聚乙二醇和聚乙烯醇的区别

蛋白质浓缩

浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

减压加温蒸发浓缩

通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。

空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。

冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。

吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。

超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值

膜名称

分子量截留值

孔的大的平均直径

XM －300

300，000

140

XM－200

100，000

55

XM－50

50，000

30

PM－30

30，000

22

UM－20

20，000

18

PM－10

10，000

15

UM－2

1，000

12

UM05

500

10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

相对密度 本品的相对密度（通则0601）在25℃为1.06～1.09。

黏度 本品的运动黏度（通则0633第一法），在30℃时（毛细管内径为2.0mm或适合的毛细管内径）为300～450mm2/s。

酸值 取本品约10g，精密称定，置250ml锥形瓶中，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）50ml使溶解，加热回流10分钟，放冷，加酚酞指示液5滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，酸值（通则0713）不得过2.0。

过氧化值 本品的过氧化值（通则0713）不得过10。

皂化值 本品的皂化值（通则0713）为45～55。

（一）植物细胞工程

1.理论基础（原理）：细胞全能性

2.植物组织培养技术（b）

（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―――→愈伤组织 ―――→试管苗 ――→植物体（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。A 植物繁殖微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输B 作物新品种培育单倍体育种：a过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab四种类型）；对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养）；得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型）。b 优点：明显缩短育种年限C 突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体）D 细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。

（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。

3.植物体细胞杂交技术

（1）过程：

（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。

（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。

（二）动物细胞工程

1. 动物细胞培养（a）

（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。

（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。

（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

（4）动物细胞培养需要满足以下条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。

（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。

2.动物体细胞核移植技术和克隆动物

（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。

（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。

（3）体细胞核移植的大致过程是：高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）[注：为什么要用卵细胞？它可以提供充足的营养；操作简便；细胞质不会抑制细胞核全能性的表达]；将供体细胞注入去核卵母细胞；通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛

（4）体细胞核移植技术的应用：①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；②保护濒危物种，增大存活数量；③生产珍贵的医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植等。

（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。

3.动物细胞融合

（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。

（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。

（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。

（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：

细胞工程植物体细胞杂交 动物细胞融合

理论基础 细胞的全能性、细胞膜的流动性细胞增殖、细胞膜的流动性

融合前处理 酶解法去除细胞壁（纤维素酶、果胶酶） 注射特定抗原，免疫处理正常小鼠

诱导手段物理法:离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇（PEG）

物理法:离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇 生物法：灭活的病毒（灭活的仙台病毒）

诱导过程第一步：原生质体的制备 （酶解法） 第二步：原生质体融合 （物、化法） 第三步：杂种细胞的筛选和培养 第四步：杂种植株的诱导与鉴定正常小鼠免疫处理 动物细胞的融合 （物、化、生法） 杂交瘤细胞的筛选与培养 专一抗体检验阳性细胞培养 单克隆抗体的提纯

用途和意义克服远缘杂交的不亲和障碍，大大扩展杂交的亲本组合范围 应用：白菜-甘蓝等杂种植株（1） 制备单克隆抗体 （2） 诊断、治疗、预防疾病，例如“生物导弹”治疗癌症

4.单克隆抗体

（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。

（2）单克隆抗体的制备过程：对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠产生了效应B细胞）；提取B淋巴细胞；同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取；促使它们细胞融合[注：融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选]；在特定的选择培养基上筛选出融合的杂种细胞[特点是能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体]；然后对它进行克隆化培养和抗体检测[筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞]；最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。

（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。

（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。

（5）单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。

蛋白质的沉淀方法中只有盐析法可以用于酶的制备过程。

蛋白质沉淀的概念：

蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。

定性分析：

蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件，不致互相凝集。然而除掉这两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂)蛋白质便容易凝集析出。如将蛋白质溶液pH调节到等电点，蛋白质分子呈等电状态，虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失了。但是还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用，如果这时再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节pH到等电点，也同样可使蛋白质沉淀析出。

沉淀方法：

1、盐析法 —— 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化；

在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。影响盐析的因素包括：蛋白质浓度、离子强度和类型、PH值、温度等。针对温度这一条，需要强调：在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。

使用硫酸铵沉淀蛋白需要注意：硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。

2、有机溶剂沉淀法 —— 多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化；

有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。该法优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；3）在生化制备中应用比盐析法广泛。但是，在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。因此，操作要求在低温下进行。有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。

3、等电点沉淀法 —— 此法单独应用较少，多与其它方法结合使用；

两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质，再调PH3.0去除酸性蛋白质。利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。

4、重金属盐沉淀法 —— 常用于抢救误服重金属盐中毒的病人；

许多有机物质包括蛋白在内，在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成沉淀。根据有机物与它们之间的作用机制，可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合物类，如铜锌镉；亲羧酸疏含氮化合物类，如钙镁铅；亲硫氢基化合物类，如汞银铅。 蛋白质-金属离子复合物的重要性质是它们的溶解度对溶液的介电常数非常敏感，调整水溶液的介电常数（如加入有机溶剂），即可沉淀多种蛋白。沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。

5、生物碱试剂以及某些酸类沉淀法 —— 常用于除掉体系中的蛋白质；

蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。

6、非离子多聚物沉淀法

非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。这类非离子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠等，其中应用最多的是聚乙二醇。用非离子多聚物沉淀生物大分子和微粒，一般有两种方法：1）选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。此方法基于不同生物分子表面结构不同，有不同分配系数。并外加离子强度、PH值和温度等影响，从而扩大分离效果。2）选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。该方法操作时先离心除去大悬浮颗粒，调整溶液PH值和温度至适度，然后加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷贮一段时间，即形成沉淀。非离子多聚物沉淀法的应用，主要在细菌和病毒、核酸和蛋白质三个方面。如可以葡聚糖和聚乙二醇为两相系统分离单链DNA、双链DNA和多种RNA制剂；在20世纪六十年代，聚乙二醇开始用于蛋白质纯化，其分子量多在2000-6000之间变化，多数认为PEG6000沉淀蛋白较好。右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物也常用于蛋白质沉淀中。

7、加热凝固法 —— 用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。

将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固(coagulation)而沉淀。加热首先是加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。

蛋白质的变性、沉淀，凝固相互之间的关系：

蛋白质变性后并不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。例如，蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带着大量电荷，故仍溶于强酸或强减之中。但若将强碱和强酸溶液的pH调节到等电点，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。

十大烂脸洗面奶。1，资生堂洗颜专科洗面奶，这款洗面奶的价格比较便宜，所以很多人会为了便宜买了此洗面奶，但是这款洗面奶不好的一点就是其中含有大量皂基成分，这对于敏感肌来说是非常不适的，即使是普通肌肤长期使用也会损伤皮肤屏障，导致闭口。

2，高丝雪肌精洗面奶，这款洗面奶也是皂基洁面，清洁力太强，一般用完后就会感觉拔干以及非常刺激，正常皮肤也能偶尔使用，但极不适合干皮肤和敏感肌，有很高的致痘风险。

3，丝塔芙洗面奶，这款洗面奶清洁度极差，极少起泡，洗后仍有残渣的感觉，而且还含有防腐成分，对于干皮来说清洁力可能足够，但是油痘肌要谨慎购买。

说明：

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10，露得清深层柔珠洗面乳，这款洗面奶虽然有很好的去角质作用，但不能经常使用，因为它清洁力强，也比较刺激性大，经常用的话会让皮肤受不了。