叶绿素提取,无水乙醇加多了会怎样

下午好，三氯甲烷是PLA的良溶剂，无水乙醇是不良溶剂类似正己烷和石油醚一样会造成溶解度差异而絮凝析出，如果要抑止这种现象发生可以试试看添加一些具有物理胶束增溶的助溶剂比如1,2-丙二醇或者PEG来改善溶解度上限。因为乙醇分子本身是没有增溶能力的，你说添加后有时候又是清澈透明可能受室内环境温度影响较大，温度越高PLA的自增溶现象越强（析出后，胶体分子再次被饱和胶体增溶反复循环）。

乙醇在常温常压下是一种易燃、易挥发的无色透明液体，低毒性，纯液体不可直接饮用；具有特殊香味，并略带刺激；微甘，并伴有刺激的辛辣滋味。易燃，其蒸气能与空气形成爆炸性混合物，能与水以任意比互溶。能与氯仿、乙醚、甲醇、丙酮和其他多数有机溶剂混溶，相对密度（d15.56）0.816。

无水乙醇放多。

市售的无水乙醇一般只能达到99.5%纯度，在许多反应中需用纯度更高的无水乙醇，经常需自己制备。通常工业用的95.5%的乙醇不能直接用蒸馏法制取无水乙醇，因95.5%乙醇和4.5%的水形成恒沸点混合物。

要把水除去，第一步是加入氧化钙（生石灰）煮沸回流，使乙醇中的水与生石灰作用生成氢氧化钙，然后再将无水乙醇蒸出。这样得到无水乙醇，纯度最高约99.5%。纯度更高的无水乙醇可用金属镁或金属钠进行处理。

无水乙醇消防措施：

灭火剂：抗溶性泡沫、干粉、二氧化碳、砂土。

灭火方法：尽可能将容器从火场移至空旷处。喷水保持火场容器冷却，直至灭火结束。

危险特性：易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。与氧化剂接触发生化学反应或引起燃烧。在火场中，受热的容器有爆炸危险。其蒸气比空气重，能在较低处扩散到相当远的地方，遇火源会着火回燃。

以上内容参考  百度百科-无水乙醇

因为异丙醇沉淀的时候要加盐来提高RNA的沉淀效率，异丙醇会使以前几步溶液中的盐（比如trizon的水相中dao的）和沉淀时加入的醋酸铵一起沉淀下来，需要用酒精清洗两遍把这些盐溶解掉，否则可能会影响以后的反应。

前面提取的RNA经异丙醇沉淀后，总会含有一些未除去的蛋白和其它杂质分子，这些蛋白和杂质分子如果不除尽的话，就会直接影响所提取的RNA的纯度和稳定性。

为此，就需要用70%乙醇洗涤沉淀(因为在70%乙醇里RNA是不溶的，而一些蛋白和其它杂质分子却可溶)，并且最好是洗涤2次，然后高速离心后，倒去上清，即可得到较纯的RNA沉淀。用无水乙醇则达不到这个目的。

扩展资料：

RNA和DNA一样，也是由各种核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接构成的多核苷酸链，但与DNA有一系列差异。

在化学组成方面，RNA含核糖而不含脱氧核糖。含尿嘧啶而不含胸腺密啶。例外的是，每个tNA分子含有一个胸腺嘧啶，这是在RNA链合成后由尿嘧啶甲基化生的，此外，前面已提到，少数DNA含有少量核糖，但这些个别的例外并不能以此否定两类核酸组成上的差异。

RNA一级结构的概念虽与DNA相同.但其基本结构单位是核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸。此外，部分RNA5′端或3′端有特殊的核苷酸序列，而且RNA一级结构中没有DNA那样复杂的顺序组织。

参考资料来源：百度百科-核糖核酸

【发酵法】

将富含淀粉的农产品如谷类、薯类等或野生植物果实经水洗、粉碎后，进行加压蒸煮，使淀粉糊化，再加入适量的水，冷却至60℃左右加入淀粉酶，使淀粉依次水解为麦芽糖和葡萄糖。然后加入酶母菌进行发酵制得乙醇。

