培养基包括哪些成分，各有什么作用，如何配制

营养性饲料添加剂是指为补充饲料营养成分而掺入饲料中的少量或者微量物质，主要包括饲料级氨基酸、维生素、矿物质微量元素等。

（1）氨基酸主要有3类：非必需氨基酸、必需氨基酸和条件性必需氨基酸。非必需氨基酸是指在动物机体内能够自行合成，或者可以由其他营养物质转化而来，不需要由饲料提供的氨基酸。必需氨基酸是指在动物体内不能合成或合成的量较少而不能满足动物的营养需要，也不能由其他物质转化而来，必须由饲料提供的氨基酸。动物必需氨基酸有13种，作为饲料添加剂使用的有赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸和精氨酸等。其中，赖氨酸与蛋氨酸使用量最多，其他氨基酸使用量较少。必需氨基酸中有一些氨基酸在饲料或饲粮所含的量与动物所需的量相比，比值偏低称为限制性氨基酸。猪的第一限制性氨基酸是赖氨酸，家禽的第一限制性氨基酸是蛋氨酸。氨基酸饲料添加剂具有改善氨基酸平衡、提高蛋白质利用率、促进动物生长等作用。动物体在严重的应激状态或创伤、感染等情况下，体内氨基酸的需要量会大大增加，一些本能自身合成的氨基酸在此时也会发生缺乏，这些随着机体外界条件的变化而需要量增加的氨基酸称为条件性必需氨基酸。（2）维生素维持动物正常生理机能和生命活动必不可少的一类低分子有机化合物，主要以辅酶或催化剂的形式参与体内的代谢活动，从而保证机体组织器官的正常结构和功能。维生素包括脂溶性维生素和水溶性维生素。其中，脂溶性维生素不溶于水，体内多余的量不能及时通过体液排出体外，可以在动物的组织器官中贮存，不必每天补充；水溶性维生素不能在体内贮存，过量时可以很快通过动物的体液排出体外，必须不断补充，动物采食过量的水溶性维生素不会发生中毒现象。

维生素添加剂具有促进畜禽生长发育、提高饲料利用效率和动物生产性能、增强抵抗应激能力和改善畜禽产品质量的功能。由于维生素纯品易受光、热、氧等环境因素的破坏，维生素添加剂常用其衍生物，并通过预处理工艺制成不同规格的制剂，如维生素A常用维生素A乙酸酯和维生素A棕榈酸酯、维生素E采用维生素E乙酸酯、维生素K采用亚硫酸氢钠甲萘醌、维生素B1采用盐酸硫胺素、泛酸采用泛酸钙、胆碱采用氯化胆碱等。添加剂产品中维生素的有效含量随产品种类不同差异很大。（3）矿物质微量元素动物体组织的生长和修补所必需的物质，按照矿物质在动物体内的含量可将矿物质分为常量矿物元素和微量矿物元素。常量矿物元素是指动物体内含量占动物活重0.01%以上，主要包括钙、磷、钾、钠、氯、镁、硫7种。微量矿物元素是指动物体内含量占动物活重0.01%以下，主要包括铁、铜、锰、锌、铬、钼、钴等12种。

矿物元素添加剂具有保障动物健康、提高动物生产性能和改善畜产品品质等作用。矿物元素添加剂种类繁多，一般以无机或有机盐类化合物形式提供，各元素的有效含量和生物学效价差异很大。钙、磷补充料常用碳酸钙、磷酸氢钙；镁补充料常用硫酸镁；钠、氯补充料常用食盐；对铁、铜、锌、锰等微量元素添加剂，生产中大量使用的多为其硫酸盐，多含结晶水。由于碱式氯化铜等有机盐比无机盐具有更高的生物学利用率，因此，有机矿物元素成为近年来饲料添加剂的研发热点。

维生素B是一组很复杂的维生素群，也称维生素B族，已知的有几十种，对鸡生理机能影响最重要的主要有维生素B1（硫胺素）、维生素B2（核黄素）、维生素B3（泛酸）、维生素PP（烟酸）和维生素B12（钴胺素）。

（1）维生素B1缺乏症 维生素B1是鸡进行碳水化合物代谢所必需的物质。缺乏时可引起鸡食欲减退，发生多发性神经炎。主要表现为生长发育缓慢，羽毛蓬乱无光，两腿软弱无力，走路不稳。鸡冠呈蓝色，腿、脚、翅、颈等肌肉麻痹，不能站立，常把身体坐在自己屈曲的腿上。由于颈前肌肉麻痹，头向后仰，呈“观星”状，或垂直坐地、倒地不起。体温下降，贫血，下痢，皮肤水肿，瘫痪死亡。

【防治措施】

保证日粮中正常供应维生素B1，喂给富含维生素B1的饲料，如新鲜青绿饲料，发芽的谷物、麸皮、米糠、酵母等。病鸡可口服盐酸硫胺素，每千克体重2.5毫克，或每千克饲料中添加2～3毫克。也可肌肉注射维生素B1，每千克体重0.25～0.5毫克。

（2）维生素B2缺乏症 维生素B2是鸡生长发育和提高种蛋孵化率所必需的营养物质。饲料单纯，尤其缺乏新鲜青绿饲料，或在配合料中没有添加多维素，都可引起维生素B2缺乏。缺乏时，鸡生长发育受阻，消化障碍，下痢、消瘦、衰弱。特征症状是趾爪向内蜷缩，不能站立行走。日久两腿麻痹瘫痪，失去运动能力。母鸡产蛋率明显下降，蛋的孵化率降低。剖检常见坐骨神经和臂神经显著肿胀。

【防治措施】

平时注意喂一些新鲜的青绿饲料，配合饲料时应注意添加多维素，保证维生素B2的含量，一般雏鸡每千克饲料中维生素B2的含量不少于3.6毫克，育成期的鸡应在1.8毫克左右。出现轻度症状时，可按每千克体重用维生素B22毫克，拌入饲料中喂给；或用核黄素片（5毫克），每千克体重0.1毫克，连喂2～3天。病重的鸡可口服核黄素，雏鸡每只每天2毫克，成年鸡5～6毫克。

（3）维生素B3缺乏症 维生素B3（泛酸）又叫抗皮炎因子，是鸡进行新陈代谢不可缺少的物质。缺乏时，特征症状是羽毛生长缓慢，粗糙无光泽，易脱落。眼睑边缘和口角出现颗粒状破溃，形成小痂块，上下眼睑往往被粘性渗出物粘着，视力下降。皮肤的角化上皮渐渐脱落，趾间和足底表皮剥脱，产生裂隙，病鸡疼痛，不能行走。产蛋鸡缺乏时，蛋的孵化率降低，孵出的雏鸡弱小，生活力不强。

【防治措施】

平时应注意日粮的合理搭配，多饲喂些富含维生素B3的饲料，如油饼、糠麸等，有条件的可在饲料中加肝粉和酵母粉，同时应适当添加多维素，补充维生素B12。病鸡可口服泛酸钙每只1～2克或泛酸每只2～3克；也可于每千克料中加泛酸钙20～30毫克或维生素B38～10毫克，连喂2周。

（4）维生素PP缺乏症 维生素PP又称烟酸或尼克酸，主要在正常组织细胞呼吸及糖、蛋白质、脂肪代谢中起着重要的作用，并对维持皮肤及消化器官的正常机能有重大意义。维生素PP缺乏症多见于雏鸡，特征症状是生长停滞，羽毛稀少，舌和口腔有深红色的炎症（“黑舌病”）。病鸡下痢，两腿无力，膝关节肿大，腿骨弯曲，皮肤及足部发生皮炎，鸡冠常有出血性红色痂皮。成年鸡缺乏时一般表现为羽毛脱落，产蛋率及蛋的孵化率降低。

【防治措施】

发现本病时应注意饲喂含维生素PP丰富的饲料，如米糠、麸皮、油饼、肝粉、优质鱼粉等，同时可于每千克饲料中添加10～30毫克的维生素PP，也可添加适量的色氨酸或赖氨酸。平时预防着重在于饲料的合理搭配，避免单一化的以玉米为主料。

（5）维生素B12缺乏症 维生素B12主要是参与核酸、蛋白质的合成及碳水化合物、脂肪的代谢，具有促进新的细胞生长，尤其是促进红细胞的发育、成熟的功能。缺乏时，雏鸡发育受阻，生长不良，消瘦、贫血。成年鸡产蛋量减少，蛋小，孵化率低，往往孵化到后期，鸡胚死亡。

【防治措施】

发生本病时应注意多喂一些动物性饲料，如鱼粉、肝粉、骨粉等，同时于饲料中添加适量优质的多维素，必要时可于每千克饲料中添加维生素B124～10微克及适量的氯化钴。重病鸡可肌肉注射维生素B12，每次每只2～4微克，每天1次，连用数天。平时预防着重在于补充动物性饲料和多维素。

（朱蔚华）

1902年，最早作植物组织培养实验的G.Haberlandt预言，高等植物的离体细胞可以长成植物体。这一假说成为以后植物组织培养的理论依据。

1937年，White建立了组织培养的综合培养基，并和Gautheret等人首次成功地用烟草的茎形成层细胞和胡萝卜根的小块，在人工培养的条件下，使细胞增殖和诱导出愈伤组织。他们建立起来的植物组织培养的基本方法，成为以后各种植物进行组织培养的技术基础。

1948年，F.Skoog和崔澂发现，在培养烟草茎段和髓的培养基上，附加适当比例的腺嘌呤和生长素可以控制植物的组织长苗或长根，也就是说当腺嘌呤/生长素的比例高时产生芽，比例低时形成根。其后，C.D.Miller等（1956）发现，激动素代替腺嘌呤效果更好，建立了激动素/生长素比例的控制器官分化的激素模式。这种激素“控制论”的理论在植物组织培养研究中，至今仍起着指导作用。

50年代，组织培养技术发展迅速，由静止的固体培养发展到液体培养，其中又分悬浮培养、微室培养、看护培养、平板培养等。1958年Steward等人，用液体悬浮培养把胡萝卜的体细胞经胚状体的发育途径，培养成完整植株并且开花结实。这项重大突破，不但证实了Haberlandt的“细胞全能性”的设想，而且也为组织培养中研究器官形成和胚胎发生，开创了一个新的领域。

60年代初E.C.Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功，为近年来新发展的原生质体融合技术、体细胞杂交等遗传工程的迅速发展创造了条件。

近二十年来，由于培养的植物细胞在一定条件下所表现的全能性规律，使组织培养技术在生产上的应用得到了重视与发展，已逐渐成为农业、林业、园艺、医药等方面的重要研究手段，并且带动了形态、细胞、生理、生化、遗传育种等一系列学科的进展。

由于分子生物学和生物工程的发展，促使植物组织培养技术日趋完善。60年代后植物组织培养开始在生产上应用，使植物生产走向工厂化的应用时期。花卉及草本植物，用无性繁殖系快速繁殖植株，工厂化生产的试管品种商品化；应用细胞大量培养技术生产药物的方法，已在日本、联邦德国等国家获得成功。总之，植物组织和细胞培养是一项具有很大潜力的新兴的生物技术，将以崭新的面貌投入世界新的产业革命的行列，而展示美好的前程。

目前植物组织和细胞培养技术在植物学等学科的实际应用，主要在两个方面：（1）植物育种与快速繁殖；（2）生理活性物质的生产。

一、植物组织培养的实验设备、灭菌方法和基本培养基

（一）植物组织培养的实验设备

1.实验室的设置

（1）无菌操作室室内有供接种用的净化工作台，放置接种用具和培养物的工作边台，天花板或墙上安装紫外光灯管供灭菌用。如有细菌过滤的通气装置更好。

（2）培养基配制室

用于配制各种培养基，室内须有较大面积的平面工作台以及放置各种化学药剂及器皿的柜架。存放配制好的培养基母液的冰箱，蒸馏水制备及贮存的设备。

（3）恒温培养室

培养室内需要有控制恒温的空气调节器，以及照明装置。恒温室的温度一般保持在25℃左右，温差最好不超过±1℃。

培养室内须有培养架，摇床，转床等培养装置及设备。

（4）细胞学实验室

放置各种显微镜和解剖镜，主要观察培养结果。有条件时可建立摄影设备，摄制实验结果。

（5）化学实验室

置备各种常规和先进的化学分析和测定的仪器设备，进行各种化学分析和测定工作。

2.仪器和用具

（1）玻璃器皿

应用碱性溶解度小的硬质玻璃制成的仪器和器皿，特别是进行长期培养时，如选用非优质玻璃制品，则易发生不良影响。

常用的玻璃器皿有：三角瓶、奶头瓶、T型管、角形培养瓶、圆形培养瓶、L形试管、平行有（无）角试管、圆形扁瓶、培养皿、玻璃环、载玻片、盖玻片、漏斗、分装器、注射器、圆底烧瓶、分液漏斗、玻板、玻璃柱、冷凝器、提取装置、染色缸、酒精灯。

（2）用具和器械

选用医疗器械和微生物实验室使用的器具，如刀、剪、各种镊子、解剖刀、接种针。

（3）仪器和设备

一般需要有天平、酸度计、离心机、显微镜、解剖镜、温箱、烘箱、冰箱、摇床、转床、自旋式培养架、分光光度计、薄层扫描仪、高压液相色谱仪等。

（二）植物组织培养的灭菌方法

1.器皿和培养基的灭菌

培养皿、工作服、口罩、帽子等可用高温消毒，一般用1.2个大气压，20—30分钟；培养基的消毒时间不宜过长，否则有些物质易分解破坏，1.2个大气压，15分钟就足够了。金属器械的消毒，一般于使用前浸泡在70%乙醇中，用时在火焰上点燃消毒冷却后使用。

2.植物材料的灭菌

植物材料的灭菌主要是外部灭菌，须根据材料的种类对杀菌剂的敏感性来选择消毒剂的种类与浓度和处理时间的长短。首先将实验材料在肥皂粉溶液中仔细刷洗并用流水冲洗干净，然后参照表13—1和表13—2所列的方法和顺序进行灭菌。

表13—1 常用灭菌剂效果的比较

表13—2 植物不同器官的灭菌顺序（三）植物组织培养的基本培养基

1.培养基的成分组成

植物组织培养基通常由以下几类物质组成（表13—3）：

表13—3 几种常用培养基的成分组成（单位：mg/l）

（1）无机营养物

无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素除碳（C）、氢（H）、氧（O）外，就是氮（N）。氮通常用硝态氮或铵态氮，但在培养中多用硝态氮，也有将硝态氮与铵态氮混合使用。磷常用磷酸盐，硫常用硫酸盐。钾是主要的阳离子，钙（Ca）、钠（Na）、镁（Mg）的需要量较少。大量元素的配合比率一般都是沿用培养整体植物的Knop溶液的配方修改而成。在一般情况下，营养培养基中至少要含有各为25mmol的硝酸盐和钾。铵的含量超过8mmol时常对培养物有毒害作用；但对常规的愈伤组织培养和细胞悬浮培养，硝酸盐加上铵的浓度可以提高到60mmol。钙、硫、镁的浓度在1—3mmol范围内较为合适。而所需的钠氯化物则由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘（I）、硼（B）、锰（Mn）、锌（Zn）、钼（Mo）、铜（Cu）、钴（Co）和铁（Fe），其中碘可能是不必需的。

（2）碳源和能源

大多数植物细胞对蔗糖的需要范围是2—4%，在有些植物组织培养中，蔗糖的浓度高达7%甚至15%。糖源在培养基中除作为碳源和能源外，可能还有其它作用。蔗糖也能用葡萄糖和果糖来代替，其它的糖类均不够理想。肌醇可能并不是必需的，但在一般培养基中均用了较大的浓度，这可能与它有促进愈伤组织的生长作用有关。

（3）维生素

在各种维生素中，盐酸硫胺素（B1）可能是必需的，而烟酸及盐酸吡哆辛（B6）对生长只有促进作用。

（4）生长调节物质

植物激素是培养基中不可缺少的组成成分，它对植物愈伤组织的诱导、培养生长、器官分化和次生产物的代谢，都有直接的影响。通常加入于培养基中的激素有两类：一是生长素，常用有2，4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等；另一类是细胞分裂素，常用的有激动素（Kt）、玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（6-BA）。2，4-D的适宜浓度为10-7—10-5mol，IAA的为10-10—10-5mol，以1—10mg/l为最通用。NAA的适宜浓度范围比前二者均高。在通常情况下，只用2，4-D（10-5—10-7mol）就可以成功地诱导产生愈伤组织。如将2，4-D等生长素物质与一种细胞分裂素配合使用时，其效果会更好。诱导外植体分化植株时，用萘乙酸与一种细胞分裂素配合可能更好。在细胞分裂素中，激动素与6-苄基嘌呤均使用得较普遍，对愈伤组织的生长均有促进作用，其适宜浓度为10-7—10-6mol。

（5）氨基酸

培养基中应包括某些氨基酸，例如甘氨酸。另外像水解酪蛋白也是组织培养中常采用的，它是一种具有多种氨基酸的混合物，特别是在分化培养基中加入一定量的水解酪蛋白，可促进胚胎发生和多胚性出现。一些氨基酸是某些次生物质的前体物（如苯丙氨酸、鸟氨酸等是莨菪类生物碱生物合成的前体物），当它们加入培养基中，会明显地增加这类次生物质在组织培养物中的含量与产量。

（6）有机添加物

一些天然产物加入培养基中，它们对愈伤组织的诱导和维持，以及促进生长和次生物质的形成与积累都是有益的。其中最常用的有椰子乳、酵母提取物、番茄汁、大豆粉等。其使用的浓度范围：椰子乳为10%（体积/体积），酵母提取物为0.5%，番茄汁为5—10%，大豆粉0.1—0.5%。这些天然添加物，由于成分复杂且难保证重复一致，所以在培养基的配制中更倾向于选用完全已知的合成化合物。

2.培养基的制备

（1）水和药品

配制培养基最好使用玻璃容器蒸馏过的去矿质盐的蒸馏水。所用的化学药品应较纯。生长调节物质在用前最好进行重结晶。蛋白质水解物最好用酶水解的，这样可以使氨基酸更好地在自然状态中保存。

