旋光性怎么分离dna和rna

1、纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）符合要求的纯度较高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。

2、纯RNA：OD260/OD280≈2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）。

符合要求的纯度较高的纯化RNA其OD260/OD280在1.7-2.0之间，低于此范围表明样品中有蛋白质或苯酚，如果比值能达到1.9-2.0，RNA的纯度就已经很高了。

理论上，纯的RNA情况下：OD260/OD280的值为2，纯的DNA情况下：OD260/OD280的值为1.8.

OD260反应的是溶液中核酸的浓度，D280反应的是溶液中蛋白质或者氨基酸的浓度。

样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会明显下降。对于纯的样品只要读出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA，或者40微克/ml 单链DNA（RNA），或者20微克/ml 寡核苷酸计算。

　 　OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，纯度已经很高了。

纯DNA：OD260/OD280≈1.8(>1.9，表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.7 <OD260/OD280<2.0（2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

Trizol可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，同时使RNA酶变性失活，保护RNA的完整性。Trizol的主要成分为异硫氰酸胍、酚和B-巯基乙醇，异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

提取中加入氯仿，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层，上层为水相，PH 5.1左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚与溶液的界面。加入异丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除杂质。

判断RNA 的质量主要有两个标准，一是完整性（是否被降解），二是纯度。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现28S、18S和5S rRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。

完整性的图片大致如下图所示：

RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm，所以 280nm常用来表示蛋白质吸光度；而260nm为DNA的吸光度。

理论上， 纯的RNA情况下：OD260/OD280的值为2，纯的DNA情况下：OD260/OD280的值为1.8.

OD260反映的是溶液中核酸的浓度，OD280反映的是溶液中蛋白质或者氨基酸的浓度。

样品中如果含有蛋白质及苯酚，A 260 /A 280 比值会明显下降。对于纯的样品只要读出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA，或者40微克/ml 单链DNA（RNA），或者20微克/ml 寡核苷酸计算。

OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，纯度已经很高了。

纯DNA：OD 260 /OD 280 ≈1.8(>1.9，表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.9 <OD 260 /OD 280 <2.0（2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

提取前需要准备：

75%的乙醇（提前于-20冰箱保存）、氯仿、RNAase-free water、1.5ml Eppendorf离心管、Tips（RNAase-free）。

需要特别注意的是 一定要带好手套和口罩，做好个人防护工作！！！并且也可以防止RNA降解

步骤：

（1） 培养细胞： 收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

（2） 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入0.8~1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。

（3）按200ul氯仿/ ml Trizol的量加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。注：剧烈震荡使基因组DNA断裂。

（4）4℃离心，12000rpm，15min。注：离心后分为三层，下层为红色的苯酚—氯仿层，中间层和上层的水样层，RNA存在于水样层中。若只提RNA，千万不要吸取中间层和下层酚—酚相，可保存于4℃冰箱。

（5）将上层水相转移至另一个EP管中，加入等体积的异丙醇并混匀(约500ul)，室温放置10min或者-20冰箱沉淀2h，也可以-20冰箱沉淀过夜。

（6）4℃离心，12000 rpm，10min，用枪头小心吸走液体，RNA沉于管底。

（7）用0.5ml 75%冰乙醇洗涤RNA沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

（8）4℃离心，8,000rpm，5min。重复两次。弃去乙醇后，室温干燥RNA沉淀5-10min。

（9）可用50ul H2O溶解RNA样品，55-60℃ 溶解5-10min，保存于-80℃。

所得RNA可以继续用于下游实验。

衍生化试剂很多，简单的说：它能帮你将不能分析的样品通过衍生化试剂反应转化为可分析的化合物.衍生化试剂比如有：烷基化试剂、硅烷化试剂、酰化试剂类、荧光衍生化试剂、 紫外衍生化试剂、苯甲酰氯衍生化试剂、羟基衍生化试剂 、 手性衍生化试剂、氨基衍生化试剂、气相色谱和液相色谱中常用的柱前衍生化方法、固相化学衍生化法。高效液相色谱法有甲醛与2，4－二硝基苯肼（DNPH）反应生成腙，衍生化产物醛腙用有机溶剂萃取富集后，在一定温度下蒸发、浓缩，再以甲醇或乙腈溶解或稀释，最后进行色谱测定。

虽然已有许多的衍生化试剂被使用，但是目前开发新的衍生化试剂仍然是一个活跃的研究领域，其主要目的是不断提高灵敏度和选择性以及扩大应用范围。

衍生化试剂要求：①衍生剂必须过量且稳定；不过量反应不完全，检测不充分。不稳定，重现性差；②衍生物、衍生产物和衍生副产物至少是好分离的。当然如果只能检测到衍生产物最好；③衍生反快速完全。反应慢，柱前衍生还可以，但柱后不行。因为流速固定，衍生池管路长度一定，留给衍生化的时间是一定的。柱前衍生可以在系统外等衍生完毕后进样，但也是影响效率的。 硅烷基指三甲基硅烷Si(CH3)3或称TMS。硅烷化作用是指将硅烷基引入到分了中，一般是取代活性氢。活性氢被硅烷基取代后降低了化合物的极性，减少了氢键束缚。因此所形成的硅烷化衍生物更容易挥发。同时，由于含活性氢的反应位点数目减少，化合物的稳定性也得以加强。硅烷化化合物极性减弱，被测能力增强，热稳定性提高。

硅烷化在GC分析中用途最大。许多被认为是不挥发性的或是在200～300℃热不稳定的羟基化合物经过硅烷化后成功的进行色谱分析。

硅烷化试剂作用同时受到溶剂系统和添加的催化剂的影响。催化剂的使用(如三甲基氯硅烷，吡啶)可加快硅烷化试剂的反应。确定好硅烷化反应的时间和温度至关重要。必须知道衍生化的转化速率，以实现对未知样品的定最分析。硅烷化试剂一般都对潮气敏感，应密封保存以防止其吸潮失效。这些硅烷化试剂适用于范围较广，但如果使用过最，则可能给火焰离子化检测器造成些麻烦。

三甲基硅烷是GC分析最常用的通用硅烷化基团。引入此基团可改善色谱分离，并使得特殊检测技术的应用成为可能。

硅烷化试剂还可以用于对玻璃器具（如GC的内衬管）和色谱的担体进行去活化。

硅烷化试剂主要是（氯）甲基硅烷系列。见下：

双（三甲基硅烷基）乙酰胺——（BSA）

N,O-二（三甲基硅烷）乙酰胺——（BSA）

双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺——（BSTFA）

二甲基二氧硅烷——（DMDCS）

六甲基二硅胺——（HMDS）

1,1,1,3,3,3六甲基硅氮烷——（HMDS）

N-(叔丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺——(MTBSTFA)

N-甲基三氟乙酰胺——(MTBSTFA)

三氟乙酸——（TFA）

三甲基氯硅烷——（TMCS）

三甲基硅烷咪唑——（TMSI）

二甲基二氯硅烷——（DMDCS）

N-甲基-n-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA） 酰化作用作为硅烷化的代替方法，可通过羧酸或共衍生物的作用将含有活泼氢合物（如-OH、-SH、-NH）转化为酯、硫酯或酰胺。含有卤离了的羰基基团可增强电了捕获检测器酞化作用具有很多优点：

保护不稳定基团，从而增加了化合物的稳定性；

可提高如糖类，氨基酸等物质的挥发性。这些物质常带有大量的极性官能团，加热时易分解；

有助于混合物的分离；

使用ECD检测，分析物检测下限可降低很多。

常用的酰基化试剂有：乙酸酐（AA）、三氟乙酸酐（TFAA）、五氟丙酸酐（PFPA）、七氟丁酸酐（HFBA）、N-甲基双（三氟乙酸酐）咪唑（MBTFA）、1-(三氟乙酰)咪唑（TFAI）等。 烷基化作用是将烷基官能团(脂肪族或脂肪，芳香族)添加到活性官能团(H)上。以烷基基团代替氢的重要性在于生成的衍生物与原来化合物相比极性大为下降。该试剂常用于修饰改良含有酸性氢的化合物如羧酸和苯酚。

生成的产物有醚，酯，硫醚，硫酯，正烷基胺和正烷基酰胺。弱酸性官能团(如醇)的烷基化要求有强碱催化剂（氢氧化钠，氢氧化钾）。酸性稍强的OH基团如苯酚和羧酸，弱碱催化剂(氯化氢，三氟化硼)即可。

