在基因进行PCR扩增过程中涉及到哪些要素？其中哪些因素决定了PCR的效率？
预变性
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间
变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。
引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
循环数
大多数PCR含25-35循环。
最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。——————————————————————————————————————————
如果进行PCR首先确定的是底物的纯度，苯酚有报道称会印象PCR过程。
引物就不多说了，退火温度对PCR的特异性有较大影响。延伸时间要看扩增片段长短，循环数不能太多要不非特异性扩增太多。
我把我本科 的实验体系给你，你参考下。
（1） 最佳DNA模板量
在PCR扩增系统中DNA模板的纯度和数量都会对结果产生影响。模板DNA抽提纯化不彻底残留苯酚，乙醇等物质将无法准确的扩增出预期结果；模板DNA用量过低会使扩增过程不完整，出现产物少，条带弱的结果；模板DNA用量过高又会出现非特异条带增多，背景弥散状[106]。本实验结果表明模板量在20ng-100ng间条带都比较清晰，差异不大。从节约最优原则考虑选择20ng模板量（图3-9-a）。
（2）最佳Mg2+浓度
Mg2+浓度为2.0mmol/L时，所扩增的条带数最多，而且比较清晰，综合考虑本实验最佳Mg2+浓度定位2.0mmol/L。
（3） 最佳Taq酶浓度
在25µl的反应体系中2UTaq酶用量最优。条带清晰，且数目较多。
（4） 最佳dNTP浓度
本实验设定的5个dNTP梯度扩增结果看200μmol/L时条带最清晰选为最佳浓度（图3-9-d）。
（5） 最佳引物浓度
本实验引物浓度选取0.2μmol/L（图3-9-e）。
（6） 最佳退火温度
本实验发现反应体系退火温度为52℃时，
DNA中会影响PCR过程的杂质有：
若提取DNA时某些杂质如DNAase、RNAase、RNA等会对PCR产生影响。
另外Taq酶、镁离子、DNTP也会产生影响。
酚、氯仿、SDS、蛋白酶、蛋白等。
标准的PCR过程分为三步：
DNA变性
（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
退火
（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。
实验步骤
实验原理
1 所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。 去除RNA酶（外源）的影响。 高温灭菌两次可以破坏RNA酶的复性过程.虽然RNA酶极易复性，但两次连续的高温会打乱它的复性历程，从而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合，从而使RNA酶失活。 因为DEPC能与RNA的N结合，从而修饰RNA，所以，必须将DEPC最终除去。在高温灭菌时，DEPC因高温分解而挥发。（UV也能修饰RNA，实验时应避免。） DEPC灭菌后称为DEPC水，它是不含DEPC的。 实验过程中要勤换手套，必要时要在超净工作台中进行。
2 在一灭菌2mL管中加入: 5mol/L异硫氰酸胍 0.7mL 苯酚 0.4mL 2mol/L NaAc(pH4.0) 0.1mL 必须提前准备好变性剂。 异硫氰酸胍可以变性RNA酶，也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以是RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有机相（酚相）中，而在碱性条件下，DNA和RNA都在水相中，无法分离，所以，Ph在本是严重很关键。 苯酚用于抽提DNA和蛋白质。
3 称取0.2g小麦黄化苗的叶片，迅速在液氮中研磨成粉末,转入已准备好的离心管中。 剧烈震荡。 低温防止内源性RNA酶降解RNA。 剧烈震荡是使所有的细胞散开，浸在变性剂中。低温的细胞在相对来说高温的液体中是会形成一团，这样就会使内部的RNA没有水解RNA的机会。 小麦的黄化苗因为没有光合作用，所以含糖少，易于抽提。
4 混匀,冰浴30min。
5 4℃,12000rpm,10min。
6 上清至另一离心管中 加0.4Ml氯仿，剧烈震荡。冰浴放置5min。 去脂类。
7 40C,12000rpm,10min。
8 弃有机相（下层） 加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室温放置5min。 去脂类和蛋白质。
9 40C,12000rpm,10min 弃有机相，加入等体积异丙醇。-200C放置1h。 去糖，脱水。因为体系高盐（2mol/L NaAc），所以可以使RNA沉淀。
10 40C,12000rpm,10min 沉淀用70%乙醇洗两次。 因为提出的量很少，可能不可见，所以离心是要有方向标记。
11 室温稍干燥。 RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。
12 沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存) DEPC水中不含RNA酶。
13 RNA电泳： 1％琼脂糖胶20 mL 8μL样品 1μL样品缓冲液 1μLSYBR 100V恒压电泳 测OD260和OD260／OD280