（2）母液（贮备液）

配制培养基方便的方法是先制备一系列母液。大量的矿质盐（大量元素）可配成浓于使用浓度的10倍。溶解矿质盐时，力求把Ca2+与SO2-4—和PO3-4错开，以免形成硫酸钙和磷酸钙的不溶物，最好是用一定量蒸馏水将矿质盐分别溶化后，然后按顺序加入，最后加水至一定体积。微量元素由于用量少，可配成使用浓度的100—1000倍浓缩液，与大量元素等贮存于冰箱中。维生素每种分开配制，可按0.2—1mg/l的浓度分别配在容量瓶中贮存。铁盐需单独配制（见前）。植物激素类物质，配制时的要求各有不同。NAA、2，4-D和IAA等生长素类物质，称好药品后先用少量95%乙醇溶化，然后再加蒸馏水稀释至一定浓度；细胞分裂素类物质，则宜先用少量0.5或1N的盐酸来溶解，然后加蒸馏水至所需量；叶酸则应用少量的稀氨水溶解，然后再加蒸馏水至所需量；生物素配制时可直接溶于水。

（3）高压灭菌和保存

配制培养基时，先将各种母液按所需容积分别取出并混合在一起，临时加入蔗糖、激素和其它附加成分，并与预先已加热溶化的琼脂（液体培养则不加琼脂）混合后，用氢氧化钠溶液或1N盐酸调节pH值至要求的一定值（5.5—5.8之间），然后再分别装入培养容器中。制备好的培养基在高压灭菌锅中，120℃，1.1kg/cm2的高压下灭菌15—20min。灭菌后的培养基可在室温下贮存（最适的温度为10℃），并应在两周内应用。

3.几种常用培养基的特点

在不同的培养基中，一般无机盐的变化较大，有时也因加入不同的氮源而形成各自的特点。MS是1962年Murashige，T.和Skoog，F.为培养烟草而设计的培养基，它对在固体培养条件下诱导愈伤组织，在液体培养条件下作细胞悬浮培养及用于胚、茎尖、茎段和花药等培养和形态发生研究方面，均获得了明显的成功。MS培养基中无机养分的数量和比例均较合适，足以满足很多植物细胞在营养上和生理上的需要。故在一般情况下，无需在培养基中加入酪朊水解物、酵母水解物或椰子乳等有机附加成分。与其它培养基相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它显著的特点。与MS培养基相近的，还有LS（Linsmaier，E.M.和Skoog，F.1965）和RM（田中，1964）培养基，它们的基本成分均与MS培养基相同，唯前者去掉了甘氨酸，维生素B6和烟酸，后者把NH4NO3的用量提高到4950mg/l，把KH2PO4提高到510mg/l。与MS培养基相比White（1963）培养基则是一个具有较低浓度无机盐培养基，但它的使用也十分广泛，无论在胚胎培养或一般组织培养上也有很好的效果。B5培养基是Gamborg等（1968）设计的，它的主要特点是含较低的铵，而铵这一营养成分可能对某些生长物有抑制生长的作用。N6培养基是中国科学院植物研究所和黑龙江省农业科学院设计的，也是一个很适用的培养基，目前在国内已广泛用于花药培养及某些植物的组织培养上，其成分与B5相似，但却不含钼。Heller（1953）培养基是欧洲使用得较普遍的一种培养基，它的无机盐含量低，同时还缺乏钼盐，但含有镍铝等化合物。

从总的趋势来看，近代的培养基都倾向于采用高浓度的无机盐。在氮的运用上，不少是采用硝态氮和铵态氮的混合，或只是硝态氮。微量元素的作用研究得较少，大多数配方也基本上接近MS培养基的，而所包含的这些微量元素成分已满足组织培养中愈伤组织和细胞生长的需要。对于铁盐通常则采用FeSO4与Na2-EDTA（螯合剂）的混合物居多。

二、植物组织和细胞培养在药物生产中的应用

近些年来由于自然环境的人为破坏，滥采乱伐，劳力费用上涨及引种野生植物在技术上和（或）经济上的困难，导致植物资源急剧减少，而确保药用植物充分供应的困难日益增加。六十年代以来，人们开始应用植物组织培养技术研究植物药的生产问题。近年来随着现代生物技术的发展，植物细胞大量培养获得成功，为植物药物开辟了一条崭新的工业化生产的新途径。

细胞培养系统比一般整体植物栽培，具有多方面的优越性：（1）有用物质的生产是在可控制的条件下进行，而不必依赖气候和土壤条件，并节省土地；（2）细胞培养无微生物和虫害；（3）生长周期短，缩短植物引种驯化和扩大繁殖的漫长过程；（4）可以进行特定的生物转化反应，可以探索新的合成路线和获得新的有用物质；（5）可以通过筛选新的细胞系，改变培养条件，以提高生产率和减少生产费用。

（一）植物组织和细胞培养技术

1.愈伤组织的诱发和培养

愈伤组织是植物组织和细胞培养的基本材料，所以诱发愈伤组织和进行培养是植物组织和细胞培养的基础性工作之一。

诱发愈伤组织的工作程序大致如下：

（1）植物材料（包括植物种类与部位）的选择；（2）材料的制备与消毒；（3）培养基的选定与制备；（4）接种与培养；（5）继代培养。

目前已经成功地从许多植物诱发出愈伤组织，其中以双子叶植物最多，单子叶植物较少。此外，裸子植物、蕨类和藓类植物也有成功的例子。因此可以说，所有的多细胞植物都有诱发愈伤组织成功的潜在可能性。双子叶植物除有广泛的实用价值外，且它们能够迅速地长出愈伤组织。植物的各种组织，如维管束形成层，贮藏器官的薄壁组织，根的中柱鞘，胚乳、子叶、叶肉组织及维管束组织等，在合适的条件下，都能形成愈伤组织。

愈伤组织的诱发多在固体培养基上进行。固体培养一般在25—28℃进行，每隔4—6周进行一次继代培养。

愈伤组织的培养方式一般可分为固体培养和液体培养两种。固体培养是指向培养基中加入一定量的凝固剂（0.6—1.0%琼脂等），加热溶解后，分别装入培养容器中，冷却后即为固体培养基。而不加凝固剂者则为液体培养基。

固体培养为静置培养，其优点是简便，只需一般玻璃器皿即可，不像液体振荡培养那样需要摇床、转床等复杂的机械设备，且占地少，一间小培养室就可以放置很多培养器皿。但固体培养也存在如下缺点：愈伤组织只有一部分表面和培养基接触，造成愈伤组织生长不均衡；接触培养基的底层组织气体交换不良，同时也使生长过程排出的有害物质堆积；静止放置时，由于重力作用或光线照射不均匀，而使组织出现极化现象，而难得相当一致的群体。

液体培养又分静置和振荡两种。液体静置培养与固体培养一样也是方法简便，且培养液中不会出现营养物质浓度差异现象；但由于使用的局限性较大，故目前已很少采用。振荡培养是使植物组织在液体培养基中不断转动，从而可以消除静置培养中的缺点。振荡培养又可分为两类：（1）连续浸没的，通过搅动或振动培养液的方法使组织悬浮于培养基中，常用摇床进行培养；（2）定期浸没的，用T型管，乳头瓶作培养容器，在转床上进行培养。在转动过程中培养材料在液相和气相中重复出现。

2.细胞悬浮培养

植物细胞悬浮培养技术是由愈伤组织的液体培养技术基础上发展起来的一种新的培养技术。近二十多年来，从试管悬浮培养发展到大容积发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养，直到近年来最新型的浊度恒定法和化学恒定法等自动控制的较大规模的连续培养。细胞悬浮培养的特点是：（1）能大量提供均匀的植物细胞；（2）细胞增殖的速度比愈伤组织快；（3）适合于大规模培养。因此有可能把植物细胞如同微生物一样来培养，应用于发酵工业中来，生产一些植物特有的产物，从而开辟一条工业化生产植物产品的新途径。细胞悬浮培养是使游离的植物细胞在液体培养基中进行培养，但是因为植物细胞具有聚集在一起的特性，故直到目前为止，还不能使悬浮液中只有游离的单细胞，而往往是一些小的细胞团。

（1）悬浮培养的设备和装置

①摇床 广泛地用于植物细胞悬浮培养中。易于碎裂的愈伤组织块，经摇床的连续振荡可以得到分散的细胞悬浮液。也可用于悬浮细胞的继代培养。

②转床 每分钟一转。用T型管或奶头瓶作为培养容器。

③自旋式培养架 可用较大的瓶作为培养容器。

④连续培养设备 通常依靠通入无菌的压缩空气或既通入空气又不断搅拌的方法，使细胞一直处于悬浮状态。在这样的搅动装置中，由于盛放培养液的容器是静止的，故能容易地把贮存新鲜培养液的容器，空气补给装置等和培养容器连接起来。培养容器内可安装一些蛇形管，管内放入电热丝就可加热，通入冷水就可降温，因此这类装置不必安装于恒温室内。这类装置一般都有能够简便控制温度，搅拌速度，通气速度，照明强度，营养液流入速度等的装置，而且还常与氧电极，pH电极，细胞密度测定器等联接起来，成为一套初步自动控制的连续培养装置。几种植物细胞大量培养装置有用搅拌的发酵装置，用振荡器的发酵装置，利用导管及旋转叶轮的发酵装置，气泡搅动的发酵装置和气升式发酵装置等。

（2）悬浮细胞的培养基

常用的适合愈伤组织的培养基，不一定对细胞悬浮培养也最合适。通常诱发愈伤组织的培养基可以作为确定最适培养基的出发点。特别需要注意生长素类和细胞激动素类的用量对悬浮培养细胞聚集性的影响，必须选用使细胞易于单一游离的培养基。

在悬浮培养时pH常有相当大的变动，因此必须加入EDTA等螯合剂使铁和其他离子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间比例的调整也可作为稳定pH的一种方法。加入一些固态缓冲物，如微溶的磷酸氢钙、不溶的磷酸钙、碳酸钙也是稳定pH的一种方法。

（3）悬浮细胞的继代培养

悬浮培养过程中，细胞数目增长的变化情况见图13—1。基本上是一条S形曲线。一开始是延迟期，细胞很少分裂；接着是对数生长期，细胞数目迅速增长，增长速率保持不变；以后进入逐渐减慢的静止期；最后达到增长完全停止期。细胞在培养中，一般在静止期之初进行继代培养，有的在静止期之前增殖减慢时即需传代，有的甚至在对数生长期末立即传代，以求加速细胞增殖。

图13—1 悬浮培养细胞在一个培养世代中细胞数的增长情况示意图

近年研究采用DNA合成抑制剂和植物激素处理法等，使培养中的细胞在一定条件下，进入细胞分裂周期的某一个时期（如G期），然后从下一个时期开始，使大部分细胞或全部细胞同步分裂，即所谓同步培养。这样不仅可以详细了解细胞周期的真实过程，还可以认识控制着从亲代细胞到子代细胞过程中生化变化序列的因素。由于同步培养可以频繁地取样进行生化学和细胞学的分析，取样量可以较大，并且不会影响到剩下来的群体继续生长，这样对研究细胞周期、细胞分化、次生物质代谢等重要过程提供了必要的技术手段，是植物细胞培养技术发展中的又一重要进展。

综上所述，目前植物组织和细胞培养技术已从静止的固体培养发展到液体培养，其特点是可以使培养中的组织和细胞的养分和供氧情况得到改善。在规模和方法上正沿着从小量到大量，在应用上从试管到大罐和同步培养，在操作上从手工到自动化方向发展。这些进步和发展对植物组织和细胞培养的研究和生产应用产生重大的影响。

（二）植物组织和细胞培养产生的药物成分

自1950年Bonner等对用银胶菊愈伤组织产生天然橡胶进行研究以来，许多科学工作者围绕着愈伤组织能产生哪些有用物质，如何提高有效成分得率等问题，进行了大量的工作，并取得了一些成果。越来越多的人认为利用植物组织和培养细胞有可能生产用于治疗各种疾病的生物碱、萜烯类、醌类、固醇类、酶等，以及从培养物中提取肽类和蛋白质物质。Nickell（1980）概括介绍了植物组织培养能产生50余类化合物及其中28类潜在的产品。郑光植（1980）综述列表举出药用成分，来源植物与药物含量共60多条。日本协和发酵公司的见泽（Misawa，M.，1980）介绍了由工业实验室或政府进行的，通过植物组织培养产生生物碱，固醇类、萜类、醌类和其他生理活性物质包括酶等的研究成果。据世界卫生组织公布，从高等植物提取的最普通而又必不可少的药物有17种。其中11种药物的来源植物已有组织培养（表13—4）。

