thp-1细胞培养液加入二巯基乙醇的量过大会有什么副作用吗

主要用途： 用于合成树脂及用作杀霉菌剂、杀虫剂、增塑剂、水溶性还原剂等。

其它理化性质： 1.4996

健康危害： 吸入 、摄入或经皮肤吸收后会中毒。中毒表现有紫绀、呕吐、震颤、头痛、惊厥、昏迷，甚至死亡。对眼、皮肤有强烈刺激性。可引起角膜混浊。

环境危害： 对环境有危害，对水体可造成污染。

燃爆危险： 本品可燃，有毒。

危险特性： 遇高热、明火或与氧化剂接触, 有引起燃烧的危险。受高热分解放出有毒的气体。加入保护剂 防止某些生物活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏。如最常见的巯基，是许多活性物质和酶催化的活性基团，极易被氧化，故提取时常加入一些还原剂。一些易受重金属离子抑制生理活性的物质，加入某些金属螯合剂，把有害金属离子螯和掉，而保持被提取物的活性。 [螯合剂和巯基试剂] 巯基试剂在生化反应中有两个用途，一是防止蛋白质或酶等分子中的SH-基氧化成S-S，二是某些酶反应中维持体系的还原环境。经常应用的巯基试剂有二硫丁醇类化合物（如二硫苏糖醇DTT、二硫赤酰糖醇DTE）和2-巯基乙醇，谷胱甘肽也经常应用。一般来说二硫丁醇类是常选用的巯基试剂，不仅是因为挥发性低，难闻的气味较少，而且氧化电位低，比2-巯基乙醇浓度低很多的情况下，可以使其他二硫化合物完全还原。螯合剂用于控制反应中金属离子浓度或去除金属离子，常用的螯合剂有EDTA（乙二胺四乙酸）、EGTA、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸等。

RNA提取缓冲液（CTAB）：2%

CTAB（W/V），2%

聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100

mM

Tris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置），25mM

EDTA,

0.5g/L

亚精胺Spermidine，2.0M

NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC

处理的水配制即可。

SSTE：1

M

NaCl，0.5%

SDS（W/V），10

mM

Tris-HCl

pH8.0，1.0

mM

EDTA

10M

LiCl

直接用蒸馏水配10M

LiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌。

3M

NaAc

氯仿:异戊醇（24:1）

酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）

DEPC处理水

用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌

无水乙醇

70%酒精

1.

实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇）（10mL加80ul，50mL中加入300ul）。

2.取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50

mL离心管，按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀。

3.

65℃水浴3-10

min，期间混匀2-3次

4.

加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10,000

rpm，4℃，5

min）

5.

取上清，等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10,000

rpm，4℃，5

min）

6.

加入1/4V体积10M

LiCl溶液，4℃放置6hr以上(或过夜)

7.

10,000

rpm，4℃离心20

min

8.

弃上清，用500

ulSSTE溶解沉淀

9.

酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次,

氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10,000

rpm，4℃，5

min）

10.

加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30

min以上

11.

12,000

rpm，4℃离心20

min

12.

弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥

13.

加200

ul的DEPC处理水溶解

14.

用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

（在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数）

注意：提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。

1、凯氏定氮法

准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化。

消化完毕后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。

利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并只加入硫酸钠不含血清的试管作对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，标准曲线上直接查出蛋白质含量。

3、酚试剂法

取6支试管标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量加入蒸馏水补足而保持一致，混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

5、考马斯亮蓝法

Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，出现沉淀，过滤除去。

每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。根据标准曲线计算待测样本的浓度。

参考资料来源：百度百科-蛋白质测定

参考资料来源：百度百科-考马斯亮蓝法