如何通过控制优化发酵条件，降低大肠杆菌高细胞密度培养过程中乙酸的生成

高生产率和高细胞密度发酵生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。近十年来，利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物，是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里，如何创造更经济、更有效的方法，来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。利用重组DNA技术生产重要的生物药物，在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存，重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6)后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标，整个生产过程的最优化才能实现。(一)细胞生长环境的优化策略要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。1．培养基组成的优化培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多；在重组微生物达到高细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素1的产率显著提高。此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长，但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况，其重组-淀粉酶的产量可提高2倍。培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中含有蛋白胨时，大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸，这是一种非常有趣的代谢机制。恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明，由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用，加入某些氨基酸后，细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率，最终可以确定高密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。2．特殊营养物的添加在某些情况下，向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体，也有可能是阻止产物的降解，例如，在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸，可将酶的比活力提高大约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌生产-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制，从而防止了重组蛋白的降解。在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如，在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍，但在小型反应器中却无法重复这一结果。3．限制代谢副产物的积累培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下，酿酒酵母会产生乙醇，大肠杆菌则会产生过量乙酸，一旦生成乙酸，细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物)，则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响，众多研究者进行了大量工作，如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组-淀粉酶和-内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有乙酸伴随生成。 (二)培养模式由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，而为了达到高细胞密度，又必须供给大量的营养物质，因此，浓缩营养物必须以与其消耗速率成比例的速度加入反应器中。为此产生了多种形式的补料策略，它可以简单到线性补料，也可以复杂到利用数学模型计算得出的策略来控制补料速率。具体来说，培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶(1)所培养细胞的具体代谢行为；(2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力；(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力。1．大肠杆菌流加发酵策略大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。近年来已经报道了多种控制大肠杆菌流加培养中流加速率的方法，其中大多数是将流加速率与一种物理参数间接耦合(如溶氧、pH或CO2释放速率)。有学者将溶氧控制在一个预定值上以保证较低的生长速率，结果乙酸产生很少，最终细胞干重达到110 g/L，并发现较低的比生长速率还有利于重组蛋白的高表达。在另一个控制低比生长速率的高细胞密度培养中，研究者采用先指数流加葡萄糖、铵盐和无机盐，后采用广义线性流加的培养策略，有效地防止了乙酸的积累，重组大肠杆菌的细胞密度达到66 g/L，通过温度诱导可在胞内形成19.2 g/L的活性重组蛋白。如果将葡萄糖浓度控制在一个不致于产生毒性的足够低的水平上，也可以使细胞在不存在限制性基质的情况下迅速生长到高细胞密度。这种控制策略对仪器的要求较高。Kleman等采用在线葡萄糖分析仪，以微生物对葡萄糖的需求来决定葡萄糖和其它营养物的流加速率，这一算法能够在产物诱导阶段中根据细胞生长的变化自动调整流加速率。培养携带质粒的大肠杆菌 MV1190，其质粒中带有编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最终细胞干重达到39 g/L，产生1.7 g/L可溶的活性蛋白。2．重组酵母的流加发酵酵母中广泛用于遗传工程研究的菌株是酿酒酵母。