温），样品在室温下静置约10min，使TCA+DOC溶于丙酮。

室温离心15min，其时，沉淀物的大小和物理特性类似于一点灰尘。约10ug或更多一点的蛋白质即可看见。有时，会得到白色的盐类（如KCl等）沉淀物。

用极精细的巴氏吸管移去上清。沉淀物置冰上干燥10 min(敞开1.5-ml离心管的盖)。干燥的沉淀物可长时间（>1 个月）地保存于-20℃。

一、原理

植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量无机氮化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。可加入三氯乙酸，使其最终浓度为5％，将蛋白质沉淀出来，分别测定总氮、蛋白氮或非蛋白氮；通常只测定总氮或蛋白氮。将植物材料与浓硫酸共热，硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧，并将有机物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解，在消化时通常加入多种催化剂，如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等。消化完成后，加入过量NaOH，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中，再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算，可得出含氮量。

蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量，（约在14％～18％，平均约含氮16％）所以，可用蛋白氮的量乘以6.25（100／16＝6.25），算出蛋白质的含量。若以总氮含量乘以6.25，就是样品的粗蛋白含量。试样中若含有硝态氮时，首先要使硝态氮还原为铵态氮，可加入水杨酸和硫代硫酸钠，使硝态氮与水杨酸在室温下作用生成硝基水杨酸，再用硫代硫酸钠粉使硝基水杨酸转化为铵盐。由于水杨酸与硫代硫酸钠会消耗一部分硫酸，所以消化时的硫酸用量要酌情增加。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：各种干燥、过筛（60～80目）的植物样品

（二）仪器设备：1. 消化管；2. 微量凯氏定氮蒸馏装置一套（图17）；3. 三角烧瓶；4.微量滴定管；5. 量筒；6. 容量瓶；7. 烧杯；8. 移液管等。

三、实验步骤

（一）样品提取分离：准确称取烘至恒重的样品0.1000g～0.5000g（依样品含氮量而定，含氮1～3mg宜），置10ml离心管中，加入5ml5％三氯乙酸，90℃水浴中浸提15min，不时搅拌，取出后用少量蒸馏水冲洗玻棒，待溶液冷却后，4000rpm离心15min，上清液弃去。并用5％三氯乙酸洗沉淀2～3次，离心，弃去上清液，最后用蒸馏水将沉淀无损地洗入铺有滤纸的漏斗上，去掉滤液后，将沉淀和滤纸在50℃下烘干，用于蛋白氮的测定。

（二）样品的消化：取4支消化管编号。1号管直接放入称好的材料用于测定总氮，2号管放入上述烘干的滤纸和沉淀，用于蛋白氮的测定，3号管放入同样滤纸一张、4号管不加任何样品作为空白对照，注意将样品放入消化管底部。向各消化管加浓硫酸5ml，混合催化剂0.3g～0.5g，将样品浸泡数h或放置过夜后，在管口盖一小漏斗，放在远红外消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低，以防止内容物上升至管口。泡沫多时，可从小漏斗加入2～3滴无水乙醇。到管口出现白色雾状物时，泡沫已不再产生；此时可逐渐升温，使内容物达到微沸。直到消化液变为清澈透明为止。消化过程中，若在消化管上部发现有黑色颗粒时，应小心地转动消化管，用消化液将它冲洗下来，以保证样品消化完全。消化过程约需2～3h。

（三）定容消化完毕待溶液冷却后，沿管壁仔细加入10ml左右无氨蒸馏水，以冲洗管壁，再将消化液小心转入100ml容量瓶中。以无氨水少量多次冲洗消化管，洗涤液并入容量瓶。冷却后用无氨水定容至刻度，混匀备用。

（四）蒸馏及滴定 以下几步进行：

1.仪器的洗涤：先经一般洗涤后，还要用水蒸气洗涤。可按下列方法进行蒸气洗涤。先在蒸气发生器中加入2／3体积的蒸馏水（事先加入几滴浓硫酸，使其酸化，加入甲基红指示剂，并加入少许沸石或毛细玻璃管以防止爆沸）。打开漏斗下的夹子，用电炉或酒精炉加热至沸腾，使水蒸气通入仪器的各个部分，以达到清洗的目的。在冷凝管下端放置一个三角瓶接收冷凝水。然后关紧漏斗下的夹子，继续用蒸气洗涤5min。冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，蒸馏瓶中的废液由于减压而倒吸进入收集器，打开收集器下端的活塞排除废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下端换放一个盛有硼酸－指示剂混合液的三角瓶，使冷凝管下口完全浸没在液面以下0.5cm处，蒸馏1～2min，观察三瓶内的溶液是否变色。如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去三角瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝管下口，关闭电炉，仪器即可供测定样品使用。

