与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有什么特点

超滤膜的3项标准中，关于截留性能的测试，都采用标准HY/T050—1999的方法。在该标准中，规定用于超滤膜截留性能的测量的基准物质为以下几种：聚乙二醇(分子质量为6000、10000、20000u)；细胞色素C(分子质量为13000u)；卵清蛋白(分子质量为45000u)；牛血清蛋白(分子质量为67000u)。

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怎么选择色谱柱？首先确定我们需要检测什么样品。在根据样品选择使用的色谱柱，还有品牌型号，然后根据商家的推荐结合自己的样品来挑选。下面为大家介绍哈填充柱和毛细管柱

填充柱比毛细管柱具有更高的样品容量，虽然这一差距由于HP发明了大孔 530mm 毛细管而大大缩小。检测器灵敏度的改进也减少了对大剂量样品的需要。

填充柱可能具有优势的领域是气体样品的分析。

对于几乎所有的其他样品，毛细管柱具有高很多的效率（窄峰），这可以大大改进峰分离。实际上，分离能力很大，以至于许多分析物在很简单的分析中使用非常短的色谱柱就可以完成分离了。节省的时间可以直接转化为循环时间的缩短和样品通量的增加。

对于新的或更新的方法，如果没有非常具有说服力的理由使用填充柱的话，我们推荐使用毛细管柱。

1.色谱柱材料

这种材料必须尽可能是惰性的，尤其是对于痕量分析或容易拖尾的化合物，例如硫醇或类似的活性化合物。对于毛细管柱，熔融石英是可选的材料。

有两种类型的熔融石英毛细管柱：壁涂开管柱 (WCOT) 色谱柱和多孔层开管柱 (PLOT) 色谱柱。WCOT 色谱柱是固定相液膜涂渍在去活的色谱柱壁上。这是气相色谱中最常用的色谱柱。PLOT 色谱柱中固定相是固体物质涂渍到色谱柱壁上。

填充柱可以是玻璃或金属，通常是不锈钢的。金属虽然比较有活性，但其对非极性物质比较稳定。但是如果样品中有极性组分需要分析，请选择玻璃柱。如果玻璃柱还是活性强（引起峰拖尾、样品丢失等），请进行去活处理。

2.固定相

选择毛细管柱时，首先需要确定是否需要 PLOT 色谱柱。下面是 3 种 PLOT 色谱柱的典型应用领域：分子筛 不挥发气体，对水比较敏感二乙烯基苯 (DVB) — HP-PLOT Q C1 到 C3 全部异构体的分离，部分 C4 和更高的（直到 C14）的异构体分离，极性化合物，挥发性溶剂可以允许含水氧化铝 Al2O3 C1 到 C10 异构体的分离, 对水比较敏感.

如果上面提到的应用没有感兴趣的，则您可以选择一个 WCOT 类型色谱柱。

当面对一种未知样品时，首先尝试目前在GC上的色谱柱。如果不能获得满意的结果，请考虑所了解的样品信息。基本原理是分析物与具有相似化学性质的固定相间更容易相互作用。这意味着了解的样品信息越多，越容易找到最佳分离固定相。

3.最重要的步骤是确定分析物的极性特征：

§ 非极性分子 — 通常只包含碳氢原子没有偶极距。

§ 直链碳氢化合物（n-烷烃）是非极性化合物的例子。

§ 极性分子 — 主要包含碳氢，也包含氮、氧、磷、硫或卤原子。例如醇、胺、硫醇、酮、腈、有机卤化物等。

§ 可极化的分子 — 主要包含碳氢，也包含不饱和键。例如烯烃、炔烃和芳香族化合物。

成都摩尔科学仪器有限公司提供赛分科技针对特定分离需要提供正确的固定相：样品是具有相同化学类型的非极性物质的混合物吗？例如大多数石油馏分中的碳氢化合物？请尝试非极性色谱柱，如 HP-1，可以将它们按（近似）沸点顺序分离。如果怀疑有一些芳香族化合物，请尝试 HP-5 或 HP-35 等适用苯基化合物的色谱柱。极性或可极化化合物通常在含有苯基的更强极性和/或可极化基团的固定相上进行分离，其分离度会更好一些。例如 HP-210 或 HP-225 色谱柱。 如果需要更强的极性固定相，则可以选择聚乙二醇 (PEG) 固定相，通常称为 WAX 固定相。