相信大家在做PCR反应时总能遇到这样或是那样的问题，但多数都可以归为两个主要问题：
使用添加剂是解决这些问题的常用策略之一。通常添加剂的作用有两方面：
今天我就简单给大家介绍一下PCR反应中常见的添加剂以及它们的作用。
二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）
DMSO可以降低DNA的二级结构，所以通常在扩增GC含量很高的基因样本的时候都会添加。但是，DMSO 也会大大降低Taq 聚合酶（Taq polymerase）的活性（activity）。所以，大家要权衡好模板的接近率（template accessibility）和聚合酶的活性。我建议大家可以尝试不同的DSMO的浓度，例如从2% 到10%，来找出适合自己实验的浓度。
非离子性洗涤剂（Non-ionic detergents）
非离子性洗涤剂，例如0.1-1% 的Triton X-100, Tween 20 或是NP-40，通常可以降低DNA二级结构。虽然这样可以增加模板基因的扩增，但也会带来非特异性扩增的困扰。所以，这些添加剂对无杂物低产量的PCR反应很管用，但对相对不太纯的PRC反应就没那么好了。非离子性洗涤剂的另外一个好处就是可以减少SDS 污染。通常在DNA提取过程中，SDS会被带到PCR这个步骤，这就大大抑制了聚合酶的活性。所以，反应中加入0.5% 的Tween-20 或是Tween -40 可以中和SDS带来的负面影响。
甜菜碱（Betaine）
甜菜碱可以通过减小二级结构的形成来提高DNA的扩增，并且一般是商用PCR kit的“神秘”添加物。如果大家要用甜菜碱的话，应该放甜菜碱或是一水甜菜碱（Betaine or Betaine mono-hydrate），但不是盐酸甜菜碱（Betaine HCl）, 调成最终浓度为1-1.7M 的浓度。甜菜碱还可以帮助提高特异性，因为它能消除DNA融化/变性时对碱基对的依赖（eliminate the base pair composition dependence of DNA melting/DNA denaturation） 。
甲酰胺（Formamide）
甲酰胺是一种常用的有机PCR添加剂。它可以和DNA中的大沟（major groove）和小沟（minor groove）相结合，从而降低母版DNA双螺旋的稳定性并且减低DNA的解链温度（melting temperature）。甲酰胺在PCR实验中使用的浓度通常在1%-5%。
四甲基氯化铵（Tetramethyl ammonium chloride，TMAC）
四甲基氯化铵可以增加杂化的特异性（hybridization specificity）并且提高DNA的解链温度。因此，TMAC 可以去除非特异性的启动，并且减少DNA和RNA的错误结合。如果大家在PCR反应中使用简并引物（degenerate primers）时，记得可以添加TMAC，它常用的使用浓度为15-100mM。
其他常见的添加剂
除了以上提到的两大类添加剂，PCR反应中还有许多常见的添加剂，虽然作用不同，但也至关重要。
镁离子（Magnesium ion）
镁离子是聚合酶不可缺少的一个辅因子（cofactor），也就是说如果没有镁离子的话，聚合酶是没有活性的。但是，过多的镁离子同样也会影响聚合酶的工作效率。每种PCR反应中镁离子的浓度都不尽相同。螯合剂（Chelating agents，例如EDTA 或是 citrate）, dNTP 的浓度和蛋白质都会影响镁离子的浓度。所以，如果你的PCR实验有问题，可以尝试改变不同的镁离子浓度，例如从1.0到4.0mM，中间间隔 0.5–1mM 就可以。
值得注意的是，多次冻融循环能够导致氯化镁溶液（magnesium chloride）的浓度分层。所以大家在每次使用之前一定要完全溶解，并且混合均匀之后再使用。
牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）
在分子化学实验中，牛血清白蛋白是很常见的添加剂，尤其在限制酶酶切和PCR的实验中。在PCR反应中，BSA 对于减少污染物，例如酚类化合物（phenolic compounds）有一定帮助。而且也有说法是它能减少反应物附着在试管壁的情况。在PCR反应中，通常BSA添加的浓度可达到0.8 mg/ml。
原文链接：
PCR反应中各种添加剂的作用（上） - BioEngX
PCR反应中各种添加剂的作用（下） - BioEngX
此外影响PCR的因素还包括了引物的设计效果，引物会直接定位到目的基因的两端并且有增加限制酶识别位点的效果。如果设计的完善，能够迅速的实现目标，而节省了时间和金钱。反之则会浪费时间和金钱。影响反应的第3个因素是4种脱氧核苷酸的用量，如果量没有达到足够多的比例和数量，则会严重的制约PCR的循环反应，导致反应被迫中断。
为了数据的重复性起见，还是建议去除掉模板中的蛋白再进行定量PCR吧。
获取一个基因CDS序列的方法如下：
打开NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了）
然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图）
点击CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。
由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物，例如：!
