苯酚硫酸法测多糖含量

原理

多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

试剂

1．

浓硫酸：分析纯，95.5%

2．

80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3．

6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

4．

标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。

5．

15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6．

5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7．

6mol/L

氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8．

6mol/L

盐酸

操作

1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：

①取样品1克（湿样）加1ml

15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。

②离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。）

③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L

盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

④定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L

氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2

ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。

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在单因素试验基础上,选择对多糖含量测定结果产生显著影响的4个显色因素:6％苯酚用量、浓硫酸用量、反应温度、水浴显色时间进行正交试验,获得传统苯酚-硫酸法测定多糖含量的最佳显色条件是1 mL 6％苯酚溶液、7 mL浓硫酸、4℃反应温度、30 min水浴显色.改进后的多糖含量测定的显色条件即按照1:7的比例直接配制苯酚-硫酸显色液,在4℃条件下加入样品溶液,在90℃水浴进行30 min显色后,于490 nm处测定吸光度,计算多糖含量.通过传统最佳显色方法的验证试验和改进后的显色方法测定多糖含量的结果比较,表明改进后的方法具有操作简便、精密度高、准确度高、实用性强的优势.

【实验原理】

植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

【实验仪器及试剂】

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。

2．试剂：

（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。

（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。

（3）浓硫酸（比重1.84）。

（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。

（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。

【实验步骤】

1．标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。

式中：C一标准方程求得糖量（ug）

α一吸取样品液体积（mL）

V－提取液量（mL）

n一稀释倍数

W一组织重量（g）

可溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100

原理

多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物.再以比色法测定.

试剂

1． 浓硫酸：分析纯,95.5%

2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存.

3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制.（每次测定均需现配）

4． 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖.

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存.

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存.

7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水.

8． 6mol/L 盐酸