生物化学 酪氨酸在体内可以转变成什么

你这是5分题吗？：）我的水平也只能回答你一部分哈。

甲烯基是CH2=，亚甲基是-CH2-；

甲酰犬尿氨酸和犬尿氨酸甲酰胺两都不是，应该是N-甲酰-L（D）-犬尿氨酸，主要基团得在后面。

CH3CHOH- 叫1-羟基乙基。

这个是叶酸那一章吧，我先看看。

1分子乙酰乙酸生成过程中参与反应的乙酰coa共有几分子

分两个阶段：

【1】丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A：

该过程发生在线粒体的基质中,释放出1分子CO2,生成一分子NADH+H+.

【2】乙酰辅酶A参与三羧酸循环,产生二氧化碳：

主要事件顺序为：

（1）乙酰CoA与草酰乙酸结合,生成六碳的柠檬酸,放出CoA.柠檬酸合成酶.

（2）柠檬酸先失去一个H2O而成顺乌头酸,再结合一个H2O转化为异柠檬酸.顺乌头酸酶

（3）异柠檬酸发生脱氢、脱羧反应,生成5碳的a-酮戊二酸,放出一个CO2,生成一个NADH+H+.异柠檬酸脱氢酶

（4） a-酮戊二酸发生脱氢、脱羧反应,并和CoA结合,生成含高能硫键的4碳琥珀酰CoA,放出一个CO2,生成一个NADH+H+.酮戊二酸脱氢酶

（5）碳琥珀酰CoA脱去CoA和高能硫键,放出的能量用于驱动GTP(哺乳动物中)或ATP(植物和一些细菌中)的合成.琥珀酰辅酶A合成酶

（6）琥珀酸脱氢生成延胡索酸,生成1分子FADH2,琥珀酸脱氢酶

（7）延胡索酸和水化合而成苹果酸.延胡索酸酶

（8）苹果酸氧化脱氢,生成草酸乙酸,生成1分子NADH+H+.苹果酸脱氢酶

小结：

一次循环,消耗一个2碳的乙酰CoA,共释放2分子CO2,8个H,其中四个来自乙酰CoA,另四个来自H2O,3个NADH+H+,1FADH2.此外,还生成一分子ATP.

三羧酸循环总反应：

乙酰CoA+3NAD++FAD+GDP+Pi—→2CO2+3NADH+FADH2+GTP（ATP）+2H+ +CoA-SH

再加上丙酮酸氧化脱羧形成一分子NADH,所以共产生：4个NADH、1个FADH2和1个GTP（ATP）

一分子NADH通过电子传递链的氧化,形成2.5分子ATP；一分子FADH2通过电子传递链的氧化,形成1.5分子ATP.【《生物化学》王镜岩 第三版 下册 107页】

一分子丙酮酸在线粒体内氧化成二氧化碳和水可生成ATP分子的数目为：

2.5×4 + 1.5 + 1 = 12.5 即,可以生成12.5分子的ATP

一、量气法

在封闭的反应系统中如有气体变化，通过测量变化后的气体体积或压力很容易计算出气体变化量，这是量气法的基本原理。曾在检验科广泛应用的Van-slyke测二氧化碳结合力的方法就是量气法的一个典型例子。Warburg进一步加以发展，设计出专用于测定酶活性的华勃呼吸仪。这种仪器特别适用于测定那些在反应中产生或消耗气体的酶，例如氧化酶反应涉及到O2的消耗，脱羧酶会产生CO2。但也不仅限于这些酶，科学家采用与CO2气体保持平衡过的重碳酸盐体系，可用来测定各种产生H+的酶反应，如各种还原酶，可使NADH变为NAD和H+，而H+会促使反应体系中重碳酸盐变为CO2气体。

二、比色法与分光光度法

在20世纪上半个世纪华勃仪得到研究实验室广泛的应用，并在酶学上得到丰硕的成果。但此法操作烦琐，技术要求高而且灵敏度低。临床常规中很少使用。多使用简单易行的比色法测酶活性。在上半个世纪建立了一些适用于常规工作的测酶活性浓度的方法，如测定淀粉酶的Somogyi法，碱性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。这些方法都是在酶和底物作用一段时间后停止酶反应，加入各种化学试剂与产物或基质反应呈色，用比色计在可见光处比色，同时将被测物质作标准管或标准曲线，比较后计算出在此段时间内产物生成量或底物消耗量，从而求得反应速率v。

比色法从50年代起逐步被分光光度法所取代。这是因为分光光度法有以下几个显著优点：一是测定范围不只局限在可见光，还可扩展到紫外和红外部分。这就为扩大测定酶范围提供了可能性。二是提供了寻找一类不需停止酶反应就可直接测定产物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反应A－＞B＋C，A、B、C三种物质用分光光度法的吸收光谱如图17-1所示。

图17-1 A、B、C三种物质的吸收曲线

可以看到C在560nm处有一吸收峰，而A和B在此处无吸光度变化因此无需停止酶反应，只要在560nm处测定吸光度变化就很容易计算出C的变化速度，而且C物质比A、B二物质有更高的吸收峰，即灵敏度最高。

这类方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光谱差异建立的测酶活性浓度方法。NAD（P）H在340nm处有一吸收峰，而NAD（P）在此波段却毫无吸光性。因此建立了一类和原来比色法截然不同方法。不需停止酶反应，在340nm根据吸光度变化，就可观察到酶反应变化全过程。

第三个优点是不需要如比色法那样，作标准管或标准曲线，因为分光光度计使用近似单色光的光源，在此条件下，某一特定物质的吸光度为常数，即人们所熟悉的摩尔吸光度（molar absorbance）。根据此值从吸光度△A/△T不难计算出酶催化反应速度v。

分光光度计的这些简便、准确等特点使它在近年来已逐步取代比色法而成为目前最流行的方法。其缺点是需要精确带恒温装置的分光光度计，在经济不发达地区尚难推广。

分光光度法的技术多样化。设计得当可用于各种酶的测定。表17-2是一些可用于分光光度法的氧化还原物质特性。

除了前述的NAD(P)H系统可用于脱氢酶测定外，可利用黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）来测定各种含这二个辅基的酶。它们的氧化型在450nm有一很强吸收峰，而还原型的吸光度很低，同样细胞色素还原型在可见光有一个非常明显和很窄的吸收峰，都使人们很容易用分光光度法研究这些酶的作用。上述物质主要用于氧化还原酶的测定。

科学家还设计出一系列人工合成酶的底物，用于其它酶的分光光度法测定。例如合成了很多对硝基酚的衍生物，用于各种水解酶的测定。碱性磷酸酶底物磷酸对硝基酚就是一个成功例子。又如测芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸对硝基酚为底物，其分解产物的吸收峰由原来的278nm变为318nm，Webb成功地在330nm进行此酶监测

表17-2 一些氧化还原物质的特性

物质 波长（nm） 克分子吸光度

还原型 氧化型

NAD，NADP 340 6300 0

FMN 450 12200

FAD 450 11300

细胞色素C 550 29500 8300

亚甲蓝（等消光点） 610 0 41000

二氢酚吲哚酚 600 0 21000

吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000

抗坏血酸 265 15100

连二亚硫酸盐 314 8000 0

氰化铁（亚铁） 420 0 1020

分光光度法的上述原理还可以用于其它酶的测定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由于含不饱和键，在330nm处有很强吸收峰，而酶作用产物无此不饱和键。则不难在330nm处对这些酶进行直接测定。

此后在分光光度法的发展过程中又导入了酶偶联技术。使得分光光度法几乎能测定所有的酶。因此临床实验室工作者如不能很好掌握分光光度法的技术，不了解各种影响因素，要作好酶的测定是很困难的。

三、荧光法和同位素法

分光光度法有一个缺点，即灵敏度较低。有些标本中酶浓度很低时往往测不出来。此时可考虑改用荧光法，可将测定灵敏度提高2-3个数量级。如科学家合成了一系列甲基伞形酮的衍生物，可取代对硝基酚衍生物做为一些水解酶的底物，由于水解产物甲基伞形酮有强烈荧光，大大提高测定的灵敏度，就是分光光度法中最常用的NAD(P)H反应系统，也可改用荧光法，在340nm紫外线激发下NAD(P)H产生强烈的蓝色荧光，而NAD(P)不被激发。此外，还可使用在荧光法基础上发展起来的时间分辨荧光法，例如北京医院就曾利用此种灵敏度极高方法测定很难用其它方法检测的脑脊液中微量的烯醇化酶。荧光法不易掌握，对所用的试剂、容器和仪器都要求很高，否则易产生非特异荧光干扰测定，或者引起荧光的淬灭使测定不准，故此种方法多用于研究实验室，少用于常规实验室。为提高灵敏度，还可使用同位素标记的底物进行酶测定，例如，有人以C12标记的乙酰胆碱为底物测定胆碱酯酶，在酶作用后以离子交换法分离出含C14的乙酸。同位素方法由于对人体有害，操作麻烦，目前已很少使用。