表13—4 来源于高等植物的普通而又不可少的药物

1.生物碱

利用植物组织和细胞培养生产生物碱是格外地困难，然而产生生物碱的药用植物的组织培养是研究得最多的一个方面（表13—5）。但其含量通常比原植物低。

表13—5 植物愈伤组织中的生物碱

表13—5 植物愈伤组织中的生物碱（续）-1

（1）莨菪烷生物碱

Mothes、West、Chan、Metz、木岛正夫、Bhandary、Thomas、Stohs、Sairam、Tabata、Hiraoka、Cliokshi等先后对曼陀罗、颠茄、天仙子、莨菪等的根、愈伤组织、悬浮细胞进行了大量的研究，但药用目的物没有或含量很低。West（1957）首先肯定了颠茄根的愈伤组织中存在莨菪烷生物碱。检查到根愈伤组织中阿托品含量为0.47—0.53%。但茎叶的愈伤组织中未检查到。Chan等（1956）将曼陀罗、柏叶曼陀罗、无毒曼陀罗的各类器官诱导出的愈伤组织，进行静置培养与振荡培养，测定愈伤组织中生物碱含量。其中以曼陀罗和无刺曼陀罗种子愈伤组织中含量最高，达0.016—0.056%，根为0.012—0.015%，茎为0.004—0.014%，叶为0.007—0.010%。此结果表示因诱发愈伤组织的器官不同，生成生物碱的量亦有差异。West等还指出同一起源的曼陀罗的愈伤组织株之间，在合成生物碱的能力上也有差异。郑光植等（1976）在三分三愈伤组织培养中，最初测定莨菪碱含量为0.025%、东莨菪碱的含量为0.009%，均低于原植物（分别为0.127%和0.016%）。但因改良培养条件、增加营养、改变生长调节剂、补充前体物等各方面的研究，使两种生物碱的含量总共达0.554%（原植物为0.139%），其中东莨菪碱最高含量达0.495%（茎为0.016%），比最初愈伤组织的含量高4—4.5倍。程克棣等（1987）研究结果表明山莨菪等细胞不仅能产生托品类生物碱，还能将莨菪碱转化为山莨菪碱和东莨菪碱。

（2）吡啶生物碱

在产生吡啶生物碱的组织培养研究中，烟草研究得最早最多。早在1948年Dawson就对烟草中生物碱的生物合成进行了研究，他的1960年的报道粘毛烟草的组织培养中，烟碱的含量在最初阶段急剧减少，当成典型的愈伤组织时，就没有烟碱了。但Speake等（1964）证明，烟草（Virginia品种）根、茎、叶的

配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。

自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。

1．配制几种母液

1．配制MS大量元素母液

一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。

分别称取

NH4NO3 165g KH2PO4 17g

KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g

MgSO4·7H2O 37g

各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

2．配制MS微量元素母液

一般将微量元素配制成100倍母液。

依次称取

KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g

H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g

MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g

ZnSO4·7H2O 0.86g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

分别称取

CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g

各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。

3．配制MS有机母液

一般配制成100倍MS有机母液。

依次称取

肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g

烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g

盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

4．配制MS铁盐母液

一般配制成100倍MS铁盐母液。

依次称取

EDTA二钠3.73g FeSO4·7H2O2.78g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。

激素母液的配制

各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。

2．配制培养基

以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：

1．先在烧杯中放入一些蒸馏水。

2．分别取上面八种母液10ml倒入。

3．一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。

4．加蒸馏水用量筒定溶至1L。

5．按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。

6．用精密试纸或酸度计调整PH至5.7～5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。

1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。

7．称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。

8．稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。

9．放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。

10．灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。

这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。

无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。

灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。

植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。

1．培养基用湿热灭菌

培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。

关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1～0.15MPa，20分钟。

按容器大小不同，保压时间有所不同，见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。 接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%～3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行：

1．在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌；

2．在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；

3．接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；

4．上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；

5．先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；

6．接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；

7．接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。现将接种前后的程序连贯地介绍。

无菌接种步骤：

1．将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。

2．材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1～2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

3．用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1～3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。 培养指把培养材料放在培养室（无光、适宜温度、无菌）里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织，光照条件下进一步分化成再生植株的过程。

1．培养方法

1．固体培养法

即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。

2．液体培养法

即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。

2．培养步骤

1．初代培养

初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某些外植体后，最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为：

1）顶芽和腋芽的发育

采用外源的细胞分裂素，可促进使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整小植株。一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型繁殖，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种的一种繁殖方式。

适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。

茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。

用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。

2）不定芽的发育

在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性（这与胚状体不同）。多数情况下它形成芽，后形成根。

另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。

在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。

3）体细胞胚状体的发生与发育

体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。

4）初代培养外植体的褐变

外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接触外植体的培养。

褐变的主要原因如下：

a、植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。

b、生理状态由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般说来，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。

c、培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

d、培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。

1．选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。

2．合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

3．使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%～0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

4．连续转移 对容易褐变的材料可间隔2～24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

(2)继代培养

在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不够，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。

继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。

继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MS基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块，放入MS培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。

增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。

在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是储备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。

3．继代培养时材料的玻璃化

实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。

因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。

呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：

a、增加培养基中的 溶质水平，以降低培养基的水势；

b、减少培养基中含氮化合物的用量；

c、增加光照

d、增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；

e、降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化现象发生；

f、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。

3．生根培养

当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养可采用1/2或者1/4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素（NAA、IBA等）。

诱导生根可以采用下列方法

a、将新梢基部浸入50或100*10-6IBA溶液中处理4～8小时；

b、在含有生长素的培养基中培养4～6天

c、直接移入含有生长素的生根培养基中。

上述三种方法均能诱导新梢生根，但前两种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。

另外也可采用下列方法就可生根。1、延长在增殖培养基中的培养时间；2、有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量（即将增殖与生根合并为一步）；3、切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物。

另外少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。

从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而生长。但因经胚状体发育的苗数特别多，并且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。

试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将移植到试管外的环境中，以使试管苗适应外界的环境条件。通常不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以18～20℃为宜。实践证明植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。而且还牵涉到菌类易滋生的问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。春季低温时苗床可加设电热线，使基质温度略高于气温2～3℃，这不但有利于生根和促进根系发达，而且有利于提前成活。

移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高，并可适应强度较高的漫射光，（约4000lx左右），以维持光合作用所需光照强度。但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平衡的矛盾更尖锐。 试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽，应该选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利完成。

试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100%的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使她们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。

从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理，通常采取的措施有：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。

另外，对栽培驯化基质要进行灭菌是因为试管苗在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵御能力极差。为了提高其成活率，在培养基质中可掺入75%的百菌清可湿性粉剂200～500倍液，以进行灭菌处理。

1．移栽用基质和容器

适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭配，一般用珍珠岩、蛭石、草炭土或腐殖土比例为1：1：0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1：1。这些介质在使用前应高压灭菌。或用至少小时烘烤来消灭其中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。以下介绍几种常见的试管苗栽培基质。

1．河砂

河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为1～2mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为0.1～0.2nm。河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。

2．草炭土

草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能单独用来栽种试管苗，宜与河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用。

3．腐殖土

腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋入坑中，灌水保湿的条件下使其风化，然后过筛即可获得。腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质，它通常不能单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根。

4．容器

栽培容器可用6×6cm～10×10cm的软塑料钵，也可用育苗盘。前者占地大，耗用大量基质，但幼苗不用移栽，后者需要二次移苗，但省空间、省基质。

2．移栽前的准备

移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3天，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-2天，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。

3．移栽和幼苗的管理

从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。移植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中。保证空气湿度达90%以上。

1．保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5～7天内，应给予较高的空气湿度条件，使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的饿蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当5～7天后，发现小苗有生长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15天以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。

2．防止菌类滋生。由于试管苗原来的环境是无菌的，移出来以后难以保持完全无菌，因此，应尽量不使菌类大量滋生，以利成活。所以应对基质进行高压灭菌或鸿烤灭菌。可以适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效的保护幼苗，如多菌灵、托布津，浓度800～1000倍，喷药宜7～10天一次。在移苗时尽量少伤苗，伤口过多，根损伤过多，都是造成死苗的原因。喷水时可加入0.1%的尿素，或用1/2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活。

3．一定的温、光条件。试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是18～20℃，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。

另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。

4．保持基质适当的通气性。要选择适当的颗粒状基质，保证良好的通气作用。在管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，以利根系呼吸。

综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。

主要种类： 能促进根的生长： 是磷脂的主要成分：， 一部分糖会发生分解?是某些酶的组成成分:?形式： 氧化酶：， 对细胞壁的形成也有作用、 芽的分化和幼苗 转绿有促进作用， 可直接被细胞吸收利用?种类， Co等。， 制定配方时要给予考虑、 KN03等盐类、 发育异常现象， 可用食用的绵白糖代替?主要作用、 维生素、 Co等? 糖作为碳源.微量元素.1—1?思考： Fe：， Zn， Mo一： 有防止组织变褐的作用： 是以各种辅酶的形式参与多 种代谢活动。、 Mn、 以及氮素代谢等有密切关系?形式：?主要元素：。1?P。?氨基酸 、 Mo， 指植物在生长发育时所需要的各种维持其正常生理活动的化学元素、 叶酸、 酶、 保护质膜不受破坏有显著作用? 适当使用肌醇?作用：?Ca，对生长、 肌醇（环己六醇）， 根生长在其下表面在外植体上既没有芽发生。? 为细胞的呼吸代谢提供底物与能源、 培养基的主要成分?附加物和天然的有机添加物质?植物生长调节物质? 葡萄糖和果糖也是较好的碳源： FeSO4·7H20和Na2—EDTA： 是蛋白质： 在2%—3%? 甘氨酸能促进离体根的生长、 S? 最常用?Fe： MgSO4·7H20： Ca是构成细胞壁的一种成分。， 和FeCl3： 、 磷脂。.大量元素： 为何不用Fe2（SO4）3， 缺少这些物质会导致生长?N。?琼脂：、 维生素 3： CaCl2·2H2O， 并且能够维持一定的渗透压（一般在1， 也是植物组织培养中不可缺少的元素?K?pH值 ， 常用3%：、 Cu：， 又是激酶的活化剂、 分化有促进作用：?无机营养又叫矿质营养， 也有一些根发生芽从外植体的上表面发生而根从下表面发生tissue culture in the African Violet（非洲紫罗兰） 、 分化等有很好的促进作用、 核酸? 在大规模生产时。2。2?主要有?形式?形式、 细胞色素氧化酶.1×105 Pa） ， Mn、 叶绿素?VB6(盐酸吡哆醇)。。； S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分?Vc（抗坏血酸） ?有机营养成分?微量元素： 蔗糖.5mmol／ L ？?形式： 对碳水化合物合成?维生素：（一） 无机营养成分＞0? 丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化。 培养基中的铁对胚的形成。? 在糖类的相互转化中起重要作用， 也没有根和愈伤组织产生在外植体上表面边缘产生芽， 对植物组织培养物的生长也有良好的促进效果? 作用： 植物代谢和胚的发育有一定关系.5mmol／ L＜0?碳源?形式?Vpp(烟酸)?作用、 生物碱等的组成成分。 高压灭菌时.0mg／L?作用： NO3—N和NH4—N?B、 过氧化氢酶?作用、 B?一般用量为0。： （二） 有机营养成分：?作用。?作用.5～4?无机营养成分。： 愈伤组织的产生和生活力有重要作用、 VB12等， 对细胞分裂， 能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成?是叶绿素形成的必要条件：?浓度?作用， 为细胞提供合成新化合物的碳骨架： KH2P04或NaH2P04。?生物素： Mg是叶绿素的组成成分、 转移?大量元素， 可支持许多组织很好的生长、 碳源 蔗糖 （0%）蔗糖含量（ 1%）蔗糖含量（ 5%）外植体完全被绿色的芽所包裹? 对组织和细胞的繁殖。?Mg。1? 同时维持一定的渗透势： KCI， Cu?作用?使用浓度一般为l00mg／ L ?肌醇（环己六醇）。? 是很好的有机氮源?VBl(盐酸硫胺素)

MS培养基的配制包括以下步骤。培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。

MS培养基的配制步骤

植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基。

编辑本段MS培养基的配制步骤

这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。

大量元素(母液Ⅰ) mg/L NH4NO3 33 000 KNO3 38 000 CaCl2·2H2O 8 800 MgSO4·7H2O 7 400 KH2PO4 3 400

微量元素(母液Ⅱ) KI 166 H3BO3 1 240 MnSO4·4H2O 4 460 ZnSO4·7H2O 1 720 Na2MoO4·2H2O 50 CuSO4·5H2O 5 CoCl2·6H2O 5