【水合法】

以乙烯和水为原料，通过加成反应制取。水合法分为间接水合法和直接水合法两种。间接水合法也称硫酸酯法，反应分两步进行。先把95～98%的硫酸和50～60%的乙烯按2:1（重量比）在塔式反应器吸收反应，60～80℃、0.78～1.96MPa条件下生成硫酸酯。第二步是将硫酸酯在水解塔中，于80～100℃、0.2～0.29MPa压力下水解而得乙醇，同时生成副产物乙醚。烯直接与水反应生成乙醇。直接水合法即一步法。由乙烯和水在磷酸催化剂存在下高温加压水合制得。本法流程简单、腐蚀性小，不需特殊钢材，副产乙醚量少，但要求乙烯纯度高，耗电量大。无论用发酵法或乙烯水合法，制得的乙醇通常都是乙醇和水的共沸物，即浓度为95%的工业乙醇。

纯化方法

市售的无水乙醇一般只能达到99.5%纯度，在许多反应中需用纯度更高的无水乙醇，经常需自己制备。通常工业用的95.5%的乙醇不能直接用蒸馏法制取无水乙醇，因95.5%乙醇和4.5%的水形成恒沸点混合物。要把水除去，第一步是加入氧化钙（生石灰）煮沸回流，使乙醇中的水与生石灰作用生成氢氧化钙，然后再将无水乙醇蒸出。这样得到无水乙醇，纯度最高约99.5%。纯度更高的无水乙醇可用金属镁或金属钠进行处理。

无色澄清液体。有灼烧味。易流动。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。能与水形成共沸混合物(含水4.43%)，共沸点78.15℃。相对密度(d204)0.789。熔点-114.1℃。沸点78.5℃。折光率(n20D)1.361。闭杯时闪点（在规定结构的容器中加热挥发出可燃气体与液面附近的空气混合，达到一定浓度时可被火星点燃时的温度）13℃。易燃。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）

这个可以自己找下资料

应该很好找的

可参考BIOG磁珠法

请自行准备：无水乙醇、异丙醇、1.5mL离心管，生理盐水。

↓

取出洗涤液，按70%比例加入无水乙醇，如6mL加入14 mL无水乙醇，12mL加入28 mL无水乙醇，混匀。

↓

取10-20mg左右的组织，用液氮研磨为粉末，转入1.5mL 离心管内，加入100 μL 生理盐水，振荡15秒 （或直接在100 μL 生理盐水中将组织匀浆为细胞悬液），加入200 μL 裂解液， 20 μL 复合消化液，充分混匀，56℃温育12分钟（如组织匀浆不充分，可适当延长消化时间至组织完全消化）。

↓

冷却到室温，加入300μL异丙醇，充分混匀，再加入20μL磁珠复合液（每次使用前须充分混匀），振荡混匀3min（注意不要颠倒混匀，以防磁珠粘附于管盖内壁），静置2min。

↓

将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附，开盖，彻底吸弃上清液（注意枪头不要接触磁珠）。

↓

加入800μL配制后的洗涤液，将离心管从磁力架上取下，充分振荡2min，确保磁珠完全分散。将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附，开盖，彻底吸弃上清液（注意枪头不要接触磁珠）。

↓

将离心管从磁力架上取下，开盖，干燥约3-5min，至无明显乙醇气味。

↓

加入50-100 μL洗脱液，振荡至磁珠充分散开，室温静置2min，再振荡混匀1min。

↓

将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，小心吸取上清液至一新的1.5mL离心管中，提取的核酸可直接用于下游实验，或-20℃保存备用。

双向电泳实验过程及相关溶液配置

A． 实验过程

一、 实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、 实验步骤：

1. 样品的溶解

取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。

2. Bradford法测蛋白含量

取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：

编号 蛋白量（ul） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595值

1 0 80 4 0

2 5 75 4 0.024

3 10 70 4 0.061

4 15 65 4 0.091

5 20 60 4 0.116

Bt4 2 78 4 0.079

Bt4 4 76 4

转Bt4 2 78 4 0.075

转Bt4 4 76 4

标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数据可知

相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得

OD值测量过程：

比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。

3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）

3.1 水化液的制备

称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。

在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul， 振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。

3.2 点样，上胶

分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开ImmobilineDryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。

3.3IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20oC）

S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)

S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)

S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)

S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)

S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共计44110vhs, 19.5小时

其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦

3.4 平衡

用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。

平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。

4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE

4.1 配胶(两根胶条所用剂量)