四、其它方法

离子选择电极法，旋光法等有时用于测定特定的酶，当酶反应牵涉到有酸碱变化时，很容易用pH仪直接观察酶反应过程中H+的变化。直接用pH仪测酶反应有两个缺点：一是随pH变化，会偏离酶作用的最适pH值，不可避免地引起酶反应速度变慢。其二是如测定的标本不是纯酶时标本中其他蛋白及其它有缓衡能力的物质将会影响所测pH变化的程度。此时如改用电位滴定仪则更为适合。此仪器可在酶反应过程中不断向反应体系中加入酸或碱以维持反应体系pH的恒定，而加入的酸碱量只与体系中H+变化量相关，和反应体系中缓衡能力无关。

同样如酶反应中有O2变化，可使用氧电极来监测酶反应过程，这可用来测定葡萄糖氧化酶活性，Chappell还成功地将此技术用于测线粒体的氧化能力。还曾有人尝试用二氧化碳和氨电极测酶，由于这些电极反应时间较慢，不利于检测酶反应速度。有些酶的反应物为光学异构体，则可根据旋光度变化来追踪酶反应。某些反应物如羟基酸本身虽无旋光性，但与钼结合后产生很高的旋光性。根据此特性建立了测定延胡索酸水合酶的方法。还有个别酶的测定使用了极谱法、高效液相色谱法等。总之，实验室工作者完全可以根据实验室现有仪器和技术，创造性地建立一些新的测活性浓度的方法。

与其他生物类似，糖类是木霉中的主要能源物质，木霉的生长需要碳源，最适合的碳源为糖类（详见第4章）。木霉细胞外的碳源通过不同途径转化成葡萄糖，进入细胞内，然后葡萄糖分解代谢提供木霉生长所需的能量。如图5.1 所示，木霉可以通过葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶等对环境中的淀粉、纤维素进行降解，产生葡萄糖，或者培养基中含有的葡萄糖可以通过葡萄糖转运进入细胞内，葡萄糖的转运有一活跃的转运系统进行，其他真菌，例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和链孢霉（Neurospora crassa）的糖转运系统已被充分研究（Boles et al.，1997；Lagunas，1993；Marger et al.，1993；Özcan et al.，1999；Rand et al.，1980a，1980b）。Delgado-Jarana等（2003）从哈茨木霉（T.harzianum）CECT 2413中分离了一个编码葡萄糖转运蛋白的基因gtt1.，该基因编码含12个跨膜结构域和若干典型的糖转运域的葡萄糖转运蛋白。其表达受高葡萄糖抑制，受pH影响，说明木霉内葡萄糖转运受 pH 影响（Delgado-Jarana et al.，2003）。里氏木霉（T.reesei）的ΔTrhxt1突变体表现出葡萄糖积累的表型，鉴于此，Ramos等（2006）在里氏木霉（T.reesei）中分离了一个预测编码葡萄糖转运蛋白的基因Trhxt1，并发现该基因的表达受高葡萄糖浓度的抑制，并受氧浓度的调控（Ramos et al.，2006）。Trhxt1在不存在葡萄糖的情况下，其表达在微摩尔水平，当里氏木霉（T.reesei）在含纤维素的培养基上生长时，纤维素的降解使葡萄糖浓度达到微摩尔水平时也诱导该基因的表达，并且该基因在缺氧情况下表达明显下调（Ramos et al.，2006）。

图5.1 葡萄糖的合成和代谢

葡萄糖或者其他单糖的胞外氧化，在其他真菌中常有报道，但在木霉和粘帚霉中则还未见。里氏木霉（T.reesei）和深绿木霉（T.atroviride）中没有葡萄糖氧化酶，但是黑曲霉（Aspergilus niger）的葡萄糖氧化酶能够在深绿木霉（T.atroviride）和里氏木霉（T.reesei）中表达并具有活性（Mach et al.，2004；母敬郁等，2006）。有报道发现，在木素木霉（T.lignorum）、绿色木霉（T.viride）和钩状木霉（T.hamatum）中有抗坏血酸氧化酶（Hatsutori et al.，1994；Nakanishi，1995）。

微生物可以利用不同的碳源，而且不同微生物对碳源的选择和利用效率存在很大差异。当优先选择的碳源存在时，其他碳源的代谢会被一种复杂而严谨的过程抑制，这就是所谓的碳代谢阻遏。为了研究木霉中碳代谢阻遏，利用兼并引物从里氏木霉（T.reesei）和哈茨木霉（T.harzianum）中克隆获得了葡萄糖阻遏基因 cre1，cre1 编码包含锌指的C2H2型DNA结合蛋白，CRE1蛋白与构巢曲霉（A.nidulans）中葡萄糖阻遏基因creA的编码产物相似度为46%。cre1 启动子中包含一些与先前验证的构巢曲霉（A.nidulans）creA基因中结合位点一致的序列元件，creA/CRE1的结合位点是由紧密相连的两个5′-SYGGRG-3′基序组成，并且直接抑制作用仅发生在这种双结合位点（Cubero et al.，1994；Strauss et al.，1995；Ilmén et al.，1996；Takashima et al.，1996a，1996b）；另外，在一小段保守的碱性区域内的色氨酸磷酸化也调节CRE1的DNA结合能力（Cziferszky et al.，2002）。里氏木霉（T.reesei）QM9414中cre1mRNA水平受碳源的影响，在含有葡萄糖的培养基上，cre1mRNA水平降低。这些结果表示cre1的表达可以自我调控。有趣的是，里氏木霉（T.reesei）含有突变体Rut-C30，cre1基因被切断，突变体内cre1基因片段（cre1-1）仅编码含有一个锌指的95个氨基酸，其碳降解物阻遏因此得到解除，它的葡萄糖透过酶活性非常低下，可以超量生产纤维素分解酶，与QM9414不同，Rut-C30可以在含有葡萄糖的培养基上产生纤维素酶mRNAs，将cre1全长转入Rut-C30菌株可以造成cbh1表达的葡萄糖抑制，说明cre1调控纤维素酶的表达（Ilmén et al.，1996）。

碳代谢阻遏抑制表达的基因模型系统已被用于大多数真菌中碳代谢阻遏的研究，而对消除碳代谢阻遏后的基因表达变化很少有人研究。creA/cre1敲除突变体表现出减慢生长、菌丝形态和产孢异常等表型（Shroff et al.，1997；Nakari-Setälä et al.，2009）。Portnoy等（2011）对里氏木霉（T.reesei）的Δcre1突变体和野生型中基因表达差异进行了芯片分析，首次对真菌碳代谢阻遏的分子生理反应进行全面的研究（Portnoy et al.，2011）。如图5.2所示，按照基因表达情况将其分为不同的集群，其中在Δcre1突变体中高表达的基因又因为受生长速率的影响表现为不同的集群：在Δcre1突变体中高表达并不受生长速率影响的C组包含16个基因，仅在具有高生长速率的Δcre1突变体中高表达的基因为E组50个，G组26个基因，Δcre1突变体中的高表达抵消高生长速率抑制表达的影响，26个H组基因在低生长速率的Δcre1突变体中上调表达。而在Δcre1突变体中抑制表达的基因可进一步分为高生长速率诱导表达（F组，36个基因）和低生长速率诱导表达两组（D组，36个基因）。

图5.2 表达集群间的基因分布

注：根据芯片数据，按CRE1的不同调控分为9个集群（CRE1诱导，CRE1抑制，CRE1非依赖）。颜色表示生长率的影响，黑色和深灰色集群表示基因仅受较高生长速率影响，其中深灰色（B、F、G）为表达上调，黑色（A、E）为表达下调，浅灰色（D、H）表示低生长速率上调表达的基因，阴影（C）表示表达不受生长速率影响的基因

（Portnoy et al.，2011）

其中图5.2各集群中的基因包含细胞组分合成、细胞防御、细胞信号、细胞转运、蛋白活性调控、具有结合功能蛋白、蛋白命运、转录、能量、次生代谢、脂类代谢、碳代谢、氨基酸代谢、一般代谢、特异蛋白、假定蛋白等相关基因。

胞内的葡萄糖通过糖酵解（Glycolysis）和戊糖磷酸途径（Pentose Phosphate Pathway）进行分解代谢（图5.1，图5.3），以下主要从糖酵解和戊糖磷酸途径两方面对糖类分解代谢进行总结。

