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酚氯仿抽提dna原理

稳重的砖头
含糊的汽车
2023-01-25 06:09:29

酚氯仿抽提dna原理

最佳答案
发嗲的月光
难过的身影
2026-05-06 14:13:25

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂,反复抽提,使蛋白质变性,SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子,核蛋白变性降解,使DNA从核蛋白中游离出来。

DNA易溶于水,不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时,蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏,变性沉淀。

离心后有机溶剂在试管底层(有机相),DNA存在于上层水相中,蛋白质则沉淀于两相之间。酚–氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA,回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐,真空干燥,用TE缓冲液溶解DNA备用。

最新回答
妩媚的蜻蜓
雪白的犀牛
2026-05-06 14:13:25

高中:

原理:

1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤:

1.提取细胞核物质:顺时针方向搅拌,稍快,稍重。 5 min

2.溶解DNA:

3.析出含DNA的黏稠物:蒸馏水300mL,逆时针方向搅拌,缓慢

4.过滤:取黏稠物

5.再溶解:顺时针方向搅拌,较慢。3 min

6.过滤:取滤液。

7.提取出含杂质较少的DNA,逆时针方向搅拌,稍慢。5 min

8.DNA的鉴定:沸水浴5min

大学

DNA提取分为三个基本步骤,每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

利用研磨或者超声破碎细胞,并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚/氯仿抽提,以除掉细胞内的蛋白,如与DNA结合的组蛋白。

将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀,因为DNA在醇中不可溶而黏在一起,这一步也能除掉盐分。

另外,目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

2.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方法有三种①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法②化学试剂法:用SDS处理细胞③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可使细胞壁破碎。

3.DNA提取的几种方法

(1).浓盐法

A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.

B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. (2).阴离子去污剂法用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA

(3).苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态

(4).水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ,80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.

羞涩的白猫
文静的电源
2026-05-06 14:13:25
不同的抽提

tris饱和酚酚可以抽提掉DNA中的蛋白,分层后上层tirs中含有DNA,而下层苯酚中含有蛋白。

水饱和酚可以抽提掉RNA中的蛋白质,分层后上层水相中含有RNA,而下层苯酚中含有蛋白。

苯酚是很强的蛋白质变性剂,所以溶于其中的蛋白都是变了性的蛋白。

勤奋的酒窝
迷路的路人
2026-05-06 14:13:25
加入氢氧化钠溶液,乙酸乙酯萃取,蒸干乙酸乙酯得苯胺,水相加盐酸至酸性,过滤,水洗滤饼,乙酸乙酯萃取水相,蒸干乙酸乙酯,将蒸干物与滤饼合并即为苯酚。

原理:苯酚具有酸性,能与氢氧化钠反应生成苯酚钠,溶于水,苯胺被乙酸乙酯萃取。

水相加

盐酸,强酸制弱酸,苯酚被游离出来,低温时从水中析出