水溶性荧光探针磺酸基/季铵盐/羧基/聚乙二醇修饰BODIPY化合物

可以合成BODIPY的单体，二聚体，三聚体和聚合物以及单体和二聚体aza-BODIPY。二聚体和三聚体的合成是BODIPY核心结构的2/6位与 FeCls之间氧化耦合得到的。其电化学测试结果表明了从单体到juji体，活性单元的数量与电化学峰的数量的之间的关联性。循环伏安法曲线明确了上述关联性之间的相互作用，并且连续峰之间的但是分裂由单体到二聚体到三聚体不断增加。每两个氧化峰之间的间隔均大于还原峰之间的间隔。该现象对于aza-BODIPY的单体和二聚体均适用。这些聚合物的合成及其电化学和光谱性质为新型低聚合染料的开发提供了新思路。BODIPY 和aza-BODIPY的二聚体和三聚体的结构如图所示。

相关BDP染料：

荧光探针BODIPY—O-CMC—cRGD[O-羧甲基壳聚糖(O-CMC)]

水溶性荧光探针磺酸化BODIPY

水溶性荧光探针BODIPY偶联季铵盐

BODIPY-PEG

BDP-L-COONHS

BDP-L-CO-Gly(含甘氨酸)-NHS

BDP-L-C5COONHS

BODIPY—O-CMC-cRGD/porphyrin聚合物纳米粒子

BODIPY—O-CMC—cRGD/BODIPY2纳米粒子

芘乙炔基修饰BODIPY染料

双边苯乙烯修饰BODIPY荧光染料

亲水性多甘醇单甲醚修饰BODIPY探针

纳米级近红外BODIPY-Mn(III/IV)聚合物探针

检测SNAP标记混合蛋白局部微粘度敏感型探针BG（鸟嘌呤）-BDP

Hg2+探针BDP-丙二硫醇

生物荧光探针HFBI（疏水蛋白）修饰BDP

SiO2负载BODIPY/ESCP-Fe-NMOF纳米颗粒

纳米颗粒聚乳酸-聚乙二醇-叶酸(PLA-PEG-FA聚合物包裹BODIPY

水溶性荧光纳米微胶囊探针聚乙二醇-聚乳酸(mPEG-PDLLA）包裹近红外BODIPY荧光染料

近红外pH敏感型纳米颗粒探针氧化石墨烯(GO)修饰BODIPY

二氧化硅纳米颗粒负载萘酰亚胺(NP)-BODIPY探针

半乳糖修饰氮杂BDP荧光探针

水溶性K+荧光探针BDP-TAC(三氮杂环配体)-NHS-Dextran

pH敏感型两性离子探针离子型磺基三甲铵乙内酯（PDMA）修饰BDP

DSPE-PEG2000-MAL-RGD偶联BDP

近红外三聚茚基共轭双BODIPY类荧光染料

小分子探针BDP-4Br（溴）

两亲性的聚多肽P(OEGMA)21-P(Asp)16包裹疏水性BDP-4Br探针胶束

NHS-BODIPY-2Br偶联pH敏感聚多肽纳米颗粒

氟化聚多肽纳米颗粒负载光敏剂(BODIPY-2Br)

三苯基膦(TPP)负载碘化光敏剂(BDPI)纳米颗粒(PBDPI-TPP)

疏基类荧光标记试剂1,3,5,7-四甲基-4-苯基-(4-碘乙配胺)-BODIPY(TMPAB-I)

3，5-二芳基乙烯共轭BODIPY染料

3，5二苯乙烯基BODIPY染料

炔基修饰BODIPY染料

呋喃偶联BODIPY染料

噻吩偶联BODIPY并环产物染料

蒽基修饰BODIPY染料

寡聚噻吩修饰BODIPY染料

四苯基氮杂BODIPY

瑞禧我cb22.4.15

遗传图是随染色体部分连锁的发现而发明的。

一条染色体上有许许多多的基因，减数分裂中同源染色体分离，一条染色体上的基因在理想状态上应一起分配给配子，然而事实并非如此。因为在减数分裂第一次分裂前期染色单体会发生断裂以及DNA片段的交换，从而发生染色体的部分连锁现象。测序发明以前，基因连锁或部分连锁都是通过表型观察确定的。

对于部分连锁，人们早期通过表型发现 不同基因间 连锁发生的频率有差异。于是摩尔根的学生Arthur Sturtevant假设染色单体特定位点交换是一个随机事件，在一对并列的染色单体的任何位置发生交换的概率是相同的。基于以上假设，相邻的两个基因由于交换而分开的概率将低于距离较远的两个基因（因为相邻基因即便交换也更偏向于一起）。进一步说，基因间因交换而失去连锁的概率与它们在染色体上的距离成比例。因此用重组频率（recombination frequency）可衡量两个基因间的距离。通过计算不同基因对之间的重组频率，就能构建出显示基因在染色体上相对位置的图（遗传图）。

遗传图的缺陷： 遗传图的分辨率依赖于所得到的交换数目 。对于人类及其他大多数高等真核生物来说，不可能获得巨大数量的后代由于遗传学研究。 遗传图的准确率有限 。Sturtevant的假说认为交换在染色单体上随机发生，但由于重组热点的存在，使这一假说不完全正确。为获取更精确的基因组图谱，物理图的绘制方法被发明出来。其中最重要的为： 限制性作图（restriction mapping）、荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）、序列标记位点（STS）作图（sequence tagged site mapping） 。

该方法的基本思想是比较一个DNA分子被两种识别不同靶序列的限制酶切割所产生的片段的大小，切割产物可用电泳检测（图1）。对于无法确定顺序的片段，可通过 部分限制性酶切 （partial restriction）的方法产生一套含有部分消化的产物，以此分析片段的可能排序。还有一种改进的方法（图2），即在部分消化前将放射性或其他类型标记物加到要分析的DNA分子两端，于是在荧光指导下对可见酶切片段进行排序，简化了部分酶切的筛选流程。

限制性作图的规模受限于限制性片段的大小 。由于限制性位点在DNA序列中多而密集，使得消化产物在琼脂糖凝胶中重叠或发散。因此限制性作图最适用于小分子。当然也可依靠某些“ 稀有酶 ”进行切割，获取较小数量的片段。如能特异性识别7个或8个核苷酸的 Sap I、 Sgf I。对于GC含量为50%的DNA分子，这些7核苷酸酶平均每4^7=16384bp有一个切点。除“稀有酶”外，还有某些特异性序列对人类基因组而言存在较少，利用这类序列相对应的限制性内切酶进行切割，也能获得类似的结果。

由于使用“稀有酶”制作长序列片段，普通的电泳无法胜任对它们的分离工作，因为长片段容易缠绕，分子间作用更频繁。为此，必须使用更复杂的电场代替普通的线形电场。例如， 正交变电场凝胶电泳 （orthogonal field alternation gel electrophoresis, OFAGE）等。

除电泳外，还可利用其它方法对DNA分子的限制性位点作图。可以通过直接在显微镜下观察检测限制性酶切位点，这一技术称为 光学作图 （optical mapping），常用的两种方法是 凝胶拉伸 （gel stretching）与 分子梳理 （molecular combing）（图3）。制作好的DNA纤维，利用荧光染料染色，再用限制性酶切割，通过荧光显微镜便可观察到切口的相对位置。

与光学作图类似，FISH能够直接显示标记序列在染色体或伸展的DNA分子上的位置。在FISH中，标记物是一段DNA序列，通过用荧光探针与其杂交而显现出来。应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对，以使其形成单链分子（即DNA“变性”），只有这样才能形成杂交。 使染色体DNA变性而不破坏其形态的标准方法是将染色体在载玻片上干燥，再用甲酰胺处理 。

如果探针是长的DNA片段，便可能存在一些重复的DNA序列（DNA序列中间隔存在的串联或非串联重复片段），因此探针可能与染色体上的多个位点杂交，而不仅仅发生在其精确匹配的特异性位点上。为降低这种非特异性杂交，探针在使用前要与来自被研究组织中的未标记DNA混合，于是加入富含重复序列的片段，来锁闭探针中的重复序列。这样，便使得原位杂交反应完全由单一的序列驱动。

一次FISH实验仅能获得不超过3个或4个标记的图谱位点，数据积累慢，耗时长。因此，要使详细的物理图谱成为现实，需要更有效率的技术。目前最有效的作图技术，也是能对大型基因组产生最详尽图谱的技术，是 STS作图 。一个序列标记位点（STS）是一段短的DNA序列，通常为100-500bp，易于识别，且在拟研究的染色体中仅出现一次。完成一套STS图谱需要收集来自单条染色体或一个完整染色体或基因组的重叠的DNA片段。

其基本原理如下图所示（图5）。在收集作图必需的数据时，需排列每一个STS，了解哪些片段包含有哪些STS。这些可以通过杂交分析来完成，但通常会使用PCR的方法，因为PCR更快捷。具体方法为将研究所用的DNA随机打断（需有6套一致的DNA片段供打断），然后依次采用单个STS检测它们所在的DNA片段，其中STS为人工合成并带有荧光标记，通过PCR在含有STS配对的片段上延伸。若两个STS距离足够近，那么它们出现在同一片段的概率将较大，利用荧光显微镜可以在多条片段上观察到间隔一致的两个标记。反之，两个标记距离越远，位于同一片段的概率就越小。实际上，与连锁分析计算图距的方式类似，STS图距是根据 分离频率 计算的，而不是观测到的影像距离，因为距离相近的标志物利用信号的有无作频率判别的依据较距离观测更容易、也更精确。基于此，以STS为物理标志的物理图谱得以完成。

以上过程留有两个需要补充说明的问题。

第一关于 STS的选择 。任何一个唯一的DNA序列均可作为STS，但需满足两个条件。首先， 它的序列必须是已知的 ，以便用PCR方法检测该STS在不同DNA片段中存在与否。其次， STS必须在拟研究的染色体上有唯一的定位 ，如果是多拷贝，将无法准确获取各标志物间的物理距离。

第二关于 STS作图的DNA片段 。其一来源是像前面所说的通过随机打断构建的文库。打断全DNA目前常用两种方法： 超声打断 和 酶打断 。超声打断一般使用的仪器为Covaris系列，酶打断可用片段化酶。这种随机打断的序列片段拥有重叠区，因而能组成克隆重叠群（clone contig），从而具备构建克隆文库的条件。只需将随机片段克隆到适当载体上，便制成了多个克隆文库的集合（起初有几套DNA就有几个克隆文库）。反之若拥有目的DNA的 克隆文库 ，与支持测序工作一样，它们也可用作STS分析。第二种来源是 放射杂交体 （radiation hybrid），这是种含有其他生物体染色体片段的啮齿类动物细胞。这项技术首先发展于20世纪70年代，当时人们发现将人类细胞暴露于3000-8000拉德剂量的X射线中，会使染色体随机断裂成碎片，放射剂量越大，产生的片段越小。这种处理对人类细胞是致死的，但若将瘦果照射的细胞与未经照射的仓鼠细胞或其他啮齿类细胞融合后，染色体碎片可以传递给后者。可利用化学试剂（如聚乙二醇）处理或暴露于仙台病毒中促进两种细胞融合。这种方法为STS作图提供所需的DNA片段，在人类基因组计划作图阶段发挥了重要作用。但实验对象似乎集中于动物。

总言之，基因组图谱绘制的方法多种多样，可以说各种图谱所能反应的DNA信息各不相同，各有其独到之处。例如STS图谱最为精确，但仍可能未包括所有的限制性位点，且其定位的DNA片段没有针对性，而限制性图谱则能将有用的限制性位点进行精准标定，尽管其要实现大序列片段的标定较为困难。又荧光原位杂交所得图谱较STS作图更直观，也更具针对性，操作不算复杂。与物理图谱相比，遗传图谱出现较早，精度与分辨率不高，但其绘图思想为STS作图提供思路，即凭借表型显隐性或信号的有无，计算频率，绘制图谱。

基因组图谱绘制有什么用？这在上述技术发明的初期恐怕未能明了。但随DNA测序的提出，以及不再是遥不可及的概念时，人们意识到基因组图谱能为测序提供框架。这是因为高等真核生物全基因组往往存在大量的重复区域，简单的重叠区拼接会在这些区域发生错位。因此事先绘制的图谱中，覆盖全基因组的各类标志物，无论是基因、限制性位点、STS位点等都能发现并对错误进行校正，基因组图谱能为后续基因组拼接与组装提供极大便捷。此外，将测序结果与基因组图谱结合，能将基因及其他有意义的特征定位于DNA序列中，以便后续开展限制性酶切、功能分析、遗传诊断等各方面的研究。早期对不同序列位点的研究成果积累，以及测序技术发展后对不同类群模式物种及相关物种全基因组序列的获取，才得以掌握大量基因组、转录组的信息。

既然基因组图谱能为所测序列的拼接组装提供参考，那么作图是测序的必要前提吗？关于这个问题，待更新至测序相关篇章时再做解答较合适。但就目前已知，小基因组的测序如细菌等，运用鸟枪法便能完整拼接，无需通过图谱校正。

[1] T. A. 布朗. 基因组3[M]. 第一版. 北京: 科学出版社, 2009.

[2] 田雨. 基于单拷贝序列的桑树染色体荧光原位杂交分析[D]. 西南大学, 2021. DOI:10.27684/d.cnki.gxndx.2021.002123.

生物知识点

组成生物体的化学元素⑴最基本的元素是C，基本元素有C、H、O、N，主要元素有C、H、O、N、P、S。.⑵P是核酸、磷脂、NADP+、ATP、生物膜等的组成成分，参与许多代谢过程。.血液中的Ca2+含量太低，就会出现抽搐，若骨中缺少碳酸钙，会引起骨质疏松。.K+对神经兴奋的传导和肌肉收缩有重要作用，当血钾含量过低时，心肌的自动节律异常，并导致心律失常。.K+与光合作用中糖类的合成、运输有关。

.水自由水和结合水比例会影响新陈代谢，自由水比例上升，生物体的新陈代谢旺盛，生长迅速。.相反，当自由水向结合水转化时，新陈代谢就缓慢。

生命的物质基础和基本单位。

化学物质与蛋白质的相互作用 化学物质与蛋白质的的沉淀作用 沉淀作用的类型 可逆沉淀 定义： 在温和条件下， 通过改变溶液的 pH 或电荷状况， 使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 蛋白质在沉淀过程中， 结构和性质都没有发生变化， 在适当条件下， 可以重新溶解形成溶液， 所以这种沉淀又称为非变类型： 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法， 如等电点沉淀法、 盐析法和有机溶剂沉淀法等。 不可逆沉淀 定义： 在强烈沉淀条件下， 不仅破坏了 蛋白质胶体的溶液的稳定性， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质， 产生的蛋白质沉淀不可能再溶解于水。 由于沉淀过程中发生了蛋白质结构和性质的变化， 所以又称为变性沉淀。 类型： 加热沉淀、 强酸碱沉淀、 重金属盐沉淀等 沉淀剂的类型 无机物沉淀 盐析 定义： 低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度， 此现象叫盐溶。 继续向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、 硫酸钠、 氯化钠） 使蛋白质沉淀析出的现象叫做盐析（水与离子的相互作用增加了蛋白质表面的疏水补丁的相互作用； 同时瓦解了 以电荷为基础的蛋白质分子之间的作用） 。 盐析方程： lgS=lgS0-KSI S0 -离子强度为零时的溶解度 S-蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度 KS -盐析常数 第一类： Mn2+、 Fe2+、 Co2+、 Ni2+、 Cu2+、 Zn2+、 Cd2+,能和蛋白质分子表面的羧基、氨基、 咪唑基、 胍基等侧链结合 第二类： Ca2+、 Ba2+、 Mg2+、 Pb2+、 能和蛋白质分子表面的羧基结合， 但不能和含氮化合物结合 金属离子沉淀法 第三类： Ag2+、 Hg2+、 Pb2+、 能和蛋白质分子表面的巯基等侧链相结合 优点： 在稀溶液中对蛋白质有较强的沉淀能力。 处理后残余的金属离子可以用离子交换树脂和螯合剂除去。 等电点沉淀 定义： 在低的离子强度下， 用无机或有机酸碱调 PH 至等电点， 使蛋白质所带静电荷为零， 能大大降低其溶解度。 （适用于巯水性较强的蛋白质。 ） 主要优点： 很多蛋白质的等电点都在偏酸范围内， 而无机酸通常较廉价， 并且某些酸， 如磷酸、 盐酸、 和硫酸的应用能为蛋白质食品所允许。 同时， 常可直接进行其他纯化操作， 无需将残余的酸除去。 主要缺点： 酸化时易使蛋白质失活， 这是由于蛋白质对于低 PH 比较敏感所致。 有机物沉淀 优点： 溶剂容易蒸发除去， 不会残留在成品中， 因此适用于制备食品蛋白质。 而且有机溶剂密度低， 与沉淀物密度差大， 便于离心分离。 原理： 加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生多种效应， 这些效应结合起来使蛋白质沉淀。 主要效应是水活度的降低。 （最常用的溶剂是乙醇和丙酮） 有机溶剂 缺点： 容易使蛋白质变性失活， 且有机溶剂易燃、 易爆、 安全要求高。 酚类化合物 定义： 当蛋白质溶液 PH 小于其等电点时， 蛋白质颗粒带有正电荷， 容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。 （这类化合物包括鞣酸、 苦味酸、 三氯乙酸、 磺酰水杨酸等） 聚合物沉淀 及有机酸沉淀 非离子型聚合物 定义： 许多非离子型聚合物， 包括聚乙二醇（PEG） 可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。 聚合物的作用认为与有机溶剂相似， 能降低水化物， 使蛋白质沉淀。 PDE 的使用:低分子量的蛋白质沉淀加入大量 PDE， 反之亦然。 所用的 PDE 的浓度通常为 20%， 浓度再高，会使粘度增大， 造成沉淀的回收比较困难。 且其不必除去。 聚电解质沉淀法 定义： 有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品蛋白质。 如羧甲基纤维素， 海藻酸盐、 果胶酸盐、 卡拉胶等。 原理： 主要作用力是静电引力。 （加入量不能太多， 否则会引起胶融作用而重新溶解。 ） 化学物质对蛋白质的稳定作用 蛋 白质 不可 逆失 活的 化学 因素 强酸和强碱： 强的无机酸碱以及有机酸碱都可以改变蛋白质的 pH,引起蛋白质表面必须基团的电离； 由于各氨基酸残基所带电荷的相互吸引或者相互排斥使蛋白质的空间结构发生较大变化， 造成蛋白质分子聚集， 导致不可逆失活； 在强酸、 强碱条件下， 肽键也容易发生断裂。 氧化剂： 各种氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨酸、 半胱氨酸、 和胱氨酸残基； 分子氧、 过氧化氢氧自由基等是最常见的氧化剂。 在生物体内， 蛋白质的失活主要是通过活性氧（羟基自由基、 超氧离子、 过氧化氢、 过氧化物等来完成的。 ） 去 污 剂 和 活性表面剂： 离子表面活性剂： 阴离子： 如 SDS(十二烷基硫酸钠)阳离子： 癸基三甲基氯化铵、 十六烷基三甲基氯化铵等， 对蛋白质的变形能力比阴离子弱。 非离子去污剂： 通常不能使蛋白质变性。 变性剂 脲和盐酸胍： 高浓度的脲（8~10mol/L） 和盐酸胍（6mol/L） 与蛋白质多肽链作用， 破坏蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键， 引起蛋白质不可逆失活。 有机溶剂： 取代蛋白质表面的结合水， 并通过疏水作用与蛋白质结合， 改变溶液的介电常数， 从而影响维持蛋白质天然构想的非共价力的平衡。 螯合剂： EDTA 与金属离子形成配位聚合物， 从而使酶失去金属辅助因子， 从而导致酶或者蛋白质的构想发生较大的改变， 导致蛋白质不可逆失活。 重 金 属 离 子和巯基试剂 重金属离子： （如 Hg2+、 Cd2+、 Pb2+等） 能与能与蛋白质分子中的半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基、 色氨酸的吲哚基反应， 使蛋白质不可逆失活。 巯基试剂： （如巯基乙醇） 通过还原蛋白质分子内的二硫键使蛋白质失活（一般可逆） 。 低分子量的含二硫键的试剂可以与蛋白质分子中的的巯基作用， 使蛋白质失活。 蛋白质的稳定 常 用 方法：固化法： 将酶或者蛋白质多点连接于载体上。 添加剂： 保护蛋白质不受氧化剂氧化， 不受变性剂变性 化学修饰： 共价交联， 使蛋白质构想固化。 添加剂 共溶剂： 糖类、 醇、 氨基酸及其衍生物、 无机盐、 甘油、 多聚物（如聚乙二醇） 等被称为蛋白质共溶剂。 其改变溶液的热力学性质， 在蛋白质表面完全水化和共溶剂完全结合之间建立平衡， 使天然蛋白质稳定性增强， 理论上成为优先排阻作用。 抗氧化剂和还原剂： 蛋白质表面的半胱氨酸极容易被空气中的氧缓慢氧化而变成次磺酸或者二硫化物， 从而使蛋白质的电荷或者形状发生改变而失活。 （加入一些巯基试剂或者植物蛋白质课防止这种氧化。 ） 底物、 辅酶： 一些酶可以被底物、 辅酶或者竞争性抑制剂及反应产物所稳定。 其可能是降低活性中心的能量水平， 使酶趋于稳定。 金属离子： 如 Ca2+的存在可以稳定枯草杆菌蛋白酶、 灰色链丝菌蛋白酶和胰蛋白酶等， Ca2+与这些蛋白质的结合相当于与底物结合。 重金属离子可能引起酶活性抑制。 都具有长链疏水尾 和 亲水的 极性头 具有两个反应活性部位的双功能基团 同行双功能试剂： 两端具有相同的活性反应基团， 如 N-羟基琥珀酰亚胺酯， 二硝基氟苯、 双亚胺基酯等对氨基有专一性， 戊二醛也可与羟基反应。 异性双功能交联剂： 一端与氨基作用， 另一端与巯基作用（用碳二亚胺做交联剂， 第二个反应基团是羧基） 。 可被光活化的交联剂： 一端先于蛋白质反应， 经光照后， 另一端再产生一个活性基团， 如碳烯或者氮烯， 他们具有较高反应性，没有专一性。 可裂解型交联剂: 不可裂解型交联剂 化学交联剂 化学物质对蛋白质侧链基团的共价修饰作用外源化合物与生物大分子相互作用主要两个方式 共价结合： 当外源化合物的活性代谢产物与细胞内重要生物大分子共价结合时， 发生烷基化或芳基化，导致 DNA 损伤， 蛋白质正常功能丧失， 乃至细胞的损伤和死亡。 非共价结合 生物体内蛋白质加合物的形成 可与蛋白质发生反应的化合物（课本 148 页表格） ： 除少数烷化剂外， 绝大多数外源化合物需经体内代谢活化， 转为亲电子的活性代谢物再与细胞内生物大分子的亲核部位和基团发生共价结合。 蛋白质分子中的可反应基团： 氨基酸分子中的氨基和羧基、 丝氨酸和苏氨酸特有的羟基、 半胱氨酸分子中的巯基， 精氨酸分子中的胍基、 组氨酸分子中的咪唑基、 酪氨酸分子内中的酚基、 色氨酸分子中的吲哚基。 这些部位与源化合物发生共价结合， 会影响蛋白质的结构和功能。 与蛋白质的共价结合： 白蛋白是血液和组织间质中的主要蛋白质， 也是脂肪酸、 内源性（生物体内存在） 化合物及外源性（非生物体内存在） 化合物运输的主要载体， 容易与终致癌物结合形成共价加合物。 与血红蛋白共价结合： 外援化合物进入血液后， 可与红细胞膜结合而进入红细胞内与血红蛋白发生共价结合。 与细胞内蛋白质发生共价结合： 进入体内的外源化合物或其代谢产物可与浆胞、 质膜以及细胞核内的蛋白质发生共价结合形成加合物。 （如溴苯一种重要的肝脏毒物） ； 有些非遗传毒性致癌物与浆胞蛋白或者核蛋白共价结合， 对细胞造成不利影响。 特定的氨基酸残基侧链基团的修饰 蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反应来实现的。 修饰试剂的作用不专一， 不但与蛋白质必须基团作用， 也和非必须基团作用。 巯基化学修饰 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂， 尤其是碘乙酸和碘乙酰胺， 可用于多肽链氨基酸顺序分析过程中防止半胱氨酸的氧化。 N-乙基马来酰亚胺： 有较强的专一性， 伴随光变化， 容易通过光吸收变化确定反应程度。 5,5`-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB） ： 又称 Ellman 试剂， 最常用的巯基修饰试剂， 可通过光吸收变化确定反应程度 有机汞试剂： 最常用对氯汞苯甲酸， 溶于水中形成羟基衍生物， 与巯基相互作用时在 255nm 处光吸收具有较大的增强效应。 氨基化学修饰： 赖氨酸残基可被选择性修饰， 三硝基苯磺酸（TNBS） 与赖氨酸残基发生反应， 在 420nm 处和 367nm 处有光吸收 羧基化学修饰： 水溶性的碳化二亚胺类化学物可修饰蛋白质分子中的羧基基团 咪唑基的化学修饰： 组氨酸残基的咪唑基课通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来修饰， 常用焦炭酸（DPC） 二乙脂来修饰 酚和脂肪族羟基的化学修饰： 四硝基甲烷(TNM)可用于修饰络氨酸残基， 产生离子化的发色基团——3-硝基络氨酸衍生物。 胍基的化学修饰： 苯乙二醛： 两分子苯乙二醛与一份子精氨酸残基不可逆结合。 精氨酸残旧修饰试剂（如 4-羟基-3-硝基苯乙二醛） 可使被修饰的精氨酸残基在 405nm 处具有光吸收。 对硝基苯乙二醛修饰精氨酸残基可以得到唯一产物。 亲和性标记： 对于底物或者配体的结合部位具有一定亲和性， 因而能够结合选择性的结合在蛋白质的表面上的特定部位； 由于它们的化合反应性， 这类类似物能够与蛋白质分子共价结合； 这类反应试剂具有饱和性， 与底物或者天然配体竞争蛋白质的结合位点。 主要有光亲和标记和自杀性抑制剂两种类型， 自杀性抑制剂作为底物没有反应活性。 丁二酮和 1,2-环己二酮与胍基反应可逆生成精氨酸-丁二酮复合物， 该物与硼酸结合稳定。 蛋白质光谱探针 蛋白质吸光探针 金属探针 双缩脲法： 双缩脲与碱性溶液中与二价铜离子生成紫红色化合物， 具有 2 个和 2 个以上化合物都具有双缩脲反应， 紫红色化合物可在 540nm 处测量吸光度 Folin-Lowry 法： Lowry 等将双缩脲试剂和 Folin 酚试剂结合使用， 在蛋白质发生双缩脲反应之后， 再和 Folin 酚试剂反应， 此试剂在碱性条件下被蛋白质中络氨酸的酚基还原， 生成颜色更深的化合物， 可在 640nm 处测量。 双辛可宁酸法（BCA 法） ： 在碱性条件下， 蛋白质分子中的肽键与铜离子反应生成 Cu（I） 、 Cu(I)再与 BCA 反应形成紫色络合物， 在 565nm 测量吸光度。 染料探针 原理： 利用蛋白质和染料结合成沉淀或者改变结合燃料的光吸收特性， 借助燃料颜色的颜色的减退或减退变化的程度来测定蛋白质的含量。 溴酚蓝： 该试剂颜色对比度为 160nm， 反应在 pH3.2 左右进行， 在 600nm 测量吸光度。 溴甲酚绿： 对比度约为 170nm， 反应在 pH4.2 进行， 628nm 测量吸光度。 考马斯亮蓝： 在酸性条件下， 考马斯亮蓝与蛋白质结合。 其吸收高峰从 465nm 移至 595nm， 颜色由棕黄色转为深蓝色 蛋白质荧光探针 蛋白质光散射探针 蛋白质分子中存在络氨酸、 色氨酸、 苯丙氨酸残基， 能够吸收 270~300nm 的紫外光而发出紫外荧光。 小分子配体能与蛋白质发生相互作用， 导致蛋白质荧光的淬灭， 利用小分子配体对蛋白质内源性荧光的淬灭这一现象可以确定蛋白质与小分子配体的作用类型及结合部位。 作为一个好的荧光探针满足的条件 1.探针分子与蛋白质分子的某一微区必须有特异性的结合， 并且结合比较牢固； 2.探针的荧光必须对环境条件敏感 3.蛋白质分子与探针结合后不影响其原来的结构和特性。

原理就是细胞膜的流动性~

动物细胞融合~直接融合就行了（不像植物，要先去细胞壁）

诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇peg）、物理方法（离心，震动，电刺激）。

某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion

protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。

化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。

细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。而动物细胞融合技术最重要的用途是制备单克隆抗体。

（上面那段是网上找的，但我记得~番茄+马铃薯没有成功。。。）