但采用酿酒酵母作为重组宿主也有以下缺点∶(1)重组蛋白生产的水平较低；(2)质粒不稳定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出现的，因为这会抑制重组蛋白的形成。近来研究表明，其它酵母，如巴斯德毕赤氏酵母也具有作为重组宿主的潜力。Clare等比较了重组巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母在高细胞密度状态下表达和分泌鼠表皮生长因子的能力。培养每基因组含有19个拷贝数的巴斯德毕赤氏酵母，最终可获得447 mg/L胞内重组蛋白；而培养酿酒酵母所获得的最高水平仅6～7 mg/L。通过先指数流加，后采用基于CO2释放和RQ值的线性流加控制方式可使重组巴斯德毕赤氏酵母的细胞干重达到80～90 g/L，并分泌高水平的重组人血清蛋白。而培养酿酒酵母，细胞干重和重组蛋白的产量仅分别为25 g/L和20 mg/L。即使将酿酒酵母的生长速率维持在0.12～0.18 h-1，也将形成10～13 g/L的乙醇，因而导致产率降低。但酿酒酵母产乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一个复杂的流加系统，将酵母的生长速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生产最大而乙醇的生成最小。3．流加培养的控制一个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。计算机技术的迅猛发展，为流加培养的控制提供了更有效的手段。近年来，应用计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。由于现代计算机技术的帮助，人们能够采用多种生长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加，从而使复杂的控制系统得以实现。在各种人工智能技术中，模糊推理(fuzzy reasoning)是应用最广的一种。模糊逻辑控制(fuzzy logic control)部分依赖于数学生长模型，也采用“语言定义的规则系统”(linguistically defined rules system)来帮助系统响应发酵过程的非线性和动态行为。Alfafara等在流加培养酿酒酵母生产谷胱甘肽的研究中，采用一个模糊逻辑控制系统来控制葡萄糖的流加速度，对系统进行优化后谷胱甘肽的比产生速率达到6.2 mgg-1h-1。目前，在流加培养中应用模糊逻辑控制技术的最大问题在于如何减少底物和产物浓度振荡所需的调整次数。自适应模糊逻辑控制算法的发展可望对此有所帮助。(三)诱导策略对于许多带有诱导型启动子的重组微生物，只有将生长期和产物形成期分开才能获得最大生产率。在流加培养中，这两段时期的分离可以通过延迟诱导直至细胞生长已达到高密度来实现。此外，如果质粒稳定并且产物对培养物无毒，那么可以用重复补料分批培养系统来提高生产率。有学者采用重复补料分批培养技术培养酿酒酵母，每24 h更换50%的培养基，持续30 d，其产物(hirudin)的产量可比连续培养系统提高3倍。如果诱导物和产物对细胞都有毒性，那么应当人为地将诱导期和生长期分开。对于这种情况，两级连续培养是最适宜的培养方式。控制第一罐的条件，使细胞生长处于最适状态之下，而诱导与产物形成则发生在第二罐中。例如，在恒化器中培养一株能产-内酰胺酶的重组大肠杆菌，将第一罐的发酵液导入第二罐中，构成一个两级培养系统。第二罐中添加营养物以及IPTG作为诱导物。结果获得300 mg活性-内酰胺酶(相当于总蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。这一系统至少可以稳定运行50 d。另一相似的系统被用于培养大肠杆菌生产重组蛋白A-EcoRI蛋白融合体。培养在恒浊器中进行，对第二罐进行热诱导，结果获得了比分批发酵高6倍的比生产率。研究者还尝试将生产重组蛋白的两级连续培养系统与亲和色谱柱相组合，试图实现重组蛋白生产和纯化的连续化。但由于技术上的一些原因，这种组合还未得到成功。比生长速率对细胞生长和产物形成均有重要作用。经常会遇到的情况是，最适于细胞生长的比生长速率却并不适于产物的形成或其它特性的实现。我们在培养面包酵母时发现，比生长速率为0.2 h-1时细胞产率最高，而比生长速率为0.178 h-1时酵母发酵活力最佳。针对这一现象我们提出了一个两阶段控制比生长速率的流加培养策略，结果在一个反应器中实现了高发酵活力与高细胞产率的统一。(四)细胞循环发酵从反应器角度来考虑获得高细胞密度，通常采用的是细胞循环生物反应器。这种反应器利用一种切向流或中空纤维过滤器从醪液中分离细胞，细胞返回容器，无细胞醪液则以给定速率连续转移，同时代之以新鲜培养基。利用细胞循环技术，可使细胞保留在反应器中并达到高细胞密度，而毒性废产物和胞外产物则不断转移，这可以延迟或防止由细胞生长或产物形成引起的反馈抑制。细胞循环生物反应器能够适用于多种机体和生产系统，但它的应用也存在许多限制，主要包括∶(1)作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大；(2)系统的放大存在许多实际困难。操作细胞循环生物反应器时必须考虑两个因素，一是稀释率(流速／体积)；二是循环速率(指通过过滤系统的培养基速率)。稀释率的大小影响细胞的生长速率，不同的实验目的对稀释率的要求也不同；高的循环速率可使组分混合均匀，特别适用于细胞容易凝聚或成团的情况。但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。细胞循环技术可望获得高的体积生产率，这对产物的提取非常有利。近年来循环发酵技术已广泛用于生产细胞代谢物，如燃料酒精和有机酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用细胞循环发酵技术，重组大肠杆菌细胞干重达到145 g/L，其重组青霉素酰化酶生产率比分批培养提高了近10倍。对于活细胞即为所希望的产物的培养，细胞循环发酵也能发挥作用。如在食品工业中，为生产牛奶，奶酪和酸乳酪需培养不同的乳杆菌，采用细胞循环生物反应器可以很容易地提高这些生物体的的密度。在多种控制手段的帮助下，目前人们已经能很容易地获得超过100 g/L的细胞密度。但已有的研究结果表明，与最适生物量形成所对应的生长条件通常会导致较低的比生产率。例如，用细胞循环反应器生产2,3-丁二醇，生物量提高了大约6倍，但体积生产率只提高了2～3倍。同样，流加培养可以使链霉菌的细胞干重达到43 g/L，但蛋白酶活为零，而当细胞干重为18 g/L时蛋白酶活却高达3500 U/mL。我们在研究中也经常遇到类似问题。要解决这一问题，一方面应当研究如何促进重组蛋白的高效表达和提高重组菌株的稳定性，另一方面要研究与高细胞密度相关联的高水平产物的形成条件.