分离胶：（T=8%80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED

30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml

分离胶buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul

双蒸水 38.72ml

浓缩胶：（T=4.8% 10ml）

30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml

浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul

双蒸水 5.9ml

4.2 灌胶

将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。

4.3 转移

剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。

4.4 跑胶

浓缩胶13mA 分离胶20mA 共约5.5个小时

5. 银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水）

5.1固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超纯水定容至500ml

5.2敏化 30min 无水乙醇 150ml

Na2S2O3?5H2O1.5688g

无水乙酸钠 34g

先用水溶解Na2S2O3?5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml

5.3洗涤 5min×3次

5.4银染 20min AgNO3 1.25g 用超纯水定容至500ml

5.5洗涤 1min×2次

5.6显影 无水Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至500ml

甲醛(37%)0.1ml, 临时加

5.7终止 10min EDTA—Na2?2H2O7.3g用超纯水定容至500ml

5.8洗涤 5min×3次

注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。

B． 实验相关试剂配制

1． Bradford 工作液

95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷

85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶

考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效）

2． 裂解液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

DTT 60 mM

Tris—base 40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）

3. 水化液储液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

Tris—base 40 mM

4. 分离胶buffer (pH8.8) 250ml

SDS 0.4% 1g

Tris—HCl 1.5M 45.4275g

5. 浓缩胶buffer (pH6.8) 100ml

SDS 0.4% 0.4g

Tris—HCl 0.5M 6.07g

6. 凝胶储存液（30%的丙烯酰胺） 250ml

Acr 29.2% 73g

Bis 0.8% 2g

7. 电极缓冲液（跑一次要配制2500ml）

甘氨酸 43.2g 36g

Tris 9g 或 7.5g

SDS 3g 2.5g

超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml

8． 0.5M Tris —HCl pH 6.8储液

6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml，3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml

9． 平衡液储液

脲（即尿素） 36g

甘油 30% 30ml

SDS 1% 1g

0.5M Tris—HCl pH6.810ml 超纯水定容至100ml

10. 平衡液A（一根胶条）

DTT 20mg

平衡液储液 10ml

11．平衡液B（一根胶条）

碘乙酰氨 300mg

平衡液储液 10ml

0.05%溴酚兰 15ul (平衡液A、B均需临时配制)

12．0.5%琼脂糖10ml

琼脂糖 0.05g

电极缓冲液 10ml

溴酚兰 25ul

补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4OC备用。

C． 药品

CHAPS 兼性离子去垢剂 去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，

SDS 离子型去垢剂 提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出

尿素 离液剂 可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质

硫脲 离液剂 变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可

以大大增加蛋白质的溶解性

DTT 还原剂 断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度，由于它pKa在8左右，因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀

BSA Bradford中制作标准曲线用

无水乙醇 和磷酸一起，提供Bradford中的环境

磷酸 提供Bradford中的酸性环境

Tris 构成缓冲液的成分，可用于抗衡pH的变化

IPG buffer

覆盖液 即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。

丙烯酰胺（Acr） 以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂，

甲叉二丙烯酰胺 （Bis） 在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维网状结构

琼脂糖

溴酚兰 指示剂作用

碘乙酰氨（IAA） 平衡液B中使用，中和A液中的DTT

正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶

甘油 无机盐的良好溶剂，热稳定性好

Marker

考马斯亮兰G250（Bradford法用） 考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465~595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色 深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量

甘氨酸 与Tris构成缓冲系统

AgNO3

EDTA 金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程

从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作 一、材料

含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管（又称eppendorf管），离心管架。

二、设备

微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。

三、试剂

1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。

2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。

3、氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分装成小份（如1.5ml）保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。

5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。

6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。

7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1%SDS。

8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。

9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl（pH7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml

的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。

10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/LTris·Cl（pH8.0）和0.1mol/LTris·Cl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。

11、氯仿：按氯仿：异戊醇=24：1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积=1：1混合上述饱和酚与氯仿即

得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

12、TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。

13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），5%TritonX-100。

14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。

15、电泳所用试剂：⑴TBE缓冲液（5×）：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。⑵上样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。 一、细菌的培养和收集

将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基（含50μg/mlAmp）中，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基（含50μg/mlAmp）中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。

二、质粒DNA少量快速提取

质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

（一）、煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000转离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中，涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml），涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

[注意]1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。

（二）、碱法

1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。

6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。

7、将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。

8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70%乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。

9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。

10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。

[注意]1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。

（三）、Wizard少量DNA纯化系统

Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA，整个过程只需15分钟。提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液，50mlWizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml）和50支Wizard微型柱。

1、1-3ml过夜培养细胞液4℃下12000g离心1-2分钟。

2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl细胞悬浮液中，充分混合，并移入eppendorf管中。