请参见后面几页中的选择图表，这些图表根据应用和分析物的极性特征推荐固定相。

键合可以在固定相和色谱柱管间产生化学键。交联在适当位置聚合固定相以增加分子量。这两个过程是在制备键合/交联色谱柱过程中同时发生的，它可以增加热稳定性并减少色谱柱流失。可以冲洗键合/交联色谱柱以去除可能随时间积累的污染物并允许更大的进样量。如果可以选择，则我们建议在标准涂渍型色谱柱类型中选择键合/交联色谱柱。

4.膜厚

一般规律为薄液膜比厚液膜分离物质的速度快一些，并可以在相对较低温度下得到更高的分离度。这说明它适合于高沸点化合物、接近的化合物或热敏性化合物。“标准”膜厚为 0.25~0.5mm。这些厚度对在高达 300°C 温度下分离的大多数样品（包括石蜡、甘油三酸酯和类固醇）效果很好。对于需要在更高温度下分离的物质，可以使用薄液膜 (0.1mm) 色谱柱。

标准或薄液膜色谱柱用于分离高沸点物质，而厚液膜柱用于分离低沸点物质。1~1.5mm 的膜可以很好的分离沸点为 100~ 200°C 的物质。超厚液膜 (3~5mm) 用于气体、溶剂和吹扫物以提高它们和固定相的相互作用。

使用超厚液膜色谱柱的另一个原因是当更换大孔径色谱柱时，可以保持分离度和保留时间。由于这个原因，大孔径色谱柱都使用厚液膜。

厚液膜意味着色谱柱中有更多物质，因此会有更多的流失。随着膜厚度的增加，能达到的最高温度将降低。

5.柱长

一般而言，15m 色谱柱用于快速分离、简单混合物或大分子量化合物。对于大多数分析，30m 长的色谱柱是最常用的一种。很长的色谱柱（50、60 和 105m）用于非常复杂的样品。

柱长并不是色谱柱性能中一个很重要的参数。例如，柱长加倍，等温分析时间加倍，但峰分离度仅增加 40%。如果分析不是很理想，则有比柱长更有效的途径来改善它。可以选择薄一点的液膜、优化载气通过色谱柱的流速、使用温度程序等。

一种特殊情况是含有非常活性组分的样品分析。如果它们接触色谱柱材料，则它们拖尾会非常严重。相对短一些的色谱柱，使用厚膜可以减少接触的机会，这是由于接触色谱柱材料的时间相对少一些，并可以将分析物用固定相封闭与活化点的接触。

6.内径

增加内径意味着固定相增加，即使厚度不变，可以分析更大量的样品。它也意味着减小分离能力和更大的流失。

细柱用于复杂样品分离，但是通常要求分流进样，这是由于允许的样品量较小。如果可以允许减小分离度，则使用更粗的色谱柱可以避免这种情况。当样品量为主要因素时，比如气体、易挥发样品、吹扫和捕集或顶空进样，大内径或者甚至 PLOT 色谱柱更为合适。

同时也要考虑所使用仪器的限制和需要。一个适合的填充柱进样口可以使用大孔径毛细管柱，但不能用细柱。专门为毛细管柱设计的进样口通常适用于所有内径的色谱柱。GC/MS 和 MSD 直接联合可能要求细色谱柱，这是由于真空泵不能处理粗柱中的高流速。考察整个系统以查明哪些部分限制对色谱柱内径的选择。

下午好，做不到。首先PEG-4000的乙醇溶液不知道是多少含量的，低黏度低含量时一般的滤纸对溶解后的PEG是无截留能力，它随着乙醇一同轻松通过滤纸上的微孔（无论是快中慢的滤纸它们的孔径对于溶解成分子状态的PEG都是不起作用的）。你只想保留固溶物而去掉溶剂，这很简单，直接加热蒸发就可以了——固溶物一般都是不具挥发性的，PEG在120度以下时不会挥发或者分解，直接就可以将无水乙醇蒸馏掉了。无水甲醇和乙醇的沸点都很低，如果有减压蒸馏方法更快捷（抽真空也行），请酌情参考。

可以根据其特点选择适当的温度(0-4度）

选择材料及预处理

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

蛋白质的分离纯化

一，蛋白质（包括酶）的提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值

蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2、盐浓度

稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法

用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤

透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法

也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法

各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法

离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）

（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法

亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）

和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

浓缩、干燥及保存

一、样品的浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

1、减压加温蒸发浓缩

通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。

2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。

3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。

4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。

5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：

膜名称

分子量截留值

孔的大的平均直径

XM－300

300，000

140

XM－200

100，000

55

XM－50

50，000

30

PM－30

30，000

22

UM－20

20，000

18

PM－10

10，000

15

UM－2

1，000

12

UM05

500

10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

二、干燥

生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。

三、贮存

生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。

1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。

2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。

3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定

1)固定相(Stationary Phase Selectivity)

相似相溶原理，选用非极性的固定相分析非极性化合物

如果化合物可以用不同极性的固定相分析，首选最小极性的固定相

非极性的固定相使用寿命大于极性固定相

最通用的固定相是-1和-5.

对于偶极或氢键化合物，选用含腈基或聚乙二醇的固定相。

轻烃或永久气体，选用PLOT柱

应用范围最广的五种的固定相：-1，-5，-1701，-17，-Wax，能满足90%以上的分析应用。

(2)柱内径(mm)

0.2-0.25柱效高、负荷量低、流失小

0.3-0.35负荷量大于毛细口径柱60%，柱效低

0.53-0.6大口径毛细柱，负荷量近似填充柱，总柱效远远超过填充柱

增加直径意味着需要更多的固定相，即使厚度不增加，也有较大的样品容量。同时也意味着降低了分离能力且流失较大。小口径柱为复杂样品提供了所需的分离，但通常因为柱容量低需要分流进样。如果分离度的降低能够接受的话，大口径柱可以避免这一点。当样品容量是主要考虑因素时，如气体，强挥发性样品，吹扫和捕集或顶空进样，大孔径柱甚至PLOT柱可能比较适合。

同时要考虑仪器的限制和要求。一个装配了填充柱的进样口可以用大口径毛细管柱(0.53mm)但不能用小口径柱。专用于毛细管柱的进样口一般可以用于所有内径范围的毛细柱。直接联用的GC/MS和MSD需要小口径，因为真空泵不能处理大口径的大流量。确实查明你的整个系统看看适合哪些柱内径的选择。

(3)柱长(m)

短柱10-15米 分离少于10个组分的样品

中长柱20-30米 分离10-15个组分的样品

长柱50米以上 分离50个组分以上的样品

一般情况，15m柱用于快速筛选，简单混合物或分子量极高的化合物。30m柱是最普遍的柱长。超柱长(50，60或105m)用于非常复杂的样品。

柱长度是改变柱性能的一个重要参数，例如，加倍柱长，恒温分析时间则加倍，峰分辨率增加大约40%。

分析活性较强的组分是一种特殊情况，如果样品与柱材质接触，那么峰会严重拖尾。较厚的膜，相对短的柱子可以由于较少的柱材和较厚的固定液，掩盖并屏蔽活性表面从而减少相互作用的机会。

(4)液膜厚度(um)