2.标准硫酸铵测定为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术，并检验实验的准确性，找出系统误差，常用已知浓度的标准硫酸铵测试三次。在三角瓶中加入20ml硼酸－指示剂混合液，将此三角瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸入溶液中。注意在加样前务必打开收集器活塞，以免三角瓶内液体倒吸。准确吸取2ml硫酸铵标准溶液，加到漏斗中。

四、结果计算

样品中总氮量（％）＝0.010×（V3—V0）×100×14/（W×1000×10）×100×氮的回收率

样品中蛋白氮含量（％）＝0.0100×（V1－V2－V0）×100×14/（W×5×1000）×100×氮的回收率

回收率（％）＝0.0100×（V－V0）×14/（2.0×0.6×100）×100

1、沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同。

2、所需盐类不同也有差异。

3、有机酸蛋白质也不同。

4、磺基水杨酸是化学物质，带有两分子结晶水，分子式是C7H6O6S2H2O。白色结晶或结晶性粉末，遇微量铁时即变粉红色结晶体，高温时分解为酚和水杨酸。能溶于乙醚，易溶于水和乙醇。

用作生化试剂、分析试剂及络合指示剂，比色分析测定高铁离子。测定钢铁原材料铁矿石、煤焦、石灰石。制造表面活性剂的中间体。有机催化剂。润滑脂添加剂。

2。三氯乙酸等（称为 生物碱试剂）一类试剂，通常情况下是跟蛋白质侧链上的氨基（—NH3^+）结合而沉淀蛋白。除过三氯乙酸外，还有类似的如苦味酸、过氯酸、水杨酸、鞣酸、钨酸等。一般加水使浓度稀释后 会有解离现象，是可逆的。这是因为生物碱试剂 属于有机试剂，跟氨基的亲和常数 不是很高。

1、直接称取10gTCA，溶解至100ml水中即可。

2、在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，即成100％三氯乙酸（TCA），再稀释到溶液体积的十倍即可。

扩展资料：

三氯乙酸的主要用途

用于有机合成和制医药、化学试剂、杀虫剂。

三氯乙酸在羊毛活性染料染色中的作用：

三氯乙酸加入到羊毛活性染料染色体对其上染百分率有较大提高，上染百分率达到95%以上，活性红B-3BF、活性红KN-5B、活性红KE-3B、活性红K-2BP的染色温度在90℃以上的染色效果更好。

随着时间的延长，普通活性染料染色羊毛效果不断提高，但染色保温时间不宜超过60min。

三氯乙酸作为羊毛染色助剂的最佳工艺为：在90℃条件下，三氯乙酸质量浓度2

g/L，染料用量2%(owf)，保温60

min条件下染色，染色后未经皂洗的羊毛其耐皂洗牢度不佳，在后处理工艺方面需要更进一步的改进。

参考资料来源：百度百科-三氯乙酸

发生盐析了, 蛋白质的分子颗粒直径在0.1—0.001μm, 属于胶体范围. 在蛋白质中加入无机盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）,会吸引大量水分子与这些无机盐离子水合,于是蛋白质表面暴露出来的疏水性区域增加,彼此靠著疏水性作用力结合,而从溶液中沉淀,这种作用便称为盐析.如：加浓（NH4）2SO4使蛋白质凝聚的过程；在乙酸的酯化反应中加入饱和碳酸钠溶液,降低乙酸乙酯溶解度,使其分层现象更明显的过程.

在电泳时使用TCA对蛋白质样品的浓缩或除盐时，对于分子质量大的蛋白质，要慎重选择TCA.对小分子量蛋白质的浓缩，采用TCA时也有两点需要注意:一是用TCA沉淀后，尽量用丙酮彻底抽提TCA二是样品处理后要尽快进行电泳分析，以免发生聚集及断裂，造成结果分析的不准确。

1、凯氏定氮法

准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化。

消化完毕后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。

利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并只加入硫酸钠不含血清的试管作对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，标准曲线上直接查出蛋白质含量。

3、酚试剂法

取6支试管标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量加入蒸馏水补足而保持一致，混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

5、考马斯亮蓝法

Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，出现沉淀，过滤除去。

每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。根据标准曲线计算待测样本的浓度。

参考资料来源：百度百科-蛋白质测定

参考资料来源：百度百科-考马斯亮蓝法