巯基乙醇的介绍

CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；

NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

简言之，无论哪种抽提方法，药品的作用基本都是一样的。

巯基乙醇的还原性很强，能够将二硫键还原为硫醇（用R-S-S-R‘表示某含二硫键化合物）：2HS-CH2CH2OH + RSSR’ → RSH + R‘SH + HO-CH2CH2-S-S-CH2CH2-OH称之为破坏了二硫键。

蛋白质的一级结构：蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。主要化学键：肽键，有些蛋白质还包含二硫键。

蛋白质的二级结构：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。二级结构以一级结构为基础，多为短距离效应。

分子结构数据

摩尔折射率：20.74。

摩尔体积（cm3/mol）：73.1。

等张比容（90.2K）：180.3。

表面张力（dyne/cm）：37.0。

极化率（10-24cm3）：8.22。

溶解性：能与水、乙醇、乙醚和苯以任意比例混溶。

以上内容参考：百度百科-巯基乙醇

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏。

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性。

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中。

Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。CTAB 4g

NaCl 16.364 g。

1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)。。

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌。

冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

扩展资料：

适当的加一下热，比如50度或者60度，可以快速溶解，般这个温度对试剂的品质没有什么影响如果不是浓度太高的话。

如果浓度太高，可能冷却后又会沉淀析出来。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl) CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物而不沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

2×CTAB提取缓冲液成分：2%(w/v)CTAB，100mM Tris (pH 8.0)，20mM EDTA,1.4 MNaCl,，0.2%(v/v) 还原剂(随用随加) 。

参考资料来源：百度百科——十六烷基三甲基溴化铵

通常的说法是：加入

8-羟基奎啉，上面盖上一层缓冲液，避光保存于

4

C

冰箱中，可以保存一个月。但是有研究发现，光线对苯酚的影响可以忽略，温度及空气对苯酚的影响很大。所以建议：2-巯基乙醇作抗氧化剂以方便今后观察氧化与否；分装至密封良好的

50

-

100ml

小塑料容器中，将一个月用量的保存于

4

C，其它的保存于

-20

C。

巯基乙醇提取rna作用 Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是强的蛋白变性剂，可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。 而Tris的主要作用是防治止酚类氧化，若酚类氧化，则会形成醌（两个苯环），醌含有强自由基，会破坏核酸结构。 同时，由于PH值大于7，在碱性环境中DNA处于水相，RNA处于有机相。从而分离上清，即可得到DNA。 Tris饱和酚的配置： 1、冰箱取出重蒸酚，室温放置－－－68度水浴溶化，切勿立即放入68度的水浴中，以防玻璃炸裂 2、加8－羟基喹啉至0.1％和β－巯基乙醇至0.2％，（原液14. 4MOL/ML），混匀，溶液呈现黄色，倒入分液漏斗中（也可在烧杯中进行） 3、加入等溶剂的1MOL/ML的Tris(PH8.0),反复混匀后，静至分层；放出下层黄色酚液，弃上层 4、加固体Tris约1g/100ml酚，摇匀，去水相 5、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)平衡数次，至PH为8.0 6、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)于棕色瓶中4度保存 7、如黄色消失或呈粉红色（说明酚已经被氧化），则不能使用 巯基乙醇提取rna作用机理 RNasin是一类从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白质，鼠肝RNasin分子量为40KD；来源于人胎盘的RNasin分子量为51KD，等电点为4.7，最适pH为7～8。RNasin能与RNase非共价结合（Ki=3×1010）从而抑制了它们的活力，RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂。1mmol/L的二巯基乙醇对于RNasin的发挥抑制RNase的最大活性非常重要。 RNasin最好不要与某些蛋白质变性剂（如7mol/L的尿素）同时使用，因为尿素能使RNase-RNasin复合物分离，并释放出活性的RNase。 rna提取中乙醇的作用 1. 按照Invitrogen公司的Tizro说明书，在提取RNA过程中进行到加入75%乙醇后，可使RNA沉淀在4度保存一个月，在-20度保存一年。 2. 一般这种方法用的比较少，因为每次提RNA都是一气下来，中间没有停顿的，除非一次提很多，上午时间不够用，可进行到加入乙醇未知，然后放到-20度冰箱，下午可继续进行。 3. 一般保存方法都是RNA溶解到无RNase的水中，然后-80度冰箱保存。 4. 反复冻融对RNA的长时间保存肯定是有影响的，可分成小量保存，尽量减少冻融。 5. 现在有些试剂公司有相关的产品，可用于保存RNA，不过可能会有植物或动物，细胞或组织之分。 二巯基丙醇怎么提取 二巯基丙醇古代叫砒霜解药，二巯丙醇为无色或几乎无色、易流动的澄明液体。有类似葱蒜的气味。在甲醇、乙醇或苯甲酸苄酯中极易溶解，溶于水，在脂肪油中不溶，可防止砷、汞、铋、金、锑等金属对身体组织的中毒作用。名称介绍 中文名称：2,3-二巯基丙醇；2,3-二氢硫基-1-丙醇；2,3-二巯基-1-丙醇；二巯基丙醇；3-羟基-1,2-丙二硫醇；巴尔；巴尔双硫代甘油；英国抗路易斯气剂 dna提取中巯基还原剂 DTT作用如下： 1、DTT的作用之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在存在氧气的情况下。 这种二聚化大大降低了一些偶联反应实验（如DNA在生物感应器中的固定）的效率；而在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除去，就可以降低DNA的二聚化。 2、DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。 但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M盐酸胍、8M尿素或1%SDS）。 反之，根据DTT存在情况下，二硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。 DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。分子式为C4H10O2S2，分子量为154.25，纯度>99%。常用还原剂，有抗氧化作用，进口分装。DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。 而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些。 RNA提取中巯基乙醇如何除去 是 TRIzol有毒性，trizol中含有苯酚，苯酚是刺激性气味。对呼吸道有伤害，闻久了会有晕的感觉。 1、TRIZOL的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。 2、苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。 巯基乙醇作用Rna提取 Trizol就是酚氯仿提取法的常用试剂 Trizol中有酚，异硫氰酸胍和B-巯基乙醇。他们的作用都是使蛋白变性，使蛋白质与核酸解聚。加入氯仿，用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，就是白色层，只有RNA分子留在水相，但溶液pH不在酸性范围内，会使DNA溶解在水相，所以使用时按照说明书要求根据细胞数或培养器皿底面积适量加入Trizol。最后异丙醇沉淀，将水相中RNA提取出来。 提rna加巯基乙醇 材料、试剂及器具 1、 材料 总rna提取物。 2、 试剂 (1)0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。 (2)10x电泳缓冲液。 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0) NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L (3)50mL变性琼脂糖凝胶(1%) (4)10x电泳缓冲液 5 mL 琼脂糖 0.5 g 0.1%DEPC水 36.5 mL 加热溶解，稍冷却，加入8.5 mL 37%甲醛。 (5)上样缓冲液：50%，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。 (6)甲酰胺(去离子)。

主要提一下CTAB法提取植物基因组DNA原理。

1 将植物组织置于2 mL离心管，加入2颗灭菌钢珠，液氮冷冻，球磨仪研碎；

2 加入800 μL CTAB提取缓冲液，65℃水浴1 h，期间每隔15 min颠倒混匀若干次；

说明：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、 多糖、酚 类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

Tris-HCl

提供缓冲环境，防止核酸被 破 坏。

EDTA

抑制DNase活性。

NaCl

提供高盐环境，使DNA充分溶解。

β-巯基乙醇

抗氧化剂，去除酚、糖，能与酚形成络合物，也可与糖结合。

3 加入800 μL苯酚：氯仿：异丙醇（25:24:1），上下颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，将上层水相转移至新的2 mL离心管；

4 加入等体积氯仿：异丙醇（24:1），上下颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，将上清转移至新的1.5 mL离心管；

说明：原理同上一步，抽提更彻底。

5 加入0.6倍体积异丙醇，-20℃沉淀30 min以上；

说明：异丙醇用来沉淀DNA，沉淀所需体积小，但难挥发。

6 12000 rpm离心10 min，弃去上清，加入75%乙醇洗涤两次；

说明：其实乙醇也可用于DNA的沉淀，其虽易挥发，但所需体积大，因此普遍使用异丙醇沉淀，然后用乙醇洗涤除去残留的异丙醇。另外，DNA不溶于乙醇，但CTAB和一些蛋白质可溶，低温乙醇还可抑制DNase活性，降低分子运动，易于DNA沉淀。

7 真空干燥仪干燥40 min左右，加水溶解DNA。

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法

提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行

SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离

CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~

DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了

以下是一些具体方法，希望有用

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80?C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8)1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4)200mMNaCl5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)

25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH5.2)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

植物基因组提取(CATB法)

作者：时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1. DNA的提取

（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；

（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。

2. DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、 注意事项

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

植物DNA提取方法

方法一：

1.取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min。

2.待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。

3.重复步骤（2）一次。

4.取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm离心10min。

5.弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。

6.倒置或者37度培养箱烘干。

7.加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。

方法二：

1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。

2. 植物5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。

3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

4. 室温下5000rpm离心5分钟。

5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。

7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。

9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。

11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。

12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。

13. 取2μlDNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。

方法三：

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4·H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol/LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。