2、发酵培养基准备：摇瓶的话好说,灭菌锅就行.发酵罐的话,要先将罐子清洗干净,然后配料,然后灭菌.

3、将培养好的种子液,按一定的接种量接到发酵培养基中.如果是摇瓶发酵的话一般不用中控,时间到了放瓶即可.如果是发酵罐发酵的话,中间过程需要补料、调节PH值、控制好溶氧转速等等.要注意取样时样液的密封性,如果样液到处乱撒,容易导致噬菌体污染.

4、不论是产酶、蛋白、氨基酸还是别的什么,产物量都是必须检测的哦.

5、放罐后,也要注意料液的收集、使用和灭活,严防噬菌体污染.

乙醇比较常见的用途有：

乙醇可以用于食用，如酒。白酒的度数表示酒中含乙醇的体积百分比（西方国家常用proof表示酒精含量），通常是以20℃时的体积比表示的，如50度的酒，表示在100毫升的酒中，含有乙醇50毫升(20℃)。

广泛用于医用消毒（体积分数为75%±5%的乙醇溶液常用于医疗消毒）。70~75%的酒精用于杀菌，例如75%的酒精在常温（25℃）下，一分钟内可以杀死大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、白色念球菌、铜绿假单胞菌等。

乙醇可以调入汽油作为车用燃料。美国销售乙醇汽油已有20年历史，我国高粱乙醇在汽油中占10%。

乙醇能作为良好的有机溶剂，所以中医用它来送服中药，以溶解中药中大部分有机成分。

乙醇的用途很广，可用乙醇制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。医疗上也常用体积分数为70%~75%的乙醇作消毒剂等，在国防化工、医疗卫生、食品工业、工农业生产中都有广泛的用途。

日常饮用的酒内的乙醇不是把乙醇加进去，而是微生物发酵得到的乙醇，当然根据使用的微生物种类不同还会有乙酸或糖等有关物质。

参考资料：百度百科词条——乙醇

1.学习并掌握细菌基因组的提取方法

【实验原理】

DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

【实验材料】

大肠杆菌DH5α菌液

【实验试剂】

LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇

【实验仪器与用具】

微量移液器，低温离心机，水浴锅，eppendorf管，恒温摇床

【实验步骤】

（1）将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌液5000rpm冷冻离心10min弃上清；

（2）加190μL TE悬浮沉淀，并加10μL 10%SDS，1μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；

（3）加30μL 5mol/L NaCl，混匀；

（4）加30μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；

（5）加入300μL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管；

（6）加入300μL氯仿/异戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干净管中；

（7）加300μL异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA；

（8）5000rpm离心10min，沉淀DNA，加入500μL70%乙醇，5000rpm离心10min，弃乙醇，吸干；

（9）溶解于20μLTE，取3μL 用于琼脂糖凝胶电泳验证，其余-20℃保存。

（2）加190μL TE悬浮沉淀,并加10μL 10%SDS,1μL 20mg/mL蛋白酶K,混匀,37℃保温1h；

（3）加30μL 5mol/L NaCl,混匀；

（4）加30μL CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min；

（5）加入300μL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提,5000rpm离心10min,将上清液移至干净离心管；

（6）加入300μL氯仿/异戊醇（24：1）抽提,取上清液移至干净管中；

（7）加300μL异丙醇,颠倒混合,室温下静止10min,沉淀DNA；

（8）5000rpm离心10min,沉淀DNA,加入500μL70%乙醇,5000rpm离心10min,弃乙醇,吸干；

（9）溶解于20μLTE,取3μL 用于琼脂糖凝胶电泳验证,其余-20℃保存.

通常以发酵产物命名，下面介绍几种发酵类型：

（1）酵母酒精发酵

第一型的发酵： 酵母菌在中性或偏酸性、无氧条件下，利用葡萄糖经EMP途径产生乙醇的代谢。

第二型的发酵

在酵母酒精发酵中，加入亚适量NaHSO3，产物除了乙醇还有甘油。

第三型的发酵

在酵母酒精发酵中，发酵液pH值控制在碱性（pH7.6），产物除了乙醇还有甘油和乙酸。

（2）细菌酒精发酵

细菌例如林氏发酵单胞菌、嗜糖假单胞菌，经ED途径，降解葡萄糖生成丙酮酸，然后生成乙醇的代谢。

（3）同型乳酸发酵

乳酸杆菌属的一些种、链球菌科的某些属，利用葡萄糖经EMP途径，产生以乳酸为主产物（1.8mol 乳酸/mol G)的发酵。

（4）异型乳酸发酵

肠膜状明串珠菌、双歧乳杆菌等利用葡萄糖经PK途径，产生乳酸（0.8mol 乳酸/mol G)外，还有乙醇、乙酸、甘油和甘露醇等产物的发酵。

◆PK途径：肠膜状明串珠菌、 短乳杆菌等；产物除乳酸外还有乙醇等。

(5) 丁酸型发酵

◆梭状芽胞杆菌属；严格厌氧发酵；降解葡萄糖经EMP途径，产物除丁酸外还有其他一些产物：

◇ 丁酸－乙酸发酵：丁酸、乙酸、CO2和H2

◇ 丙酮－丁醇发酵：丙酮、丁醇、丁酸、CO2和H2

◇丁醇－异丙醇发酵：丁醇、丁酸、乙酸、异丙醇

★丁酸型发酵是发酵工业中生产丁酸、丙酮、丁醇等重要有机溶剂和化工原料的基础。

（6）甲酸发酵：

◆ 混合酸发酵：大肠杆菌等兼性厌氧菌利用葡萄糖经EMP途径，产生乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、CO2和H2等产物，次外还产生少量的2，3－丁二醇的发酵。

◆ 2，3－丁二醇的发酵：产气肠杆菌等；产生大量的2，3－丁二醇、CO2、H2和少量的乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸等产物的发酵。

甲酸发酵在鉴定肠杆菌科中的细菌时非常有用

（7）丙酸发酵

丙酸发酵：丙酸杆菌、丙酸羧菌等厌氧菌利用葡萄糖，经EMP途径产生丙酸的代谢。

①染色体DNA的去除 ：在富集培养目标菌种后，首先应裂解细菌细胞，采用含有SDS的NaOH溶液裂解菌体释放质粒，同时氢氧化钠的强碱性，可使DNA氢键断裂，双螺旋结构破坏而变性，再加入中和缓冲液，可使部分变性的质粒DNA复性，而染色体DNA不复性，因此使质粒DNA与染色体 DNA分离开。

②细菌中的RNA可以通过RNaseA去除

③蛋白质的去除 ：细菌中的蛋白质可以通过酚/氯仿/异戊醇抽提，酚可以使蛋白质变性，氯仿将微溶 于水的酚抽提到有机相中，使其与水相中的DNA分离。分离后的质粒DNA可以通过乙醇回收，乙醇可以消除核酸水化层，暴露其带负电的磷酸基团，因 此在阳离子充足的环境中可以发生”核酸–乙醇沉淀

④蛋白质、染色体DNA、细胞碎片、以及在分离过程中与试剂形成的不溶复合物都可以通过离心去除。

⑤试剂盒法DNA的回收 :除碱裂解法以外，还可以通过试剂盒抽提质粒DNA，在碱裂解进行变性和复性后的纯化回收通过纯化柱进行。纯化柱中的硅胶膜能在高盐、低PH条件下吸附体系中的 DNA，将其与其他杂志分离，而在低盐、高PH条件下DNA又可以被洗脱下来。

⑥纯化后的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计鉴定

电泳法 ：带负电荷的DNA分子在外加电场的作用下向正极泳动，不同分子量大小与构型的DNA分子泳动速率不同，因此可以在琼脂糖凝胶上呈现不同的条带。在凝胶中加入核酸染料可以方便我们观察，因为核酸染料可以嵌入到DNA碱基之间，避免被凝胶中的氢离子淬灭，因而亮度更高。

紫外分光光度法 ：DNA的吸收峰在260nm处，蛋白的吸收峰在280nm处，因此可以用OD260/OD280判断DNA纯度，一般认为比值在1.8~2.0之间时，纯度较高

材料：

含有pSK II质粒的大肠杆菌菌株的菌液、含有MP3质粒的大肠杆菌菌株的菌液

试剂：

①细菌的培养：LB培养基、氨苄青霉素

②细菌的裂解与收集：溶液I（Tris-HCl、EDTA、Glucose）、溶液II（NaOH、SDS）、溶液 III（KOAc、CH3COOH）、RNAseA

③质粒DNA的分离与纯化：酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、1XTE溶液（Tris-HCl、 EDTA）、东盛生物小提质粒盒

④电泳：琼脂糖、0.5XTBE电泳缓冲液、StarGreen DNA Dye、loading buffer、1XTE buffer

①细菌的培养：

将含有pSK II和MP3质粒的大肠杆菌菌液分别于LB培养基上划线 → 37℃过夜培养 → 挑取培养基上的单菌落于液体LB培养基中，震荡培养过夜

②细菌的收集与裂解

- 碱裂解法

吸取1.5ml菌液12000rpm离心1min (沉淀菌体)

↓

弃上清培养液 (完成细菌的收集)

↓

加入150ul溶液I和3ul RNaseA，震荡混匀，静置2min (悬浮菌体、去除RNA)

↓

加入250ul溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮(不超过5min。裂解菌体、释放质粒，此步骤动作轻柔，防止基因组DNA断裂，且时间不宜过长)

↓

加入180ul溶液III，颠倒混匀，冰浴10min （中和反应，防止基因组DNA污染）

↓

12000rpm离心5min，吸取上清80ul，重复此操作 (此时已完成了染色体DNA、RNA、细胞碎片、部分 蛋白质的分离)

③质粒DNA的分离

加入53ul的酚/氯仿/异戊醇上下颠倒抽提10min，静置分层 （DNA在水相中），12000rpm 离心10min

↓

通风橱中吸取上清，加入20体积的无水乙醇 （发生核酸-乙醇沉淀）

↓

12000rpm离心5min,倒掉乙醇，短暂离心10s，用移液枪吸取乙醇

↓

加入500ul 70％乙醇洗涤DNA沉淀，离心5min，倒掉乙醇，离心10s，用移液枪吸取乙醇，将其放置在通风橱中促进乙醇挥发

↓

加入300ul 1XTE溶解，65℃热板温育10min

④纯化质粒DNA

加入1XTE使溶液为300ul，加入300ul酚/氯仿，充分震荡抽提5min(去除蛋白)

↓

12000rpm离心5min，吸取上清

↓

加入1/10体积3M NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀

↓

置于-70℃冰箱15min沉淀DNA

↓

4℃12000rpm离心15min，倒掉乙醇，离心10s，用移液枪吸去乙醇

↓

0.5ml 70%乙醇洗DNA沉淀一次，离心2min，倒掉乙醇 （去除DNA中的盐离子）

↓

离心10s，移液枪吸去乙醇，在50-60℃热板上烘干1min

↓

加入20ul 1XTE溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育10min （使DNase失活）

-试剂盒抽提法

加入溶液III离心后的上清液置于DNA纯化柱中，静置2min

↓

12000rpm离心1min，弃滤液 （DNA被吸附到硅胶膜上）

↓

加入500ul溶液PB，12000rpm离心1min，弃滤液 （洗脱蛋白、盐等杂质）

↓

加入500ul溶液W，12000rpm离心1min，弃滤液 （重复此步骤一次，洗掉多余盐离子及乙醇）

↓

12000rpm离心3min （彻底去除纯化柱中残留的液体）

↓

将DNA纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央处悬空滴加80ul溶液Eluent，室温静置2min （将硅胶吸附柱上的质粒DNA洗脱下来）

↓

12000rpm离心1min （管底即为质粒DNA）

⑤琼脂糖凝胶电泳观察

制胶：

称取1.2g琼脂糖加入盛100ml 0.5XTBE电泳缓冲液的250ml 三角瓶中，摇匀

↓

微波炉加热至琼脂糖溶解（沸腾）

↓

放在冷水中冷却，加入10ul的StarGreen DNA Dye，摇匀

↓

琼脂糖倒入模具中，插上梳子 。凝固后向上垂直拔出梳子，将凝胶转移到电泳槽中，加入0.5XTBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1mm

点样：

按照碱裂解法纯化前的MP3、pSK II样品各3ul、5ul Marker（10ug/ul、20ug/ul、60ug/ul）、碱裂解法纯化后的MP3、pSK II样品各6ul，试剂盒提取的MP3、pSK II样品各2ul的顺序依次加入点样板小孔中，再分别加入10Xloading buffer，配置10ul点样体系，吹吸混匀

电泳：

打开电源开关，调节电压3-5V/cm

观察：

将电泳好的凝胶置于凝胶成像仪中观察