常用的烷基化试剂有重氮甲烷、2,2二甲基丙烷（DMP）、18-冠醚-6、硼酸正丁酯（NBB）、O-盐酸甲氧基胺、五氟苄基溴（PFBBr）、N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺（Diazald）、N,N-二甲基甲酰胺二缩叔乙醛（DMF-DBA）、N,N-二甲基甲酰胺二缩乙醛（DMF-DEA）、N,N-二甲基甲酰胺二缩甲醛（DMF-DMA）、N,N-二甲基甲酰胺二缩丙醛（DMF-DPA）、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG,97%） 、三甲基苯胺——（TMAH）等。 常用紫外衍生化试剂

⑴2,4-二硝基氟苯（最大吸收波长350nm，摩尔吸收系数>104）

⑵对硝基苯甲酰氯（最大吸收波长254nm，摩尔吸收系数>104）

⑶ 对甲基苯磺酰氯（最大吸收波长224nm，摩尔吸收系数=104）

⑷异硫氰酸苯酯（最大吸收波长244nm，摩尔吸收系数=104）

⑸ 对硝基苯基溴（最大吸收波长265nm，摩尔吸收系数6200 ）

⑹ 对溴代苯甲酰甲基溴（最大吸收波长260nm，摩尔吸收系数=1.8×104）

⑺ 萘酰甲基溴（最大吸收波长248nm，摩尔吸收系数=1.8×104）

⑻N,N对硝基苄基异丙基异脲(最大吸收波长265nm，摩尔吸收系数6200）

⑼3,5二硝基苯甲酰氯（最大吸收波长248nm，摩尔吸收系数=104）

⑽对甲氧基苯甲酰氯（最大吸收波长262nm，摩尔吸收系数=1.6×104）

⑾2,4二硝基苯肼（最大吸收波长254nm，摩尔吸收系数=1.8×104）

⑿ 对硝基苯甲氧胺盐酸盐（最大吸收波长254nm，摩尔吸收系数=6200）

常用荧光衍生化试剂

⑴丹磺酰氯（激发波长340nm，发射波长355nm）

⑵ 丹磺酰肼（激发波长340nm，发射波长525nm）

⑶ 荧光胺 （激发波长340nm，发射波长525nm）

⑷ 邻苯二甲醛（激发波长340nm，发射波长455nm）

⑸4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（激发波长365nm，发射波长420nm）

⑹ 芴代甲氧基酰氯（激发波长260nm，发射波长310nm）

⑺荧光素异硫氰酸酯（激发波长350nm，发射波长383nm）

⑻4-氯-7-硝基苯一氧二氮杂茂（激发波长380nm，发射波长530nm）

醋酸：1.76*10-5

碳酸K1：4.30*10-7

碳酸K2

：5.61*10-11

苯酚：1.1×10-10

磷酸：7.52*10-3

次氯酸：2.95*10-8

硫氰酸：10.4×10-1

结论是酸性由强到弱的顺序为：硫氰酸

磷酸

醋酸

碳酸

次氯酸

苯酚

碳酸氢根

以上指的是酸的酸性，若要问溶液酸性，还需要看溶液浓度。

C(H+)=(KaC)1/2

一、化学药品、试剂毒性分类参考举例

（一）剧毒物质（＊为致癌）

＊六氯苯；羟基铁；氰化钠；氢氟酸；氢氰酸；氯化氰；氯化汞；砷酸汞；汞蒸气；砷化氢；光气；氟光气；磷化氢；＊三氧化二砷；有机磷化物；有机砷化物；有机氟化物；有机硼化物；＊铍及其化合物；蛇毒；＊羰基镍；砷酸盐；＊四甲基联苯胺（TMB）；四氯化饿；二甲砷酸盐；＊异硫氰酸苯脂；丙烯酰胺；马钱子碱；毒毛旋花素—G；＊二氨基联苯胺（DAB）；二甲亚砜；二甲砷酸钠；甲酚.

（二）致癌物质

黄曲霉素B13—4苯并芘；芘及苯并芘；苯及葸类；2—乙酰胺基芴；1—（或2—）萘胺；4—联苯胺类及其硫酸盐；4—氨基联苯；2,3—二甲基—4—氨基偶氮苯；磷甲苯胺；2,4—二氨基甲苯；乙酰胺N一芴基取代物；乙酰苯胺取代物；环磷酰胺；3,3—二氯联苯胺；4—二甲基胺基偶氮苯；4—硝基联苯；4—甲叉（双）—2氯苯胺；乙撑亚胺；间苯二酚；亚硝胺；二硝基萘；N—亚硝基二甲胺；甲基亚硝基脲；二甲（或乙、丙）基亚硝胺；N一甲基一N一亚硝基氨基甲酸乙酯；N—甲基一N—亚硝基丙烯胺；N—甲基—N一亚硝基—N’一硝基胍；N—甲基一4—亚硝基苯胺；B一丙内脂；甲烷磺酸甲酯（或乙酯）；丙磺内脂；重氮甲烷；1,4—二恶烷；二氯二甲硅烷；硫酸二甲脂；双氯甲基醚；氯甲甲醚；氯乙烯；溴乙烯；氟乙烯；砷；三氧化砷；砷酸钙（或铅、钾）；铍及其盐类；镉及其盐类；镍及其盐类；羰基镍；铬；氧化铬；铬盐类；石棉；氘代试剂.

（三）高毒物质

四氯化碳；三氯甲烷；溴甲烷；三氯乙烷；二溴氯丙烷；二氯乙烷；六氯乙烷；溴苯；氯苯；对二氯苯；氟乙酸；氯乙酸；氯乙酸乙酯；溴乙酸乙脂；氟乙酰胺；乙腈；丙烯腈；甲基丙烯腈；偶氮二异丁腈；丙酮氰醇；甲苯二异氰酸脂；二苯基甲烷二异氰酸脂；肼；甲基肼；苯肼；二苯肼；甲（或乙、丁）硫醇；二氯硅烷；三氯甲硅烷；硼烷；四乙基铅；四乙基锡；丙烯醛；乙烯酮；二乙烯酮；对苯二酚；苯胺及甲苯胺；三氯甲硅烷；碘乙酸乙脂；硫酸二甲脂；芳香胺；叠氮钠；三氯氧磷；五氯化磷；三氯化磷；五氧化二磷；黄磷；氧化亚氮；铊及其盐类；三氯化锑；二氧化锰；五氧化二钒；砷化钠；氟化钠；氯化氢；氯气；溴水；硫化氢；秋水仙碱.

（四）中毒物质

三氯硝基甲烷；乙烯吡啶；三硝基甲苯；五氯酚钠；硫酸；砷化镓；环氧乙烷；环氧氯丙烷；烯丙醇；二氯丙醇；糠醛；三氟化硼；四氟化硅；硫酸镉；氯化镉；硝酸；甲醛；甲醇；二硫化碳；甲苯；二甲苯；一氧化碳；一氧化氮；联苯胺；二苯酮；苯磺酰氯；苯磺酸、多聚甲醛；三氯乙醛；四氢呋喃；吡啶；吡咯烷；二甲胺；三苯基磷.

（五）低毒物质

三氯化铝；钼酸铵；间苯二胺；正丁醇；叔丁醇；乙二醇；丙烯酸；甲基丙烯酸；顺丁烯二酸酐；二甲基甲酰胺；乙内酰胺；亚铁氰化钾；铁氰化钾；氨及氢氧化铵；四氯化锡；氯化锗；对氯苯胺；硝基苯；三硝基甲苯；对硝基苯胺；硝基氯苯；二苯甲烷；苯乙烯；二乙烯苯；邻苯二甲酸；四氢呋喃；烷基铝；苯酚；三硝基酚；丁二烯；异戊二烯；氢氧化钾；盐酸；乙醚；丙酮；已二胺；丙二胺；丙烯酸乙脂；环已烷；环已酮；同苯二酚；邻苯三酚；三乙撑四胺；萤葸.

二、毒性分级

毒性分级 大鼠经口LD50 (毫克／公斤) 大鼠吸入4小时死亡 1／3~2／3浓度 (PPm) 兔经皮时LD50 (毫克／公斤) 对人的可能致死剂量 (克) (人按60公斤算)

剧毒 1或＜1 ＜10 5或＜5 0．06

高毒 1~50 10~100 5~43 4

中等毒 50~500 100~1000 44~340 30

低毒 500~5000 1000~10000 350~2810 250

微毒 5000~15000 1000~100000 2820~22590 1200

无毒 15000以上 ＞100000 22600以上 ＞1200

三、放射性同位素的毒性分组

（一）极毒组

钋210,镭223 225 226 228,锕227,钍227 228 229 230,镤231,铀230 232 233 234,镎237,钚236 238 239 240 241 242,镅241 242m243,锔240 242 243 244 245 246 247 248锎248 249 250 251 252 254,鎄254 255,铅210