铁盐(母液Ⅲ) FeSO4·7H2O 5 560 Na2-EDTA·2H2O 7 460

有机成分(母液Ⅳ)ⅣA 肌醇 20 000 ⅣB烟酸 100 盐酸吡哆醇(维生素B6) 100 盐酸硫胺素(维生素B1) 100 甘氨酸 400

以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。

上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。

母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5?5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。

MS培养基中还需要加入：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄基嘌呤(6-BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0?1 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6-BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0?1 mg/mL的母液。

配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4?D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。

编辑本段MS培养基配制培养液时的注意事项

配制培养液时应注意： ①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制； ②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次； ③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。 需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培养基，可分装25～30瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸(每块大小约为9 cm×9 cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。

第一种 DMEM(A) 细胞培养基(粉末型)成分

序号 化合物名称 含量 (mg/L) 序号 化合物名称 含量 (mg/L)

1 无水氯化钙 .2H 2 O 265.00 18 L-丝氨酸 42.00

2 硝酸铁 .9H 2 O 0.10 19 L-苏氨酸 95.00

3 氯化钾 400.00 20 L-色氨酸 16.00

4 无水硫酸镁 97.67 21 L-酪氨酸 72.00

5 氯化钠 6400.00 22 L-缬氨酸 94.00

6 无水磷酸二氢钠 109.00 23 D-泛酸钙 4.00

7 丁二酸 75.00 24 酒石酸胆碱 7.20

8 丁二酸钠 100.00 25 叶酸 4.00

9 L-盐酸精氨酸 84.00 26 肌醇 7.20

10 L-盐酸胱氨酸 63.00 27 烟酰胺 4.00

11 甘氨酸 30.00 28 核黄素 0.40

12 L-盐酸组氨酸 42.00 29 盐酸硫胺 4.00

13 L-异亮氨酸 105.00 30 盐酸吡哆辛 4.00

14 L-亮氨酸 105.00 31 葡萄糖 1000.00

15 L-盐酸赖氨酸 146.00 32 丙酮酸钠 110.00

16 L-甲硫氨酸 30.00 33 酚红 9.30.00

17 L-苯丙氨酸 66.00

第二种 DMEM(H) 细胞培养基(粉末型)成分

序号 化合物名称 含量 (mg/L) 序号 化合物名称 含量 (mg/L)

1 无水氯化钙 200.00 17 L-丝氨酸 42.00

2 硝酸铁 .9H 2 O 0.10 18 L-苏氨酸 95.00

3 氯化钾 400.00 19 L-色氨酸 16.00

4 无水硫酸镁 97.67 20 L-酪氨酸钠盐 104.00

5 氯化钠 6400.00 21 L-缬氨酸 94.00

6 无水磷酸二氢钠 125.00 22 D-泛酸钙 4.00

7 L-盐酸精氨酸 84.00 23 氯化胆碱 4.00

8 L-盐酸胱氨酸 63.00 24 叶酸 4.00

9 L-谷氨酰胺 584.00 25 肌醇 7.20

10 甘氨酸 30.00 26 烟酰胺 4.00

11 L-盐酸组氨酸 42.00 27 核黄素 0.40

12 L-异亮氨酸 105.00 28 盐酸硫胺 4.00

13 L-亮氨酸 105.00 29 盐酸吡哆辛 4.00

14 L-盐酸赖氨酸 146.00 30 葡萄糖 4500.00

15 L-甲硫氨酸 30.00 31 丙酮酸钠 110.00

16 L-苯丙氨酸 66.00 32 酚红 15.00

中华人民共和国国家标准

GB 14751-2010 食品添加剂维生素B1(盐酸硫胺)

GB 7295-87 饲料添加剂维生素B1(盐酸硫胺)

GB/T 5009.197-2003 保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定

盐酸硫胺

维生素B1（Vitamin B1，Thiamine）

性状：盐酸硫胺素（维生素B1盐酸盐 59-43-8）为白色针状结晶粉末，有微弱的类似米糠的气味，味苦，无水干燥品在空气中迅速吸收水分（4%）。熔点246～250℃。对热稳定（170℃），易溶于水，微熔于乙醇。不溶于苯和乙醚。在室温下，亚硫酸盐可使本品分解为嘧啶和噻唑。氰化高铁，如高铁氰化钾可将其氧化成具有蓝色荧光的脱氢硫胺素即硫色素，据此可判定硫胺素的含量。

用途：营养增补剂。维生素B1在体内参与糖类的中间代谢。机体内维生素B1 不足，辅羧化酶活性下降，糖代谢受阻，从而影响整个机体代谢过程。其中丙酮脱羧受阻，不能进入三羧酸循环，不继续氧化，在组织中堆积。这时，神经组织供能不足，于是可出现相应的神经肌肉症状，如多发性神经炎，肌肉萎缩和水肿，严重时还可以影响心肌和脑组织的功能。维生素B1不足还会引起消化不良，食欲不振和便秘等病症。

制备方法：天然品存在于米糠、胚芽、酵母及豆类等中，可由米糠或酵母水解后提取得到。合成法方法甚多。可由4-氨基-2-甲基-5-乙酰氨甲基嘧啶经水解、加成缩合、环合水解、氧化、置换等步骤制得。

低聚半乳糖：改善人体肠道的消化吸收功能。

柠檬酸钾：稳定剂和pH缓冲剂。

磷酸三钙、碳酸钙：人体钙质来源。

氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、碘化钾、亚硒酸钠：钠、钾、镁、硫、铁、锌、铜、锰、碘、硒来源。

棕榈酸维生素 A：维生素A来源。

盐酸硫胺素：维生素B1来源。

核黄素：维生素B2来源。

烟酰胺：维生素B3来源。

D-泛酸钙：维生素B5来源。

叶酸：维生素B9来源。

氰钴胺：维生素B12来源。

L-抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯:维生素C来源。

维生素D3：维生素D3来源。

左旋肉碱：维生素BT来源。

花生四烯酸油脂：花生四烯酸来源。

二十二碳六烯酸油脂：DHA来源。

核苷酸：DNA和RNA的基本组成单位。

牛磺酸：β-氨基乙磺酸来源。

肌醇：肌糖来源，动物、微生物的生长因子。

叶黄素：优良的抗氧化剂，能抵御游离基在人体内造成细胞与器官损伤。

β-胡萝卜素：β-胡萝卜素来源。