he染色的操作步骤

一、实验步骤：

（1）样品制备：对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS 洗涤3次。

（2）样品固定：95%乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。

（3）染核：苏木素染液染色2-3min，自来水洗涤。

（4）分色：镜下观察，若细胞核染色过深，用1%盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。

（5）染胞质：浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。

（6）吹干或自然晾干细胞 爬片后，中性树胶封片。

若细胞用4%多聚甲醛固定，则染色时间相应延长，苏木素染色12-15min，伊红5min即可。

二、注意事项：

1、染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

2、切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。

3、切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。

4、在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

5、切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

6、最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

扩展资料

一、细胞核染色原理：

苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外。

使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

二、细胞浆染色原理：

细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。

当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。

伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

参考资料来源：百度百科-he染色

1、1蜡，脱蜡二甲苯I、水，百分之百，百分之九十，百分之八十，百分之七十酒精各5分钟，自来水冲洗十五分钟。

2、苏木精染色5分钟根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。

3、百分之五乙酸分化1分钟，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜色变浅了一些，成为蓝色。

4、返蓝，返蓝液，实验室没有，也可不用。

5、伊红染色1分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。

6、脱水:，百分之七十、百分之八十、百分之九十、百分之百酒精各10秒，二甲苯1分钟，放在通风橱自然晾干再封片，约5分钟左右。

7、滴上中性树胶，封片，用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，压片后要将组织全部覆盖完避免中间有气泡。

he染色的操作步骤：

将石蜡切片置于烘箱中60℃烤1～2h；

石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水，

苏木素染10分钟，

流水冲洗，去余色，

0.7%盐酸乙醇分化数秒钟，

流水冲洗，切片变蓝约15分钟，

7.95%乙醇30秒钟，

8.酒精性伊红染30秒，

I 95%乙醇30秒钟，

II 95%乙醇30秒钟，

I 100%乙醇30秒钟，

II100%乙醇30秒钟，

石碳酸二甲苯30秒钟，（1： 4石碳酸1-二甲苯4）

I二甲苯30秒钟，

II二甲苯30秒钟，

中性树胶封片。

HE染色操作流程：

HE染色，即是苏木精-伊红染色法，是形态学最常用的染色方法，在质量较佳的HE染色切片上，各种组织或细胞的一般形态结特点都可以观察到。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

(1)二甲苯（Ⅰ） 15min

(2) 二甲苯（Ⅱ） 15 min

（3）二甲苯：无水乙醇=1:1 2min

(4)100%乙醇（Ⅰ） 5min

(5)100%乙醇（Ⅱ） 5 min

(6)80%乙醇 5min

(7)蒸馏水 5 min

(8)苏木精液染色 5 min

(9) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s

(10) 1%盐酸乙醇 1-3 s

(11) 稍水洗 10-30 s

(12)蒸馏水过洗 1-2 s

(13) 0.5%伊红液染色 1-3 min

(14) 蒸馏水稍洗 1-2 s

(15) 80%乙醇稍洗 1-2 s

(16) 95%乙醇（Ⅰ） 2-3 s

(17) 95%乙醇（Ⅱ） 3-5 s

(18) 无水乙醇 5-10 min

(19) 石炭酸二甲苯 5-10 min

(20) 二甲苯（Ⅰ） 2 min

(21) 二甲苯（Ⅱ） 2 min

(22) 二甲苯（Ⅲ） 2 min

(23) 中性树胶封固

A：0.5~1% 的伊红酒精溶液：

称取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：苏木素染液配方：(配制3000 ml，可按比列减少)

苏木精6 g

无水乙醇100 ml

硫酸铝钾150 g

蒸馏水2000 ml

碘酸钠1.2 g

冰醋酸 120 ml

甘油 900 ml

配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。

1、he染色对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性。组织切片苏木素染色、分化与反蓝：将水化后的组织样本的切片使用PBS溶液浸泡清洗，每次浸泡5min，总共清洗3次。之后用移液枪吸取已经预先配置好的苏木素染色液，每个组织切片滴加100ul，充分染色10min。

2、切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。he染色对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS 洗涤3次。

3、着色情况与组织或细胞的种类有关。切片在苏木素染液中停留过长；或切片太厚；或分化时间太短。这种情况首先镜下看看切片厚度(最佳厚度1-2层细胞核)，要么重新染色，要么重新制片。

一张优质的HE染色切片，绝非仅指染色而言，它包括很多方面，首先应重视“固定”环节，其次注意脱水、透明、组织浸蜡，包埋和切片等各个步骤。一张因固定、脱水等步骤有所缺陷的切片，染色是不可能鲜艳、透明、层次分明的。解决上述各细节问题的方法已在前面各章节中均提到过。

但在进行HE染色时还应注意以下问题：1．组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则无论进行那种染色都会发生困难。脱蜡时间要充分，若溶蜡剂使用过久应及时更换以免效率降低，若室温过低，可将溶蜡剂置于温箱中进行脱蜡。2．苏木素染液使用一段时间后表面易出现亮晶状飘浮物，这可能是液体表面的过氧化物，必须过滤除去，以防沉渣污染组织切片。苏木素液一般染过三、四百张切片后，着色力会减弱，着色不鲜艳，呈灰蓝色时应及时更换新液。3．染色的时间长短需依据：染剂对组织的染色作用，室温条件，切片厚薄，固定液的类别，染液的新旧而进行调节。所以在染色时必须使用显微镜观察染色程度以利掌握时间。4．分化十分重要。分化步骤的准确也是染色成败的关键，若分化失当则必然引起染色不匀或过淡，过深等现象，因此分化后一定要镜检，观察胞核是否清晰，胞浆呈淡白色。否则需再次分化，不然一旦复染后，组织会呈紫蓝色即“蓝盖红”现象。5．还原液不宜过浓，若碱性太强易使组织脱落故以淡为宜。6．伊红宜淡染，复染过深胞核会不清晰，影响镜检。7．若脱水，透明等步骤不够彻底，则组织表面会有一层雾状膜。若有这一现象，应立即更换纯酒精脱水，再次透明。在潮湿的季节里应注意酒精的浓度、若降低要及时更换。8．染色后的组织切片、要将组织四周的污染物痕迹擦掉，以免影响美观。9．封固剂要适量，滴加时应小心倾滴，盖玻片要轻轻放置，以免气泡产生影响镜检。盖玻片大小选择要合适，一般要大于组织块，以防封盖不全，盖玻片要放正，标签贴牢，编号清楚。从而保证切片的封藏和美观。10．染好的切片应妥为保存，更应避免日光照射，否则切片容易褪色。