（二）高毒组

钠22,氯36,钙45,钪46,钴60,锶90,钇91,锆93,铌94,钚106,银110m,镉115m,铟114m,锑124 125,碘124 125 126 131,铯134,钡140,铈144,铕152（T1／2＝13年）154,铽160,铥170,铪181,钽182,铱192,铊204,铅212,铋207 210,砹211,镭224,锕228,钍232,天然钍,镤230,铀236,钚244,镅242,锔241,锫249,锎246 253,锿253 254,镄255 256

（三）中毒组

铍7,碳14,氟18,钠24,硅31,磷32 33,硫35,氯38,氩41,钾42 43,钙47,钪47 48,钒48,铬51,锰52 54,铁52 55 59,钴55 56 57 58,镍63 65,铜64,锌65 69m,镓72,砷73 74 76 77,硒75,溴82,氪74 77 87 88,铷86,锶83 85 89 91 92,钇90 92 93,锆86 88 89 95 97,铌90 93m95 95m96,钼90 93 99,锝96 97m97 89,钌97 103 105,铑105,钯103 109,银105 111,镉109 115,铟115m,锡115 125,锑122,碲121 121m123m125m127m129m131 131m132 133m134,碘120 123 130 132132m133 135,氙135,铯132 136 137,钡131,镧140,铈134 135 137m139 141 143,镨142 143,钕147 149,钷147 149,钐151 153,铕152m（T1／2＝9h）155,钆153 159,镝165 166,钬166,铒169 171,铥171,镱175,镥177,钨181 185 187,铼183 186 188,锇185 191 193,铱190 194,铂191 193 197,金196 198 199,汞197 197 203,铊200 201 202,铅203,铋206 212,氡220 222,钍226 231 234,镤233,铀231 237 240 240＋,镎240 239,钚234 237 245,镅238 240 244m244,锔238,锫250,锎244,镄254

（四）低毒组

氢3,氧15,氩37,锰51 52m53 56,钴58m60m61 62m,镍59,锌69,锗71,氪76 79 81 83m85m85,锶80 81 85m87m,钇91m,铌88 89（66m）89（122m）97 98,钼93m101,锝98m99m,铑103m,铟113m,鍗116 123 127 129 133,碘120m121 128 129 134,氙131m133,铯125 127 129 130 131 134m135 135m138,铈137,锇191m,铂198m197m,钋203 205 207,镭227,铀235 238 239,钋235 238 239,钋236 243,镅237 239 245 246m246,锔249

注：1）1Bq天然钍相当于1α蜕变每秒（dps）（232Th：0.5dps,225Th：0.5dps）.

1Ci天然钍相当于3.7×1010α蜕变每秒（232Th：1.85×1010dps,238Th.

1.85×1010dps）.

2）1Bp的天然铀相当于1α蜕变每秒（233U：0.489dps,243U：0.489dps,235U:

0.022dps）.

1Ci的天然铀相当于3.7×1010α蜕变每秒（233U：1.81×1010dps,234U:

1.81×1010dps,235U:8.31×103dps）.

四、开放型放射性工作场所的分级

开放型放射性工作场所,按所用放射性同位素的最大等效日操作量分为三级如下：

工作场所级别 最大等效日操作量（毫居里）

甲级 ＞100 （毫居里）

乙级 0.5—100 （毫居里）

丙级 0.001—0.5 （毫居里）

注：开放型放射性工作单位所用的各种同位素等效日操作量（毫居里）,分别除以放射性毒性组别系数（极毒组为10,高毒组为1,中毒组为0.1,低毒组为0.01）,再乘以操作性质的修正系数,其积为该工作的日用量.

五、放射性核素的日等效操作量的计算

放射性核素的日等效操作量,等于放射性核素的实际日操作量（Bq)与该核素毒性因子的积除以与操作方式有关修正因子所得的商.核素的毒性组别修正因子以及操作方式有关的修正因子分别见表F1和表F2.

对于放射性核素,活度值不得超过：

极高放射性核素（一组）：5X10^3Bq1.4X10^-7Ci

高放射性核素（二组）：5X10^4Bq1.4X10^-6Ci

中等放射性核素（三组）：5X10^5Bq1.4X10^-5Ci

底放射性核素（一组）：5X10^6Bq1.4X10^-4Ci