5.1.2.1 糖酵解作用：将葡萄糖转变成丙酮酸

糖酵解作用是葡萄糖转变成丙酮酸的一系列反应，该途径中的关键酶为己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶（图5.3）。有人研究了里氏木霉（T.reesei）中己糖激酶和葡糖激酶及它们在糖类分解代谢中的可能作用（Kubicek-Pranz et al.，1991），发现在不同碳源基质上培养时，能够检测到分别对葡萄糖和果糖具有活性的酶，表明该菌至少能够产生一种己糖激酶和一种葡萄糖激酶。然而，Samuels等（1994）利用电泳技术检测了几种木霉和肉座菌的同工酶，只发现了一个己糖激酶。这种分歧还需要进一步澄清，但两种酶在碳降解物阻遏被解除的里氏木霉（T.reesei）突变株Rut-C30 及F4 或F5 中活性没有改变（Labudova et al.，1983），在两个2-脱氧葡萄糖抗性突变株中也没有改变，表明己糖激酶或者葡萄糖激酶在木霉的葡萄糖调控中没有作用，后来利用构巢曲霉（A.nidulans）进行的研究也得出了类似结论（Ruyter et al.，1996）。

图5.3 碳代谢的主要途径：糖酵解途径和磷酸戊糖途径

对其他糖酵解酶类在基因水平上进行了研究，由于这些酶类理论上的表达很强，对表达工具的构建具有潜在的应用价值。甘油醛-3-磷酸脱氢酶已经从康宁木霉（T.koningii）中分离纯化，其编码基因也已克隆得到（Sakai et al.，1990）。该酶有两种同工酶，它们的区别在于对康宁酸（Koningic Acid）的敏感性不同，康宁酸是由康宁木霉（T.koningii）产生的一种抗生性代谢产物。研究认为氨基酸残基的差别是造成两种酶对康宁酸敏感性不同的原因，其中一种酶的氨基酸残基在174和181为丙氨酸和丝氨酸，而另一种酶在174和181位分别为苏氨酸和苏氨酸（Watanabe et al.，1993）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因也已经从哈茨木霉（T.harzianum）中克隆得到，而且在光诱导的产孢过程中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gpd）mRNA 水平下调，在分生孢子梗和分生孢子中含量最低（Puyesky et al.，1997）。Vanhanen等（1989）和Goldman等（1992）分别从里氏木霉（T.reesei）和绿色木霉（T.viride）中克隆到了编码3-磷酸甘油酸激酶的基因，其5′-端序列含有保守的结合位点，该位点可结合环腺苷控制因子、一种催化蛋白质和碳分解物阻遏抑制因子cre1（Vanhanen et al.，1989；Goldman et al.，1992b）。里氏木霉（T.reesei）的3-磷酸甘油酸激酶基因pgk1还包含一个热激共有序列，对热胁迫没有反应（Vanhanen et al.，1991）。丙酮酸激酶的编码基因也已经从里氏木霉（T.reesei）中克隆到，其蛋白质结构与黑曲霉（A.niger）和构巢曲霉（A.nidulans）的丙酮酸激酶高度相似（Schindler et al.，1993）。在里氏木霉（T.reesei）中，同工酶电泳结果发现了2～3个丙酮酸激酶条带，但点杂交却只发现了一个基因（Schindler et al.，1993）。有证据表明，丙酮酸激酶存在磷酸化现象，这可能就是发现两个电泳迁移条带的原因。

木霉也能够在非糖类碳源中生长，Jackson（1973）研究了绿色木霉（T.viride）对丙烯基乙醇的降解代谢途径，发现进一步的产物为丙烯酸和乙酸，后者进一步代谢为丙酮酸酯，可累积到原始底物量的50%（w/w）（Jackson，1973）。Tye等（1977）通过在甲醇培养基上连续培养，研究了木素木霉（T.lignorum）生长情况，发现最适生长速率较低（μ＝0.026），而且只在低浓度甲醇条件下（0.16%）才能生长。

5.1.2.2 磷酸戊糖途径

另一种常见的糖类分解代谢是磷酸戊糖途径（图5.3）。葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）被转化成果糖-6-磷酸（Fructose-6-phosphate）和甘油醛-3-磷酸（Glyceraldehydes-3-phosphate），反馈进糖酵解途径内。糖酵解途径的主要产物为丙酮酸，戊糖磷酸循环则可以为核酸和核苷酸合成提供戊糖，还可以为辅酶、能量载体等提供NADPH，也可以提供赤藓糖磷酸（Erythrose Phosphate）借莽草酸途径（Shikimic Acid Pathway）合成芬芳族氨基酸（Aromatic Amino Acids）。该路径的关键酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）。

已知真菌对葡萄糖-6-磷酸的分解代谢涉及糖酵解和戊糖磷酸途径，两者所起作用的比例依细胞需要而异。对于戊糖磷酸途径来说，在长枝组的木霉种类中发现了至少2种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的同工酶（Samuels et al.，1994），但Stasz等（1988a）在绿色木霉（T.viride）、哈茨木霉（T.harzianum）、绿木霉（T.virens）、康宁木霉（T.koningii）、钩状木霉（T.hamatum）和多孢木霉（T.polysporum）的菌株中仅检测到单一酶。Stasz等（1988a）检测的是不同菌株的同工酶，因此在方法上是能够发现同工酶差异的，因此他们与Samuels等（1994）结果的差别，很可能是由所使用的菌株不同造成的。Neto（1993）分离纯化并研究了糖酵解途径的磷酸果糖激酶2，该酶在调控方面具有重要意义，发现它不为环腺苷依赖型的磷酸化所调解控制，只为底物的可利用性所调控，这种现象与酵母不同，但与早期关于黑曲霉（A.niger）的报道一致（Harmsen et al.，1992）。

磷酸戊糖途径是NADPH的主要来源，NADPH是许多生物分子尤其是脂类合成所必需的（Berg et al.，2002）。它也为合成氨基酸提供中间产物：组氨酸由核糖-5-磷酸合成，赤藓糖-4-磷酸是合成芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的前提（Berg et al.，2002）。因此，磷酸戊糖途径在蛋白质的合成中起重要作用，被认为与蛋白质高效生产的生物系统相关。磷酸戊糖途径中间产物核糖-5-磷酸也是核酸和核苷酸合成所必需的。磷酸葡萄糖异构酶（PGI）催化糖酵解途径的第二步，使葡萄糖-6-磷酸转变成果糖-6-磷酸。这一酶位于糖酵解和磷酸戊糖途径的第一个结合点，PGI的失活导致代谢流转向磷酸戊糖途径，使产生更多的NADPH。在大肠杆菌（Escherichia coli）中发现PGI的突变株pgi能够产生更多的核苷酸和氨基酸前体（Canonaco et al.，2001）。里氏木霉（T.reesei）中pgi基因被克隆，并且通过里氏木霉数据库分析发现没有与其同源的ORFs（Limón et al.，2011）。

5.1.2.3 葡萄糖代谢命运

糖酵解途径最终将葡萄糖降解成丙酮酸，丙酮酸可以通过有氧呼吸最终产生 CO2，H2O和ATP，也可以通过厌氧途径生成乳酸（图5.1）。研究表明，关键基因的调控变化，控制里氏木霉（T.reesei）中糖酵解途径产物丙酮酸进入有氧或是厌氧途径（Chambergo et al.，2002）。Chambergo等（2002）建立了丝状真菌里氏木霉（T.reesei）的EST数据库。Derisi等（1997）利用的互补DNA芯片技术分析了葡萄糖耗尽时的基因表达谱，并与酿酒酵母（S.cerevisiae）发酵过程中基因时空表达模式进行了比较（图5.4）。里氏木霉（T.reesei）被选为这项研究的材料，因为它的自然栖息地和对营养的要求与酿酒酵母（S.cerevisiae）明显不同。酿酒酵母（S.cerevisiae）一般需要一个高糖浓度的生长环境，而里氏木霉（T.reesei）可以在营养缺乏的环境中生长，并利用胞内水解酶，例如纤维素酶对周围环境中多糖进行水解获得葡萄糖（Beguin，1990）（图 5.1）。对里氏木霉（T.reesei）在葡萄糖耗尽时基因表达模式的分析发现，糖酵解途径最终产物丙酮酸进入有氧而非厌氧途径。而且，在里氏木霉（T.reesei）表达谱中发现了编码三羧酸循环中酶和电子传递链中蛋白质的基因的表达，表明丙酮酸的氧化是通过三羧酸循环进行的，而不是通过发酵产生乙醇，而且乙醛被氧化生成醋酸，而不是还原产生乙醇，从而防止NADH的再生（Chambergo et al.，2002）。

氧气是决定丙酮酸进入有氧途径还是厌氧途径的关键因子，同时，氧气还影响丙酮酸生成的糖酵解途径中关键酶基因的表达。Bonaccorsi等（2006）证明，短暂的缺氧可以抑制糖酵解途径中关键酶基因的表达，并比较了不存在氧时里氏木霉（T.reesei）和酿酒酵母（S.cerevisiae）中糖酵解途径中基因的表达变化（Bonaccorsi et al.，2006）。

5.1.2.4 葡糖异生途径

真菌虽然通过糖酵解途径，可以利用多样的碳源，但如果真菌生长在醋酸培养基上，真菌就要通过糖异生途径合成各种碳水化合物（图5.1）。所谓糖异生，是指非糖的前体物质（例如，乳酸、氨基酸、甘油等）合成葡萄糖的过程。糖异生途径不是糖酵解途径的简单逆转，因为糖酵解作用的激酶（己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶）是不可逆的。糖异生途径为：丙酮酸羧化转变成草酰乙酸，然后磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶将之脱羧和磷酸化生成磷酸烯醇丙酮酸，在经糖酵解途径中的可逆反应转变成果糖-1，6-焦磷酸，提供给寡糖和多糖的合成（图5.1）。

图5.4 当葡萄糖消耗完时，里氏木霉（T.reesei）和酿酒酵母（S.cerevisiae）中编码参与在关键代谢过程中酶的基因表达谱的比较

注：↑和↓的框架分别表示葡萄糖耗尽时表达量升高和降低的基因，→表示表达不受影响的基因，*表示尚未从木霉中分离获得的基因，ADH基因在木霉中没有获得，但是在木霉培养物种乙醇脱氢酶的活性被检测到（Beutler，1984）。其中，FBA：果糖-1，6-二磷酸醛缩酶；TPI：磷酸甘油醛异构酶；TDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶；PGK：磷酸甘油酸激酶；GPM：磷酸甘油酸变位酶；ENO：烯醇化酶；PYK：丙酮酸激酶；PDA：丙酮酸脱氢酶；PCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶；PDC：丙酮酸脱酸酶；ALD：乙醛脱氢酶；ADH：乙醇脱氢酶；ACS：乙酰辅酶A合成酶；CIT：柠檬酸合成酶；ACO：顺乌头酸酶；IDH：异柠檬酸脱氢酶；KDH：a-酮戊二酸脱氢酶；YGR：琥珀酸硫激酶；SDH：琥珀酸脱氢酶；FUM：延胡索酸酶；MDH：苹果酸脱氢酶

（Chambergo et al.，2002）

　 　二、糖有氧氧化

葡萄糖的有氧氧化包括四个阶段。

①糖酵解产生丙酮酸(2丙酮酸、 2ATP、2NADH)

②丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA 2×(CO2、NADH)

③三羧酸循环 2×(2CO2、ATP、3NADH、FADH2)

④呼吸链氧化磷酸化 (NADH-----ATP)

三羧酸循环：乙酰CoA经一系列的氧化、脱羧，最终生成CO2、H2O、并释放能量的过程，又称柠檬酸循环、Krebs循环。

原核生物：①~④阶段在胞质中

真核生物：①在胞质中，②~④在线粒体中

1、丙酮酸脱羧生成乙酰CoA。此反应在真核细胞的线粒体基质中进行，这是连接糖酵解与TCA的中心环节。

1) 丙酮酸脱氢酶系：丙酮酸脱氢酶系是一个十分庞大的多酶体系，位于线粒体膜上，电镜下可见。

E.coli丙酮酸脱氢酶复合体：

分子量：4.5×106，直径45nm，比核糖体稍大。

酶 辅酶 每个复合物亚基数

丙酮酸脱羧酶(E1) TPP 24

二氢硫辛酸转乙酰酶(E2) 硫辛酸 24

二氢硫辛酸脱氢酶(E3) FAD、NAD+ 12

此外，还需要CoA、Mg2+作为辅因子。这些肽链以非共价键结合在一起，在碱性条件下，复合体可以解离成相应的亚单位，在中性时又可以重组为复合体。所有丙酮酸氧化脱羧的中间物均紧密结合在复合体上，活性中间物可以从一个酶活性位置转到另一个酶活性位置，因此，多酶复合体有利于高效催化反应及调节酶在反应中的活性。

2) 反应步骤：

(1)丙酮酸脱羧形成羟乙基-TPP

(2)二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)使羟乙基氧化成乙酰基

(3)E2将乙酰基转给CoA，生成乙酰-CoA

(4)E3氧化E2上的还原型二氢硫辛酸

(5)E3还原NAD+生成NADH

3) 丙酮酸脱氢酶系的活性调节：从丙酮酸到乙酰CoA是代谢途径的分支点，此反应体系受到严密的调节控制，此酶系受两种机制调节。

(1)可逆磷酸化的共价调节：

丙酮酸脱氢酶激酶(EA)(可被ATP激活)

丙酮酸脱氢酶磷酸酶(EB)

磷酸化的丙酮酸脱氢酶(无活性)

去磷酸化的丙酮酸脱氢酶(有活性)

(2)别构调节：ATP、CoA、NADH是别构抑制剂。ATP抑制E1CoA抑制E2NADH抑制E3。

4) 能量变化：1分子丙酮酸生成1分子乙酰CoA，产生1分子NADH(3ATP)。

2、 三羧酸循环(TCA)的过程

TCA循环：每轮循环有2个C原子以乙酰CoA形式进入，有2个C原子完全氧化成CO2放出，分别发生4次氧化脱氢，共释放12ATP。

1) 反应步骤

(1)、 乙酰CoA+草酰乙酸→柠檬酸

柠檬酸合酶，TCA中第一个调节酶：受ATP、NADH、琥珀酰CoA、和长链脂肪酰CoA的抑制受乙酰CoA、草酸乙酸激活。氟乙酰CoA可与草酰乙酸生成氟柠檬酸，抑制下一步反应的酶，据此，可以合成杀虫剂、灭鼠药。

(2)、 柠檬酸→异柠檬酸

由顺鸟头酸酶催化

(3)、 异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸和NADH

异柠檬酸脱氢酶，这是三羧酸循环中第一次氧化脱羧反应， TCA中第二个调节酶：Mg2+(Mn2+ )、NAD+和ADP可活化此酶，NADH和ATP可抑制此酶活性。细胞在高能状态：ATP/ADP、NADH/NAD+比值高时，酶活性被抑制。线粒体内有二种异柠檬酸脱氢酶，一种以NAD+为电子受体，另一种以NADP+为受体。前者只在线粒体中，后者在线粒体和胞质中都有。

(4)、 α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA和NADH

α-酮戊二酸脱氢酶系，TCA循环中的第三个调节酶：受NADH、琥珀酰CoA、Ca2+、ATP、GTP抑制，α-酮戊二酸脱氢酶系为多酶复合体，与丙酮酸脱氢酶系相似(先脱羧，后脱氢)

(5)、 琥珀酰CoA生成琥珀酸和GTP

琥珀酰CoA合成酶(琥珀酸硫激酶)，这是TCA中唯一的底物水平磷酸化反应，直接生成GTP。在高等植物和细菌中，硫酯键水解释放出的自由能，可直接合成ATP。在哺乳动物中，先合成GTP，然后在核苷二磷酸激酶的作用下，GTP转化成ATP。

(6)、 琥珀酸脱氢生成延胡索酸(反丁烯二酸)和FADH

琥珀酸脱氢酶是TCA循环中唯一嵌入线粒体内膜的酶。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，可阻断三羧酸循环。

(7)、 延胡索酸水化生成L-苹果酸

延胡索酸酶具有立体异构特性，OH只加入延胡索酸双键的一侧，因此只形成L-型苹果酸。

(8)、 L-苹果酸脱氢生成草酰乙酸和NADH

L-苹果酸脱氢酶，平衡有利于逆反应，但生理条件下，反应产物草酰乙酸不断合成柠檬酸，其在细胞中浓度极低，少于10-6mol/L，使反应向右进行。

2) TCA循环小结

(1)、总反应式：

丙酮酸 + 4NAD+ + FAD + GDP → 4NADH + FADH2 + GTP + 3CO2 + H2O

乙酰CoA + 3NAD+ + FAD + GDP → 3NADH + FADH2 + GTP + 2CO2 + H2O

(2)、 一次底物水平的磷酸化、二次脱羧反应，三个调节位点，四次脱氢反应。

3个NADH、1个FADH2进入呼吸链

(3)、 三羧酸循环中碳骨架的不对称反应

同位素标记表明，乙酰CoA上的两个C原子在第一轮TCA上并没有被氧化。

被标记的羰基碳在第二轮TCA中脱去。在第三轮TCA中，两次脱羧，可除去最初甲基碳的50%，以后每循环一次，脱去余下甲基碳的50%

3) 一分子Glc彻底氧化产生的ATP数量(按NADH的P/O=3,FADH2的为2来计算)

(在肝脏中)

反应 酶 ATP消耗 产生ATP方式 ATP数量 合计

糖 酵 解 已糖激酶 1 -1 8

磷酸果糖激酶 1 -1

磷酸甘油醛脱氢酶 NADH呼吸链氧化磷酸化 2×3

磷酸甘油酸激酶 底物水平磷酸化 2×1

丙酮酸激酶 底物水平磷酸化 2×1

TCA 丙酮酸脱氢酶复合物 NADH 2×3 30

异柠檬酸脱氢酶 NADH 2×3

α-酮戊二酸脱氢酶复合物 NADH 2×3

琥珀酸脱氢酶 FADH2 2×2

苹果酸脱氢酶 NADH 2×3

琥珀酰CoA合成酶 底物水平磷酸化 2×1

净产生：38ATP

在骨骼肌、脑细胞中，净产生：36ATP

甘油磷酸穿梭，1个NADH生成2个ATP

苹果酸穿梭，1个NADH生成3个ATP

(1)、 磷酸甘油穿梭机制：

磷酸二羟丙酮+NADH+H+→3-磷酸甘油+NAD+

3-磷酸甘油进入线粒体，将2H交给FAD而生成FADH2，FADH2可传递给辅酶Q，进入呼吸链，产生2ATP(3-磷酸甘油脱氢酶的辅酶是FAD)。

(2)、 苹果酸穿梭机制：

胞液中NADH可经苹果酸酶催化，使草酰乙酸还原成苹果酸，再通过苹果酸-α-酮戊二酸载体转运，进入线粒体，由线粒体内苹果酸脱氢酶催化，生成NADH和草酰乙酸，NADH进入呼吸链氧化，生成3ATP。(苹果酸脱氢酶的辅酶是NAD+)

1分子Glc在肝、心中完全氧化，产生38ATP，在骨骼肌、神经系统组织中，产生36ATP。

4) 三羧酸循环的代谢调节

(1)、 柠檬酸合酶(限速酶)：受ATP、NADH、琥珀酰CoA及脂酰CoA抑制。

受乙酰CoA、草酰乙酸激活

(2)、 异柠檬酸脱氢酶：NADH、ATP可抑制此酶，ADP可活化此酶，当缺乏ADP时就失去活性。

(3)、 α-酮戊二酸脱氢酶：受NADH和琥珀酰CoA抑制。

5) TCA的生物学意义

(1) 氧化提供能量。线粒体外的NADH，可通过3-磷酸甘油穿梭和苹果酸穿梭机制，运到线粒体内，经呼吸链再氧化，这两种机制在不同组织的细胞中起作用。

(2) TCA是生物体内其它有机物氧化的主要途径，如脂肪、氨基酸、糖

(3) TCA是物质代谢的枢纽。一方面，TCA是糖、脂肪、氨基酸等彻底氧化分解的共同途径另一方面，循环中生成的草酰乙酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酰CoA和延胡索酸等又是合成糖、氨基酸、脂肪酸、卟啉等的原料，因而TCA将各种有机物的代谢联系起来。TCA是联系体内三大物质代谢的中心环节，为合成其它物质提供C架。

6) TCA的回补反应

三羧酸循环中间物的的回补：在TCA循环中，有些中间产物是合成其它物质的前体，如卟啉的主要碳原子来自琥珀酰CoA，Glu、Asp可以从α-酮戊二酸和草酰乙酸衍生而成，一旦草酰乙酸浓度下降，则会影响TCA循环，因此这些中间产物必须不断补充，以维持TCA循环。

产生草酰乙酸的途径有三个：

(1)、 丙酮酸羧化酶催化丙酮酸生成草酰乙酸

丙酮酸羧化酶是一个调节酶，乙酰CoA可以增加其活性。需要生物素为辅酶

(2)、 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸

在脑、心脏中存在这个反应。

(3)、 Asp、Glu转氨可生成草酰乙酸和α-酮戊二酸

Ile、Val、Thr、Met也会形成琥珀酰CoA，最后生成草酰乙酸

附： 葡萄糖有氧氧化生成的ATP

反　应 辅酶 ATP

第一阶段 葡萄糖　6-磷酸葡萄糖 -1

6-磷酸果糖　1，6双磷酸果糖 -1

2*3-磷酸甘油醛　2*1,3-二磷酸甘油酸 NAD+ 2*3或2*2(详见)

2*1,3-二磷酸甘油酸　2*3-磷酸甘油酸 2*1

2*磷酸烯醇式丙酮酸　2*丙酮酸 2*1

第二阶段 2*丙酮酸　2*乙酰CoA NAD+ 2*3

第三阶段 2*异柠檬酸　2*α-酮戊二酸 NAD+ 2*3

2*α-酮戊二酸　2*琥珀酰CoA NAD+ 2*3

2*琥珀酰CoA　2*琥珀酸 2*1

2*琥珀酸　2*延胡索酸 FAD 2*2

2*苹果酸　2*草酰乙酸 NAD+ 2*3

净生成　38或36个ATP

3、磷酸戊糖途径

也称磷酸己糖支路，发生在胞质中。细胞内Glc的氧化分解，除通过糖酵解，三羧酸循环和发酵外，还能直接氧化分解。即反应开始，在G-6-P上的C2原子上直接氧化，通过一系列转化被分解，此为磷酸戊糖途径。

两个事实：

①用碘乙酸和氟化物抑制糖酵解(磷酸甘油醛脱氢酶)发现Glc的消耗并不因此而受影响，证明葡萄糖还有其它的分解途径

②用14C分别标记Glc的C1和C6，然后分别测定14CO2生成量，发现C1标记的Glc比C6标记的Glc更快、更多地生成14CO2 ，如果糖酵解是唯一的`代谢途径，那么14C1和14C2生成14CO2的速度应该相同。

1)、 反应过程

Glc经磷酸戊糖途径氧化分解可分为两个阶段。

第一阶段：6-磷酸葡萄糖氧化脱羧生成5-磷酸核糖

第二阶段：磷酸戊糖分子重排，产生不同碳链长度的磷酸单糖

(1) 6-磷酸葡萄糖脱氢脱羧生成5-磷酸核酮糖

在此氧化脱羧阶段中，Glc经两次脱氢，一次脱羧，生成5-磷酸核酮糖及NADPH。6-磷酸葡萄糖脱氢酶是磷酸戊糖途径的调控酶，NADPH反馈抑制此酶活性。

(2) 磷酸戊糖异构生成5-磷酸核糖及5-磷酸木酮糖

(表异构酶)5-磷酸木酮糖产率：2/3(异构酶) 5-磷酸核糖产率：1/3

(3) 磷酸戊糖通过转酮、转醛反应生成酵解途径的中间产物(F-6-P，3-磷酸甘油醛)

a. 转酮反应：5-磷酸木酮糖将自身的二碳单位(羟乙酰基)转到5-磷酸核糖的C1上，生成3-磷酸甘油醛和7-磷酸景天庚酮糖。

转酮酶需TPP为辅酶，作用机理与丙酮酸脱氢酶中的TPP类似。

b. 转醛反应：转醛酶将7-磷酸庚酮糖上的三碳单位(二羟丙酮基)转到3-磷酸甘油醛的C1上，生成4-磷酸赤鲜糖和6-磷酸果糖。

(4)转酮反应(转酮酶)

4-磷酸赤鲜糖接受另一分子5-磷酸木酮糖上的二碳单位(羟乙酰基)，生成6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛

柠檬酸循环（citric acid cycle）：也称为三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），Krebs循环。是用于乙酰CoA中的乙酰基氧化成CO2的酶促反应的循环系统，该循环的第一步是由乙酰CoA经草酰乙酸缩合形成柠檬酸。

乙酰coa进入由一连串反应构成的循环体系，被氧化生成h2o和co2。由于这个循环反应开始于乙酰coa与草酰乙酸(oxaloacetate)缩合生成的含有三个羧基的柠檬酸，因此称之为三羧酸循环或柠檬酸循环(citric acid cycle)。在三羧酸循环中，柠檬酸合成酶催化的反应是关键步骤，草酰乙酸的供应有利于循环顺利进行。 其详细过程如下：�

(1)乙酰coa进入三羧酸循环�

乙酰coa具有硫酯键，乙酰基有足够能量与草酰乙酸的羧基进行醛醇型缩合。首先从ch3co基上除去一个h+，生成的阴离子对草酰乙酸的羰基碳进行亲核攻击，生成柠檬酰coa中间体，然后高能硫酯键水解放出游离的柠檬酸，使反应不可逆地向右进行。该反应由柠檬酸合成酶(citrate synthetase)催化，是很强的放能反应。

由草酰乙酸和乙酰coa合成柠檬酸是三羧酸循环的重要调节点，柠檬酸合成酶是一个变构酶，atp是柠檬酸合成酶的变构抑制剂，此外，α-酮戊二酸、nadh能变构抑制其活性，长链脂酰coa也可抑制它的活性，amp可对抗atp的抑制而起激活作用。�

(2)异柠檬酸形成�

柠檬酸的叔醇基不易氧化，转变成异柠檬酸而使叔醇变成仲醇，就易于氧化，此反应由顺乌头酸酶催化，为一可逆反应。

(3)第一次氧化脱酸�

在异柠檬酸脱氢酶作用下，异柠檬酸的仲醇氧化成羰基，生成草酰琥珀酸(oxalosuccinate)的中间产物，后者在同一酶表面，快速脱羧生成α-酮戊二酸(α�ketoglutarate)、nadh和co2，此反应为β-氧化脱羧，此酶需要mn2+作为激活剂。�

此反应是不可逆的，是三羧酸循环中的限速步骤，adp是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，而atp，nadh是此酶的抑制剂。�

(4)第二次氧化脱羧�

在α-酮戊二酸脱氢酶系作用下，α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰coa、nadh+h+和co2，反应过程完全类似于丙酮酸脱氢酶系催化的氧化脱羧，属于α�氧化脱羧，氧化产生的能量中一部分储存于琥珀酰coa的高能硫酯键中。�

α-酮戊二酸脱氢酶系也由三个酶(α-酮戊二酸脱羧酶、硫辛酸琥珀酰基转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶)和五个辅酶(tpp、硫辛酸、hscoa、nad+、fad)组成。�

此反应也是不可逆的。α-酮戊二酸脱氢酶复合体受atp、gtp、naph和琥珀酰coa抑制，但其不受磷酸化/去磷酸化的调控。�

(5)底物磷酸化生成atp�

在琥珀酸硫激酶(succinate thiokinase)的作用下，琥珀酰coa的硫酯键水解，释放的自由能用于合成gtp，在细菌和高等生物可直接生成atp，在哺乳动物中，先生成gtp，再生成atp，此时，琥珀酰coa生成琥珀酸和辅酶a。�

(6)琥珀酸脱氢�

琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)催化琥珀酸氧化成为延胡索酸。该酶结合在线粒体内膜上，而其他三羧酸循环的酶则都是存在线粒体基质中的，这酶含有铁硫中心和共价结合的fad，来自琥珀酸的电子通过fad和铁硫中心，然后进入电子传递链到o2，丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶强有力的竞争性抑制物，所以可以阻断三羧酸循环。�

(7)延胡索酸的水化�

延胡索酸酶仅对延胡索酸的反式双键起作用，而对顺丁烯二酸(马来酸)则无催化作用，因而是高度立体特异性的。�

(8)草酰乙酸再生�

在苹果酸脱氢酶(malic dehydrogenase)作用下，苹果酸仲醇基脱氢氧化成羰基，生成草酰乙酸(oxalocetate)，nad+是脱氢酶的辅酶，接受氢成为nadh+h+(图4-5)。�

三羰酸循环总结：�

乙酰

coa+3nadh++fad+gdp+pi+2h2o�—→2co2+3nadh+fadh2+gtp+3h+ +coash��

①CO2的生成，循环中有两次脱羧基反应(反应3和反应4)两次都同时有脱氢作用，但作用的机理不同，由异柠檬酸脱氢酶所催化的β�氧化脱羧，辅酶是nad+，它们先使底物脱氢生成草酰琥珀酸，然后在mn2+或mg2+的协同下，脱去羧基，生成α-酮戊二酸。

α-酮戊二酸脱氢酶系所催化的α�氧化脱羧反应和前述丙酮酸脱氢酶系所催经的反应基本相同。�

应当指出，通过脱羧作用生成co2，是机体内产生co2的普遍规律，由此可见，机体co2的生成与体外燃烧生成CO2的过程截然不同。�

②三羧酸循环的四次脱氢，其中三对氢原子以nad+为受氢体，一对以fad为受氢体，分别还原生成nadh+h+和fadh2。它们又经线粒体内递氢体系传递，最终与氧结合生成水，在此过程中释放出来的能量使adp和pi结合生成atp，凡nadh+h+参与的递氢体系，每2h氧化成一分子h2o，生成3分子atp，而fadh2参与的递氢体系则生成2分子atp，再加上三羧酸循环中有一次底物磷酸化产生一分子atp，那么，一分子ch2co�scoa参与三羧酸循环，直至循环终末共生成12分子atp。�

③乙酰coa中乙酰基的碳原子，乙酰coa进入循环，与四碳受体分子草酰乙酸缩合，生成六碳的柠檬酸，在三羧酸循环中有二次脱羧生成2分子CO2，与进入循环的二碳乙酰基的碳原子数相等，但是，以CO2方式失去的碳并非来自乙酰基的两个碳原子，而是来自草酰乙酸。

④三羧酸循环的中间产物，从理论上讲，可以循环不消耗，但是由于循环中的某些组成成分还可参与合成其他物质，而其他物质也可不断通过多种途径而生成中间产物，所以说三羧酸循环组成成分处于不断更新之中。�

例如 草楚酰乙酸——→天门冬氨酸

α－酮戊二酸——→谷氨酸

草酰乙酸——→丙酮酸——→丙氨酸

其中丙酮酸羧化酶催化的生成草酰乙酸的反应最为重要。�

因为草酰乙酸的含量多少，直接影响循环的速度，因此不断补充草酰乙酸是使三羧酸循环得以顺利进行的关键。�

三羧酸循环中生成 的苹果酸和草酰乙酸也可以脱羧生成丙酮酸，再参与合成许多其他物质或进一步氧化。

三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）是需氧生物体内普遍存在的代谢途径。原核生物中分布于细胞质，真核生物中分布线上粒体。因为在这个循环中几个主要的中间代谢物是含有三个羧基的有机酸，例如柠檬酸（C6），所以叫做三羧酸循环，又称为柠檬酸循环（citric acid cycle）或者是TCA循环；或者以发现者Hans Adolf Krebs（英1953年获得诺贝尔生理学或医学奖）的姓名命名为Krebs循环。三羧酸循环是三大营养素（糖类、脂类、胺基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、胺基酸代谢联系的枢纽。

基本介绍中文名 ：柠檬酸循环 外文名 ：Citric Acid Cycle 领域 ：生物化学 别名 ：三羧酸循环 简称 ：TCA循环 基本介绍,发现过程,定义,化学反应,总化学反应式,反应式,原理,循环过程,循环总结,调节功能,生物学意义, 基本介绍 柠檬酸循环（citric acid cycle）：也称为三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA循环，TCA），Krebs循环。是用于将乙酰CoA中的乙酰基氧化成二氧化碳和还原当量的酶促反应的循环系统，该循环的第一步是由乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸。反应物乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)(一分子辅酶A和一个乙酰相连)是糖类、脂类、胺基酸代谢的共同的中间产物，进入循环后会被分解最终生成产物二氧化碳并产生H，H将传递给辅酶I--尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) （或者叫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），使之成为NADH + H+和FADH2。 NADH + H+ 和 FADH2 携带H进入呼吸链，呼吸链将电子传递给O2产生水，同时偶联氧化磷酸化产生ATP，提供能量。 Kerbs Cycle 真核生物的线粒体基质和原核生物的细胞质是三羧酸循环的场所。它是呼吸作用过程中的一步，之后高能电子在NAHD+H+和FADH2的辅助下通过电子传递链进行氧化磷酸化产生大量能量。 发现过程 克雷布斯博士在第二次世界大战爆发期间因受到纳粹的迫害，不得不逃往英国。虽然在德国，他是位非常优秀的医生，但是在英国，由于没有行医许可证，得不到社会的承认，他只能转而从事基础医学的研究。 三羧酸循环 刚开始选择课题时，仅仅因为他对食物在体内究竟是如何变成水和二氧化碳这一课题充满了兴趣，他便毫不犹豫地选择了这个课题，并且着手调查前人研究这一课题的各种材料。在报告中，他看到有的学者报告说：“A物质经过氧化变成了B物质。”又有学者说：“C物质经过氧化变成了D物质，然后又进一步变成E物质。”还有学者认为：“C物质是从B物质中得到的。或者可以说，是F物质变成了G物质。”另外一些学者则认为，是“G物质经过氧化变成A物质”等等。看着来自四面八方的研究报告，克雷布斯想，如果把这些零散的数据整理出来，说不定可以发现食物代谢的结构。就像玩解谜游戏那样，克雷布斯将这些数据仔细整理了一番，结果发现食物在体内是按F、G、A、B、C、D、E这样一个顺序变化的。再仔细了解从A到F这些化学物质，发现E和F之间断了链。如果E和F之间存在一种X物质，那么，这条食物循环反应链就完整了。马上集中精力，全力寻找X物质。4年后终于查明，X物质就是如今放在饮料中作为酸味添加剂的柠檬酸。他完成了食物的循环链，并且将它命名为柠檬酸循环。克雷布斯的循环理论解释了食物在体内进入柠檬酸循环后，按照A、B、C、D、E、X、F、G的顺序循环反应，最终氧化成二氧化碳和水。他的伟大不仅仅在于发现了几个化学物质的变化，而且在于将每一个活的变化整理出来，找出了可以解释动态生命现象的结构。由于这一业绩，他在1953年获诺贝尔生理学或医学奖。柠檬酸循环也叫三羧酸循环或TCA循环。进入体内的营养成分在糖酵解→柠檬酸循环→电子传递等一系列呼吸作用下得到分解，产生能量。 定义 三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle ）是一个由一系列酶促反应构成的循环反应系统，在该反应过程中，首先由乙酰辅酶A（C2）与草酰乙酸（OAA）（C4）缩合生成含有3个羧基的柠檬酸（C6），经过4次脱氢（3分子NADH+H+和1分子FADH2），1次底物水平磷酸化，最终生成2分子CO2，并且重新生成草酰乙酸的循环反应过程。 化学反应 乙酰辅酶A在循环中出现：柠檬酸(I)是循环中第一个产物，它是通过草酰乙酸(X)和乙酰辅酶A(XI)的乙酰基间的缩合反应生成的。如上所述，乙酰辅酶A是早先进行的糖酵解，胺基酸降解或脂肪酸氧化的一个产物。 化学反应 总化学反应式 反应式 Acetyl-CoA + 3 NAD + FAD + GDP + P i + 2 H 2 O →CoA-SH + 3 NADH + 3 H + FADH 2 + GTP + 2 CO 2 值得注意的是，CO2的两个C并不来源於乙酰CoA，而是OAA。 原理 两个碳原子以CO 2 的形式离开循环。循环最后草酰乙酸会再次生成，再次从乙酰辅酶A中得到两个碳原子。就是说，一分子六碳化合物（柠檬酸）经过多部反应分解成一分子四碳化合物（草酰乙酸）。草酰乙酸会在接下来的反应中遵循同样的途径获得两个碳原子，再次成为柠檬酸。 能量会在接下来的其中一步反应里以GTP的形式释放（和ATP一样，是细胞的能量货币）。但是循环中生成的氢载体（NADH + H and FADH 2 ）将会在细胞呼吸链里释放更多的能量 ，这也正是细胞呼吸的主要目的。柠檬酸循环的前提是，早先进行的糖酵解等过程能提供足够的活化乙酸，以乙酰辅酶A的形式出现在循环。NADH + H 和 FADH 2 是辅酶，它们能携带质子和电子，并在需要的时候释放它们。 循环中产生的总能量为一分子ATP（准确来说是：GTP），而细胞呼吸的全部四步反应（包括呼吸链中的内呼吸），一个葡萄糖分子则产生32分子的ATP。2002年之前一直认为是38ATP，当时认为一个FADH2可以产生2个ATP，一个NADH2可以产生3个ATP，这是理想化化学计算的结果。实测一个FADH2可以产生1.5个ATP，一个NADH2可以产生2.5个ATP。详情请查阅电子传递链与氧化磷酸化。 如进行苹果酸穿梭则不会减少能量，还是32ATP，在脑等部位会进行3磷酸甘油穿梭，减少2分子ATP，最终净产生30ATP。所以说，在生物化学专业答题时需回答32或30。 循环过程 乙酰-CoA进入由一连串反应构成的循环体系，被氧化生成H 2 O和CO 2 。由于这个循环反应开始於乙酰CoA与草酰乙酸(oxaloaceticacid)缩合生成的含有三个羧基的柠檬酸，因此称之为三羧酸循环或柠檬酸循环(citratecycle)。在三羧酸循环中，柠檬酸合成酶催化的反应是关键步骤，草酰乙酸的供应有利于循环顺利进行。其详细过程如下： 1、乙酰-CoA进入三羧酸循环 乙酰CoA具有硫酯键，乙酰基有足够能量与草酰乙酸的羧基进行醛醇型缩合。首先柠檬酸合酶的组氨酸残基作为碱基与乙酰-CoA作用，使乙酰-CoA的甲基上失去一个H+，生成的碳阴离子对草酰乙酸的羰基碳进行亲核攻击，生成柠檬酰-CoA中间体，然后高能硫酯键水解放出游离的柠檬酸，使反应不可逆地向右进行。该反应由柠檬酸合酶(citratesynthase)催化，是很强的放能反应。由草酰乙酸和乙酰-CoA合成柠檬酸是三羧酸循环的重要调节点，柠檬酸合酶是一个变构酶，ATP是柠檬酸合酶的变构抑制剂，此外，α-酮戊二酸、NADH能变构抑制其活性，长链脂酰-CoA也可抑制它的活性，AMP可对抗ATP的抑制而起激活作用。 2、异柠檬酸形成 柠檬酸的叔醇基不易氧化，转变成异柠檬酸而使叔醇变成仲醇，就易于氧化，此反应由顺乌头酸酶催化，为一可逆反应。 3、第一次脱氢——异柠檬酸脱氢酶 在异柠檬酸脱氢酶作用下，异柠檬酸的仲醇氧化成羰基，生成草酰琥珀酸(oxalosuinicacid)的中间产物，后者在同一酶表面，快速脱羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)、NADH和CO2，此反应为β-氧化脱羧，此酶需要镁离子作为激活剂。此反应是不可逆的，是三羧酸循环中的限速步骤，ADP是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，而ATP，NADH是此酶的抑制剂。 4、第二次脱氢——α-酮戊二酸脱氢酶 在α-酮戊二酸脱氢酶系作用下，α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰-CoA、NADH·H+和CO 2 ，反应过程完全类似于丙酮酸脱氢酶系催化的氧化脱羧，属于α-氧化脱羧，氧化产生的能量中一部分储存于琥珀酰coa的高能硫酯键中。α-酮戊二酸脱氢酶系也由三个酶(α-酮戊二酸脱羧酶、硫辛酸琥珀酰基转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶)和五个辅酶(tpp、硫辛酸、hscoa、NAD+、FAD)组成。此反应也是不可逆的。α-酮戊二酸脱氢酶复合体受ATP、GTP、NADH和琥珀酰-CoA抑制，但其不受磷酸化/去磷酸化的调控。 5、底物磷酸化生成ATP 在琥珀酸硫激酶(suinatethiokinase)的作用下，琥珀酰-CoA的硫酯键水解，释放的自由能用于合成gtp，在细菌和高等生物可直接生成ATP，在哺乳动物中，先生成GTP，再生成ATP，此时，琥珀酰-CoA生成琥珀酸和辅酶A。 6、第三次脱氢——琥珀酸脱氢酶 琥珀酸脱氢酶(suinatedehydrogenase)催化琥珀酸氧化成为延胡索酸。该酶结合在线粒体内膜上，而其他三羧酸循环的酶则都是存在线粒体基质中的，这酶含有铁硫中心和共价结合的FAD，来自琥珀酸的电子通过FAD和铁硫中心，然后进入电子传递链到O 2 ，丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶强有力的竞争性抑制物，所以可以阻断三羧酸循环。 7、延胡索酸的水化 延胡索酸酶仅对延胡索酸的反式双键起作用，而对顺丁烯二酸(马来酸)则无催化作用，因而是高度立体特异性的。 8、第四次脱氢——苹果酸脱氢酶（草酰乙酸再生） 在苹果酸脱氢酶(malicdehydrogenase)作用下，苹果酸仲醇基脱氢氧化成羰基，生成草酰乙酸(oxalocetate)，NAD+是脱氢酶的辅酶，接受氢成为NADH·H+(图4-5)。 在此循环中，最初草酰乙酸因参加反应而消耗，但经过循环又重新生成。所以每循环一次，净结果为1个乙酰基通过两次脱羧而被消耗。循环中有机酸脱羧产生的二氧化碳，是机体中二氧化碳的主要来源。在三羧酸循环中，共有4次脱氢反应，脱下的氢原子以NADH+H+和FADH2的形式进入呼吸链，最后传递给氧生成水，在此过程中释放的能量可以合成ATP。乙酰辅酶A不仅来自糖的分解，也可由脂肪酸和胺基酸的分解代谢中产生，都进入三羧酸循环彻底氧化。并且，凡是能转变成三羧酸循环中任何一种中间代谢物的物质都能通过三羧酸循环而被氧化。所以三羧酸循环实际是糖、脂、蛋白质等有机物在生物体内末端氧化的共同途径。三羧酸循环既是分解代谢途径，但又为一些物质的生物合成提供了前体分子。如草酰乙酸是合成天冬氨酸的前体，α-酮戊二酸是合成谷氨酸的前体。一些胺基酸还可通过此途径转化成糖。 三羧酸循环 循环总结 乙酰-CoA+3NAD++FAD+ADP+Pi+CoA-SH—→2CO2+3NADH+FADH2+ATP+3H++CoA-SH 1、CO 2 的生成，循环中有两次脱羧基反应(反应3和反应4)两次都同时有脱氢作用，但作用的机理不同，由异柠檬酸脱氢酶所催化的β氧化脱羧，辅酶是nad+，它们先使底物脱氢生成草酰琥珀酸，然后在Mn2+或Mg2+的协同下，脱去羧基，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸脱氢酶系所催化的α氧化脱羧反应和前述丙酮酸脱氢酶系所催经的反应基本相同。应当指出，通过脱羧作用生成CO 2 ，是机体内产生CO 2 的普遍规律，由此可见，机体CO 2 的生成与体外燃烧生成Co2的过程截然不同。 2、三羧酸循环的四次脱氢，其中三对氢原子以NAD+为受氢体，一对以FAD为受氢体，分别还原生成NADH+H+和FADH2。它们又经线粒体内递氢体系传递，最终与氧结合生成水，在此过程中释放出来的能量使adp和pi结合生成ATP，凡NADH+H+参与的递氢体系，每2H氧化成一分子H 2 O，生成分子2.5ATP，而FADH2参与的递氢体系则生成1.5分子ATP，再加上三羧酸循环中一次底物磷酸化产生一分子ATP，那么，一分子柠檬酸参与三羧酸循环，直至循环终末共生成10分子ATP。 3、乙酰-CoA中乙酰基的碳原子，乙酰-CoA进入循环，与四碳受体分子草酰乙酸缩合，生成六碳的柠檬酸，在三羧酸循环中有二次脱羧生成2分子CO 2 ，与进入循环的二碳乙酰基的碳原子数相等，此时乙酰辅酶A中的2个碳已全部转变为CO 2 ，同时其中的一部分能量已转变成了NADH和ATP中的能量。 4、三羧酸循环的中间产物，从理论上讲，可以循环不消耗，但是由于循环中的某些组成成分还可参与合成其他物质，而其他物质也可不断通过多种途径而生成中间产物，所以说三羧酸循环组成成分处于不断更新之中。 下面以转氨基作用偶联尿素循环为例，TCA的中间产物可以作为其他代谢途径的前体。 例如草酰乙酸——→天冬氨酸（Asp） α－酮戊二酸——→谷氨酸（Glu） 草酰乙酸——→丙酮酸——→丙氨酸（Ala） 其中丙酮酸羧化酶催化的生成草酰乙酸的反应最为重要。因为草酰乙酸的含量多少，直接影响循环的速度，因此不断补充草酰乙酸是使三羧酸循环得以顺利进行的关键。三羧酸循环中生成的苹果酸和草酰乙酸也可以脱羧生成丙酮酸，再参与合成许多其他物质或进一步氧化。 调节功能 糖有氧氧化分为两个阶段，第一阶段糖酵解途径的调节在糖酵解部分已探讨过，下面主要讨论第二阶段丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA并进入三羧酸循环的一系列反应的调节。丙酮酸脱氢酶复合体、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶复合体是这一过程的限速酶。 丙酮酸脱氢酶复合体受别构调控也受化学修饰调控，该酶复合体受它的催化产物ATP、乙酰-CoA和NADH有力的抑制，这种别构抑制可被长链脂肪酸所增强，当进入三羧酸循环的乙酰-CoA减少，而AMP、CoA和NAD+堆积，酶复合体就被别构激活，除上述别位调节，在脊椎动物还有第二层次的调节，即酶蛋白的化学修饰，PDH含有两个亚基，其中一个亚基上特定的一个丝氨酸残基经磷酸化后，酶活性就受抑制，脱磷酸化活性就恢复，磷酸化-脱磷酸化作用是由特异的磷酸激酶和磷酸蛋白磷酸酶分别催化的，它们实际上也是丙酮酸酶复合体的组成，即前已述及的调节蛋白，激酶受ATP别构激活，当ATP高时，PDH就磷酸化而被激活，当ATP浓度下降，激酶活性也降低，而磷酸酶除去PDH上磷酸，PDH又被激活了。 对三羧酸循环中柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶的调节，主要通过产物的反馈抑制来实现的，而三羧酸循环是机体产能的主要方式。因此ATP/ADP与NADH/NAD+两者的比值是其主要调节物。ATP/ADP比值升高，抑制柠檬酸合成酶和异柠檬酶脱氢酶活性，反之ATP/ADP比值下降可激活上述两个酶。NADH/NAD+比值升高抑制柠檬酸合成酶和α－酮戊二酸脱氢酶活性，除上述ATP/ADP与NADH/NAD+之外其它一些代谢产物对酶的活性也有影响，如柠檬酸抑制柠檬酸合成酶活性，而琥珀酰-CoA抑制α-酮戊二酸脱氢酶活性。总之，组织中代谢产物决定循环反应的速度，以便调节机体ATP和NADH浓度，保证机体能量供给。 生物学意义 TCA的生物学意义可以分为两方面论述，1.能量代谢 2.物质代谢 1.三羧酸循环是机体将糖或其他物质氧化而获得能量的最有效方式。在糖代谢中，糖经此途径氧化产生的能量最多。毎分子葡萄糖经有氧氧化生成H2O和CO2时，可净产生32分子ATP或30分子ATP。 2.三羧酸循环是糖、脂，蛋白质，甚至核酸代谢，联络与转化的枢纽。 （1）此循环的中间产物（如草酰乙酸、α-酮戊二酸）是合成糖、胺基酸、脂肪等的原料。 其中OAA可以脱羧成为PEP，参与糖异生，重新合成生物体内的能源。acetylCOA可以合成丙二酰ACP，参与软脂酸合成。OAA可以在转氨酶的参与下，进行转氨基作用，生成Asp，参与urea cycl，合成精氨酸代琥珀酸等尿素前体物质。其中某些代谢物质，还能参与嘌呤和嘧啶的合成，甚至合成卟啉ring，参与血红蛋白合成。 （2）TCA是糖、蛋白质和、和脂肪彻底氧化分解的共同途径：蛋白质的水解产物（如谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等脱氨后或转氨后的碳架）要通过三羧酸循环才能被彻底氧化，产生大量能量；脂肪分解后的产物脂肪酸经β-氧化后生成乙酰CoA以及甘油，甘油经过EMP途径也生成乙酰CoA，最终也要经过三羧酸循环而被彻底氧化。糖代谢的所有途径最后生成Pyruvate，脱氢成为acetyl-CoA，参与TCA。 综上所述，三羧酸循环是联系三大物质代谢的，也是能量代谢的枢纽。

（1）促生长添加剂：包括喹乙醇、猪快长、速育精、血多素、肝渣、畜禽乐、肥猪旺等。

（2）微量元素添加剂：包括铜、铁、锌、钴、锰、碘、硒、钙、磷等，具有调节机体新陈代谢，促进生长发育，增强抗病能力和提高饲料利用率等作用。添加后生猪日增重一般可提高10%～20%，降低饲料成本8%～10%。

（3）维生素添加剂：包括维生素A、维生素D2、维生素E、维生素K3、维生素B1、维生素D3、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C以及多种维生素、胆碱、肉猪预混料添加剂、维他胖、泰德维他-80、法国肥、保健素、强壮素等，可根据猪的不同品种和不同生长发育阶段，科学地选择使用。

（4）氨基酸添加剂：包括赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸等18种氨基酸，以及生宝、禽畜宝、饲料酵母、羽毛粉、蚯蚓粉、饲喂乐等。目前使用最多的有赖氨酸和蛋氨酸等添加剂，在日粮中加入0.2%的赖氨酸喂猪，日增重可以提高10%左右。

（5）抗生素添加剂：包括土霉素、金霉素、新霉素、盐霉素、四环素、杆菌素、林可霉素、康泰饲料添加剂及猪宝、保生素等。

（6）驱虫保健饲料添加剂：包括安宝球净、克球粉、喂宝-34等。

（7）防霉添加剂或饲料保存剂：由于米糠、鱼粉等精饲料含油脂率高，存放时间久易氧化变质，添加乙氧喹啉等，可防止饲料氧化，添加丙酸、丙酸钠等可防止饲料霉变。

（8）中草药饲料添加剂：包括大蒜、艾粉、松针粉、芒硝、党参叶、麦饭石、野山楂、橘皮粉、刺五加、苍术、益母草等。

（9）缓冲饲料添加剂：包括碳酸氢钠、碳酸钙、氧化镁、磷酸钙等。

（10）饲料调味性添加剂：包括谷氨酸钠、食用氯化钠、枸橼酸、乳糖、麦芽糖、甘草等。

（11）激素类添加剂：包括生乳灵、助长素、育肥灵等。

（12）着色吸附添加剂：主要有味黄素（如红辣椒、黄玉米面粉等）。

（13）酸化剂添加剂：包括柠檬酸、延胡索酸、乳酸、乙酸、盐酸、磷酸及复合酸化剂等，在生猪日粮中添加适量的酸化剂，可显著提高猪日增重，降低饲养成本。