核蛋白中的核酸是怎么去除的

1、根据所选蛋白的性质，选择合适的介质和条件，想办法把蛋白结合在柱子上，（有tag的话用这个方法最好了），然后用高盐（0.5-3M NaCl）洗，一般会洗下来一个峰，就是被洗下来的核酸了。

2、试试在高盐条件下加Mn2+，因为高盐可以让核酸和蛋白分离，而Mn2+对核酸沉淀有一定的效果。

但是要十分小心的是，这类蛋白本身的天然性质就是要结合核酸的，有的时候核酸去除干净了，蛋白也沉淀了，所以没那么容易，很多小条件要结合所选的蛋白自己去摸索。

第一个问题：核酸不溶于乙醇，所以可以使用乙醇对核酸进行漂洗，使残留的杂质溶解于乙醇，并最终通过离心去除。可总结为去除DNA中的残留杂质（对混杂的RNA无效）。如果你不用乙醇，会有很多杂质：盐、糖、蛋白等。

酚：使蛋白质变性溶解，抑制DNase的降解作用

氯仿：加速有机相与水相分层，去除核酸溶液中残余的酚

异戊醇：降低表面张力，减少气泡产生，使离心后的水相、变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定

第二个问题：rna水解后，加盐酸可以和RNA水解后的核糖反应，生产一种化合物，这种化合物在670nm处有最大吸收峰，其吸收值和浓度成正比。加盐酸的作用就是为了定量。

第三个问题：取rna上清液稀释，应该也是便于测定吧。详情可以咨询河南惠尔的狄老师

使用盐酸时，应配合个人防护装备。如橡胶手套或聚氯乙烯手套、护目镜、耐化学品的衣物和鞋子等，以降低直接接触盐酸所带来的危险。

密闭操作，注意通风。

操作尽可能机械化、自动化。操作人员必须经过专门培训，严格遵守操作规程操作人员佩戴自吸过滤式防毒面具（全面罩），穿橡胶耐酸碱服，戴橡胶耐酸碱手套。

远离易燃、可燃物。防止蒸气泄漏到工作场所空气中。避免与碱类、胺类、碱金属接触。搬运时要轻装轻卸，防止包装及容器损坏。配备泄漏应急处理设备。

了解并掌握地衣酚法测定RNA含量的基本原理和具体方法。

二、原理：

RNA含量测定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚orcinol）反应，在Fe 3+或Cu 2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20—250μg·ml-1范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此，测定PNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。

三、器材与试剂：

1．器材：

①分析天平。

②沸水浴锅。

③试管。

④吸量管。

⑤分光光度计 。

2．试剂

①RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成100微克/毫升的溶液。

②样品待测液：配成每毫升溶液含RNA干燥制品50—100微克。

③地衣酚试剂：先配0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实验前用此溶液作为溶剂配成0.1%地衣酚溶液。

四、操作步骤：

1．标准曲线的制作

取12支干净烘干试管，按下表编号及加入试剂。平等作两份。加毕置沸水浴加热25min，取出冷却，以零号管作对照，于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值，以RNA浓度为横坐标，光吸收为纵坐标作图，绘制标准曲线。

2．样品的测定

取两支试管，各加入2.0ml样品液，再加2.0ml地衣酚-Cu 2+试剂。如前述进行测定。

五、结果与讨论：

1．绘制出标准曲线

2．RNA含量的计算

根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量：

注意事项

（1）样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。

（2）本法特异性较差，凡属戊糖均有反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时，亦有干扰作用。如在试剂中加入适量CuCl2·2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。此外，利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不同，且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2min后，DNA在600nm呈现最大光吸收，而RNA则在反应15min后，在670nm下呈现最大光吸收

核酸的最大吸收波长是260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。

在波长260nm紫外线下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；寡核苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）可以估计核酸的纯度。纯DNA的比值为1.8，纯RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。样品中如混有RNA比值上升。

扩展资料

显示DNA的传统方法是富尔根（Feulgen）反应，切片先用稀盐酸处理，DNA经弱酸（1mol/L HCL）水解后，在60℃条件下使DNA分子中脱氧核糖与嘌呤之间的连接打开，脱氧核糖的一端释放出醛基，并在原位与Schiff试剂反应生成紫红色产物。

原理同PAS反应，使细胞核DNA显紫红色。在此过程中RNA不受影响，故染色具有DNA特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水解时间是成功的关键。水解过度或不足均降低染色强度。

核酸可分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。

核酸不但是一切生物细胞的基本成分，还对生物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重大生命现象起主宰作用。它在生物科学的地位，可用“没有核酸就没有生命”这句话来概括。

参考资料来源：百度百科-核酸

参考资料来源：百度百科-核酸显示法

参考资料来源：百度百科-OD260/280比值

（1）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。

用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。

（2）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。

（3）污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。

（二）已经污染，可以加入RNA酶的抑制剂

（1）RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物(mammalmammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。

（2）氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。

（3）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。

（三）提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，从而免受RNA酶的干扰。

而过氧化氢消毒技术当中，据大数据得知，采用全球领先干雾技术打造的欧菲姆OXY-30000消毒机，是行业专业消毒去除PCR核酸污染的佼佼领航者。OXY-30000精妙之处在于其专业的解决方案，避免了过氧化氢蒸汽的腐蚀性以及解决了扩散性问题。其特点为：1、灭菌效果好，生物指示剂挑战降低6lg对数值，能彻底杀灭环境中的MRSA、VRE、结核分枝杆菌、芽孢、病毒和多重耐药的革兰阴性菌（鲍曼不动杆菌）；2、活性氢氧基团能氧化DNA、RNA污染源及核酸酶等分子物质，而诺福过氧化氢杀孢子剂中的活性银离子，可以抑制DNA聚合酶等有害病菌的生长，从而更有效的防止外源DNA的干扰；

3、1.5小时完成灭菌，人员可进入。预防核酸实验室环境空气污染及核酸片气溶胶污染，及快速高效去除实验室核酸污染源；4、小于3微米干雾气体，扩散性优越，能扩散到每一个角落，空气中做布朗运动，消毒干雾无孔不入，专门对付小分子核酸污染源物质；

具备国际化的CNAS检测报告和消毒产品备案，可以提供完善的符合欧盟GMP要求的验证文件和报告。