正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向，一般不会从3’到5’，所以我们的CDS虽然没有注明方向，但是其实也是5’到3’。
虽然可以这么简单粗暴的设计引物，但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下图，首先点击File->New->DNA Sequence，
然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。
下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。
点击左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense
如果对现在的引物不满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们删除掉末尾三个碱基，之后需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。
最后点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便。
这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。
Primer 5的使用
根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。
从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择，那是不是每个位点都可以用呢？当然不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的基因）本身没有的酶切位点！
所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。
还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不可以选，其他的都可以选。
不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。
于是我们得到如下引物：
好了，我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。
质粒构建
终于到正题了！
待引物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到 100 μM 作为母液，取一些稀释到 10 μM 做下一步实验了。
首先我们P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体系及反应条件如下图：
模板的获取
PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切，同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址 http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶切所用的最佳Buffer。
酶切回收之后的片段进行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下：
现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成，不过我保险起见，一般连接30 min， 切勿连接过夜！
连接完成之后便是转化，挑菌（单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比较稳定且广泛应用的，当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注意事项及原理
注意事项：
1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又会迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。提取RNA时使用专门的RNase-free的枪头和离心管。
2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗！
溶液配方及原理：
1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞内含物的同时保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
2、氯仿：氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。
3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。
操作步骤
1、细胞破碎
A、组织：按1 mL/50~100 mg组织样品的比例向打散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过TRIzol体积的10%。
B、贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪反复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污染。
C、悬浮细胞：悬浮细胞离心收集后，直接按1 mL/5~10×106个细胞（动物、植物或酵母）的比例加入TRIzol试剂。加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造成mRNA的降解。
如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2℃~8℃，12000×g离心10 min去除这些物质。
关于TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量：
一般情况下，根据细胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅供参考）
2、氯仿抽提分层
加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过高否则会导致RNA断裂。离心后液体分为三层，下层为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的水相。RNA在上层水相中，水相的体积约为加入的TRIzol体积的60%。
3、用异丙醇使RNA沉淀
将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机相。
加入与水相等体积的异丙醇，室温孵育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底，为无色胶状。
4、用乙醇洗涤去除残留的蛋白质和无机盐
去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。
5、用DEPC水溶解RNA
去除上清后，将管子敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉淀变成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解。根据后续实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。
逆转录法合成cDNA
一般逆转录（也可称作反转录）都有现成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作，问题都不大，在这里我就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。
Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。
Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
两种引物可据实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物。
操作步骤
步骤简述如下：按照下图中1配制溶液，然后65℃处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。
连接产物的转化
常用的感受态细胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α，可以自己制备也可以购买商业化的感受态。
ABOUT Transformation
注意事项
1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感受态转化效率最高；
2. 避免反复冻融感受态细胞；
3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸；
4. 感受态和连接产物（或质粒）用量要适中，并不是越多越好。
操作步骤
1. 取50 μL感受态细胞置于冰上融化；
2. 加入5 μL连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可），混匀，置于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）；
3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上静置2 min；
4. 加入500 μL无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使细胞复苏；
5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取少量LB（50 μL左右），重悬沉淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应抗生素）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质粒：直接取20 50 μL涂于LB培养板上培养即可。
质粒的小量提取
ABOUT 质粒抽提
实验原理：
较常用的质粒提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（<15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（>15kb）。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法，其原理为：当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。
实验试剂（试剂盒试剂配方不清楚，以下配方见《分子克隆实验指南》）
1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除质粒中混有的RNA，其不受EDTA的影响。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸
原理：这一步的K+置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。
操作步骤
1、将过夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽量吸除上清。若暂时不提取，可将沉淀保存于-20℃，也可直接将菌液保存于4℃（短时间）。
注意：如果菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
2、柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。
注意：若柱子放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。
3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用量也应成比例增加），并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作（不然P1+P2+P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时可过同一个吸附柱。
注意：菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。另外，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min，以免超过时间。但是时间也不可过短，以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。
注意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5、向离心管中加入700μl溶液P3（记得冰上预冷），立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的离心管中，以免沉淀飘起。
注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μl）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
7、可选步骤：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步省略。
8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。
9、重复操作步骤8。
10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃预热），室温放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中．重复步骤
11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率，但也不应过大，以免所提质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。
结果判断
1、使用紫外分光光度计对质粒浓度及纯度进行测定
（1）检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能是蛋白质污染，偏高则可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。另外，测出来的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度和纯度不准确。
（2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样（如样品为2μl所提质粒+48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液+48μl ddH2O）。
2、酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测
（1）选用合适的内切酶对所提质粒进行酶切，并与未切质粒及转化用原质粒一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切结果及所提质粒与原质粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为目的质粒。
（2）所提质粒（未酶切）的电泳条带可能为一条带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口（保持环状，失去超螺旋），或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的，因此会出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。
测序结果的分析
构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。
可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即送菌液返还他们抽提的质粒）。
测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下：
在公众号内回复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！
测序结果返回之后我们就可以分析测序结果了。
一般常用的序列比对软件有DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大家可以根据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。
DNAMAN
1. 首先打开软件，左侧数字为各个通道的编号，每个通道只能载入一个序列：
2. 然后点击File->New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl+A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。
3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File->Open打开测序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence->Multiple Sequence Alignment；
4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列的通道，点击OK即可：
5. 后面基本是一直点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands：
6. 然后一直下一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突变，如果是即质粒序列正确。
Chromas
1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File->Blast Search:
