苯酚-氯仿法提取DNA注意事项

酚－氯仿方法是提取核酸的经典方法，主要原理是利用核酸、蛋白等杂质在水相和有机相中溶解度不同而重新分配。

试剂盒原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质（一般是硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中。

酚氯仿方法经典、便宜，用的都是实验室常用试剂，提纯效率和纯度都很高，但缺点是费时费力，苯酚和氯仿还有一定毒性，我见过的实验室很少有用这种方法的。

试剂盒严格来说也分好多种，经典的是离心柱的，就是把硅胶膜固定在离心管中，类似于超滤膜，用离心力或者负压让液体通过硅胶膜，核酸就留在膜上。在经过洗涤、洗脱的步骤得到核酸。这种方法的优点是操作简单、时间短，现在也能达到很高的质量，价格也不贵。缺点是不易放大，需要多次离心。

试剂盒基本步骤是先使样本裂解，在特定溶液中通过离心流过硅胶膜，再经过几次洗涤，最后加上洗脱液，离心后核酸就溶解到洗脱液中。具体的你可以根据你自己的需要到网上查一下说明书，现在做试剂盒公司的很多，步骤大同小异。

试剂盒也不是一定很便宜，对一些难度高（病毒核酸、法医样本核酸）或者要求高（去内毒素）的用途也比较贵。还有一种磁珠法提取，不需要离心，易于放大，可以用于自动化操作。这种高端一点的产品基本上是外国公司垄断的。

国内也有一批人在做这种磁珠，希望能打破这种垄断。上海交大的古宏晨教授和他创立的上海奥润微纳就是这批人的代表。（有点打广告的嫌疑，看在码了这么多字的份上也可以理解哈）

使用苯酚抽提细胞

DNA

时，苯酚的作用是使蛋白质变性，同时抑制了

DNase

的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与

DNA

联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而

DNA

溶于水相。

氯仿的作用是克服酚的缺点加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。

(酚易溶于氯仿中)

用酚-氯仿抽提细胞基因组

DNA

时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么?因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡

产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含

DNA

的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

A.取1.5ml菌体培养物于灭菌Ep管,12000rpm离1min, 丢清夜,收集菌体.

B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr.

C.加入200ul5mol/L氯化钠溶液,混匀于13000rpm离15min.

D.取清液,用苯酚抽提2,氯仿抽提1.

E.加两倍体积水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0),-20度保存1,13000rpm离15min,弃清液,沉淀用70%乙醇洗2；置于室温干燥,溶于50ulTE溶液,置4oC保存备用.

2 蛋白酶/SDS制备

先用10ml含适抗素GBM夜培养Delftia sp.,第二4000rpm离10min收集菌体,用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2,菌体充悬浮5ml 1×TE缓冲液,先加入0.5ml 5mg/L蛋白酶、0.5ml 10% SDS,轻轻混匀50℃放置3h~5h,接着用等体积Tris饱苯酚抽提2,苯酚/氯仿/异戊醇抽提,氯仿抽提,乙醇沉淀DNA,用自移液器吸管絮状DNA沉淀块吸附Ep管,70%乙醇洗2,干燥溶于适1×TE或ddH2O.

3

1) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基,37℃摇床（300rpm）培养液.

2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管,室温8000rpm离5min,弃清,沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）（用ddH2O行).

3) 菌体裂加入6μl 50mg/ml溶菌酶,37℃作用2h.再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS 110μl,20mg/ml蛋白酶K 3μl,50℃作用3h或37℃夜.（菌液应透明粘稠液体）

4) 抽提：菌液均两1.5ml EP管,加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,室温放置5-10min.12000rpm离10min.抽提两.（清粘稠,吸取应,枪尖应剪）

5) 沉淀：加0.6倍体积异丙醇,混匀,室温放置10min.1 2000rpm离10min.

6)洗涤：沉淀用75%乙醇洗涤.

7) 抽（凉）干,溶于50μl ddH2O,取2-5μl电泳.作PCR模板用.

酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/l tris·ci抽提，怎么抽提

感觉提问主意不是很清晰