3、加200μl细胞裂解液，颠倒离心管数次，直到溶液变清亮。

4、加200μl中和液，颠倒离心管数次。

5、4℃下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。

6、加1mlWizard少量DNA纯化树脂，颠倒离心管数次以充分混匀。

7、取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。

8、将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加入2ml柱洗液，并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。

9、取出微型柱置于eppendorf管中，离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。

10、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μlTE（或水）于微型柱中，静止1分钟后，4℃下12000g离心20秒。

11、丢弃微型柱，将eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。

[注意]树脂使用前应充分混匀，如有结晶，可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟。

三、质粒DNA的大量提取和纯化

在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA，为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

（一）、碱法

1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。

2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。

3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。

4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中，充分悬浮菌体细胞。

5、加入12ml新配制的溶液Ⅱ，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10分钟。6、加9ml用冰预冷的溶液Ⅲ，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀。

7、4℃下5000g离心15分钟。

8、取上清液，加入50mlRNA酶A（10mg/ml），37℃水浴20分钟。

9、加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。

10、取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。

11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000），冰上放置60分钟。

12、4℃下12000g离心15分钟，沉淀用数ml70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。

13、真空抽干沉淀，溶于500mlTE或水中。

[注意]1.提取过程中应尽量保持低温。2.加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后操作应混和，切忌剧烈振荡。3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理（80℃1小时），使DNA酶失活。

（二）、Wazard大量DNA纯化系统

碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速，只需要离心和真空抽干，这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA（200-20000bp）。该系统不需要酚和氯仿抽提，纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。该系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括：150ml细胞悬浮液，150ml细胞裂解液，150ml中和液，100mlWizard大量DNA纯化树脂，125mlWizard柱子洗脱溶液和10支Wizard带有存储离心管的柱子。

1、100-500ml细胞培养液置离心管中，22-25℃下5000g离心10分钟，所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。

2、加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合，可以反复倒置混合，但不能用涡旋振荡，细胞裂解完全时，溶液会变清，这一步需要20分钟。

3、加15ml中和溶液，立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。

4、14000g，22-25℃离心15分钟。

5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。

6、加0.5倍体积的异丙醇，混合均匀，14000g22-25℃下离心15分钟。

7、弃上清，悬浮DNA沉淀于2mlTE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。

8、加10mlWizard大量DNA纯化树脂溶液，并涡旋混合。

9、每一个样品，使用一支Wizard大量柱子，柱子的头插在真空器上（Promega产品，与此配套）。

10、将树脂/DNA混合液转入柱子中，真空抽取树脂/DNA混合液。

11、将树脂/DNA混合液抽干后，加13ml柱子洗脱溶液至离心管中，对管底部的树脂/DNA进行洗脱（柱子一边旋转一边加入洗脱液），并加入柱子中。

12、真空抽干所加入的洗脱。

13、再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干。

14、加入5ml80%乙醇漂洗柱中的树脂，柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管

中，2500rpm（1300g）离心5分钟。

15、取出柱子，真空抽干5分钟，再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm（1300g）离心5分钟。

16、在柱子中加入1.5ml65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE，1分钟后2500rpm（1300g）离心柱子/离心管5分钟。

17、取出柱子，离心管中溶液即为提取的质粒DNA，可以直接放在离心管中，盖上盖子，储存在4℃或-20℃备用。

[注意]1.在使用之前，系统所提供的柱子洗脱液按1：1加入125ml95%乙醇。2.纯化树脂必须混匀后再用.

（三）、Sephrose2B柱纯化质粒DNA

碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理，仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA制品时，则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose2B或Sepharose4B进行纯化，该方法具有快速，条件温和，重复性好，载体物质可以再利用等优点，因而已广泛用于质粒DNA纯化。

1、将Sepharose2B经含0.1%SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。

2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase2B柱上。

3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1%SDS的TE（pH8.0）贮液瓶。

4、以1ml流出液为1份进行收集。

5、对每一管测定其OD260值，以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。

6、合并所有含质粒的洗脱液，用等体积的酚/氯仿（1:1）抽提，4℃下12000g离心2分钟，将上层水相转入新管。

7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10分钟，然后4℃下12000g离心10分钟，弃去上清液。

8、沉淀加70%乙醇洗涤，4℃下12000g离心10分钟，弃去上清液。

9、沉淀真空抽干，重新溶于TE或无菌水中。

[注意]在装柱过程中，要防止柱床中出现断裂或气泡现象，要使界面保持平整。对新装成的柱，应用含0.1%SDS的TE平衡，以使柱内的凝胶均匀。