薄液膜0.1-0.2um低负荷量、高沸点化合物

标准液膜0.25-0.33um一般标准毛细柱分析

厚液膜0.5-1um负荷量较大，低沸点样品

特厚液膜1-5um取代填充柱，分析沸点200℃以下复杂样品

一般来说，薄膜比厚膜洗脱组分快，峰分离好，温度低，这表明他们适用于高沸点化合物，组分密集化合物或热敏化合物。

标准膜厚对于流出达300℃的大多数样品来说分析很好。对于更高的洗脱温度，可以用0.1um的液膜。当标准或薄膜适用于高沸点化合物时，厚膜对于低沸点化合物有利。对于流出温度在100℃-200℃之间的物质，用1-1.5um的液膜效果更好。

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

气相色谱定量检测一般就两种，一个是外标法，一个是标法，对于没有标准物质的，就只能靠容面积归一法粗略定量。

通过对人类和环境有影响的各种物质的含量、排放量的检测，跟踪环境质量的变化，确定环境质量水平，为环境管理、污染治理等工作提供基础和保证。简单地说，了解环境水平，进行环境监测，是开展一切环境工作的前提。

扩展资料：

HPLC根据固定相和流动相的成分分为正相色谱和反向色谱。

正相色谱法

采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

2、聚乳酸/乙醇酸共聚物（PLGA）

2.1、聚乳酸/乙醇酸共聚物PLGA（DL-LA/GA:90/10、80/20、75/25、60/40、50/50）

外消旋聚乳酸/乙醇酸共聚物是无定型聚合物，玻璃化转变温度为45～55℃，粘度IV(dl/g)范围：0.10～1.5，分子量5000～30万。共聚物的性能变化范围宽，从硬质玻璃态到柔软、可成型材料；可用作医用手术防粘连膜，注射用微胶囊、微球及埋植剂等缓释制剂的辅料，同时可用作组织工程细胞培养的多孔支架，孔隙率、孔径和降解速率可调。

3、聚乳酸水凝胶

3.1、单甲基聚乙二醇/聚乳酸共聚物（MPEG-PLA、MPEG-PLGA）

单甲基聚乙二醇/聚乳酸共聚物是无定型聚合物，粘度IV(dl/g)范围：0.10～0.5，分子量5000～10万。共聚物比聚乳酸具有更大的亲水性，具有温敏水凝胶特性：一定浓度的水溶液在4℃完全水溶，在人体体温时迅速变为水凝胶，可通过低温下与药物或细胞混合后注射到人体，在人体温下快速形成凝胶，可用于缓释制剂以及组织工程细胞的培养支架。

4、聚乙二醇/聚乳酸共聚物(PLA-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLGA)

聚乙二醇/聚乳酸共聚物是无定型聚合物，粘度IV(dl/g)范围：0.10～0.5分子量：5000～10万。共聚物比聚乳酸具有更大的亲水性，可用于药物缓释载体和组织工程细胞培养支架。

5、端羧基聚乳酸(PLA-COOH、PLGA-COOH)

为无定型聚合物，粘度IV(dl/g)范围：0.10～9，分子量5000～70万。端羧基聚乳酸是在聚合时保留聚合物链末端的羧基，以便可以对聚合物进行进一步的改性反应。

这些高聚物一般很少用密度表示,因为他们成分很不稳定

原理：

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别。

被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据就可以以图谱形式打印出来，以便研究人员分析。

扩展资料：

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。

高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

HPLC使用的色谱柱是很细的(1~6 mm)，所用固定相的粒度也非常小（几μm到几十μm)，所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。

为了达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度。为此，须用高压泵进行高压输液。高压、高速是高效液相色谱的特点之一。HPLC使用的高压泵应满足下列条件：

a. 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1~10 mL/min)；

b. 能抗溶剂腐蚀；

c. 有较高的输液压力；对一般分离，60×10^5Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150~300×10^5Pa。

⑴往复式柱塞泵

当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。

反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。

⑵气动放大泵

其工作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积（ SA ）活塞A ，则在小面积（ SB ）活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50 : 1 ，则压力为 5 × Pa 的气体就可得到压力为 250×Pa 的输出液体。这是一种恒压泵。

参考资料：百度百科——高效液相色谱