如何制作石蜡切片

肠道的石蜡切片的制作

（1）

取材：用锋利的刀切取罗非鱼的一小段前肠（据胃5cm左右位置的前肠），组织块的规格为

3～5mm×3～5mm×10～15mm。

（2）

固定：采用Bouin氏固定液装瓶固定，固定液用量一般为组织块体积的10～20倍。

（3）

冲洗：固定12～24h后，将材料自固定液中取出后，在70%酒精中换洗几次，可在酒精中加几滴氨水至洗去黄色为止。

（4）

脱水：70%酒精（1h）→80%酒精（1h）→90%酒精（1h）→95%酒精（1h）→无水乙醇Ⅰ（1h）→无水乙醇Ⅱ（1h）

（5）

透明：无水乙醇与二甲苯溶液（1:1）（1h）→二甲苯Ⅰ（1h）→二甲苯Ⅱ

（1h）

（6）

浸蜡：浸蜡的全过程应在恒温设备中进行，将恒温箱调至58℃。

二甲苯与石蜡混合液（1:1）（1h）→石蜡Ⅰ（1h）→石蜡Ⅱ（1h）

浸蜡必须彻底，否则组织内残留透明剂会造成切片过程的困难和影响切片

的质量。

（7）

包埋：在小纸盒内注入溶化的石蜡，将已浸蜡的组织块置入其内，使蜡块迅速冷却硬固，组织块在蜡块中可长期保存。

（8）

切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5~7μm的石蜡带。

（9）

粘片：将组织石蜡带在50摄氏度的温水中展片，然后用经1%HCl溶液处理干净的载玻片捞片，组织带即可粘在载玻片上。

（10）

烤片：将粘好的载玻片置于35℃左右的温箱中烤干，待2~3小时后，即可取下编号。

（11）

苏木精—伊红染色：将烤干的片进行染色。

①脱蜡：将烤干的切片放入二甲苯(I)10min→二甲苯(Ⅱ)10rain。

②复水：将脱蜡后的切片移入100％酒精5min→95％酒精5min→85％酒精5min→70％酒精5min→蒸馏水5min

③HE染色显示肠道黏膜上皮内淋巴细胞：将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中，10min，使细胞核着色；用自来水洗去切片上残余染液；用1％的盐酸酒精分色3秒；用自来水浸洗3h，显微镜下观察，直到胞核蓝化为止；然后切片入曙红溶液中染色5min，使细胞质着色。经95％酒精与100％酒精脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片。

④奥新兰一沙黄染色显示肠道内肥大细胞：切片常规脱蜡下行至蒸馏水→奥新兰一沙黄液染色15～20min→蒸馏水速洗，镜检→95％和100％酒精分色脱水1—2min→二甲苯透明→中性树胶封片。

⑤阿利新兰醋酸染色显示肠道内杯状细胞：切片经脱蜡下行入蒸馏水→阿利新兰醋酸染色10min→蒸馏水洗→1％高碘酸水液氧化5min→蒸馏水略洗一Schiff试剂染色（37℃恒温箱）30min→普通水洗3次→蒸馏水2min→Ehrlich苏木精染色5min→95％酒精和100％酒精脱水→二甲苯透明，中性树胶封片。

切片经脱蜡下行入水：二甲苯(30

min)一二甲苯(10

min)一无水乙醇(5

min)一无水乙醇(5

min)一

95％

乙醇(5

min)一85％乙醇(5

min)一70％

乙醇(5

min)一流水冲洗(20

min)。人Ehrlich苏木精染

色12

min，蒸馏水速洗。盐酸酒精分色，镜检控制时间。入伊红染色2

min，蒸馏水略洗。盐酸酒精分色，镜检控制时间。经95％酒精与无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

阿利新兰—番红复合染色液的方法称Scaba法

阿利新兰—番红分别染色的方法称Spicer法

1、低温浸蜡，在有二甲苯和材料的烧杯中逐步加碎蜡至过饱和，过夜12至24小时。

2、高温浸蜡（55-60℃，高于石蜡熔点3℃），将二甲苯与石蜡的混合液倒出，不要倒掉材料，将烧杯中加入纯石蜡，共5-24小时。

确定所取材料的来源及部位，纵切还是横切；

取材要迅速，防止阻止发生进一步变化，材料体积要适宜。

2.固定

（1） 固定液的选择

最常用的固定液为FAA（万用固定液）。

它的优点是材料固定时间不受限制，固定时间短则数小时，长则数月或数年。（可做材料保存液）

配方： 50％或70％酒精 90ml

冰醋酸5 ml

福尔马林 5 ml

(柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制)

（2）材料固定后的处理

冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。

(材料固定后，若暂时不能进行下一步操作，可于70%的酒精溶液或直接与FAA固定液中，于冰箱中4℃存放。)

下图为固定液浸泡的组织切块。3.脱水

目的：水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。

试剂：梯度酒精溶液

流程：70%---85%---95%--100%---

100% 每步1h-2h左右。

注意事项：保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但也不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩，这个时间大家可以根据自己的实验来摸索一下，不必完全按照本操作来）。

下图为自动组织脱水机，适于大量样品组织脱水用。如果材料体积及样品量较少可用小烧杯做容器来进行逐级脱水。04

4.透明

目的：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。

(二甲苯是最常用的透明剂，可以很好地与石蜡互溶)

流程：二甲苯与酒精的等体积混合液1h---纯二甲苯1h---纯二甲苯1h。

05

5.浸蜡与包埋

目的：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。

浸蜡程序:(恒温)

（1）低温浸蜡（36℃）：接上步，在有二甲苯和材料的烧杯中逐步加碎蜡至过饱和（石蜡不能溶解），过夜12-24h。

（2）高温浸蜡（55-60℃，高于石蜡熔点3℃ ）：

将上步二甲苯与石蜡的混合液倒出，不要倒掉材料，将烧杯中加入纯石蜡，共5-24h。纯石蜡需要更换三次。

关于石蜡的选择石蜡熔点：

对于较硬的材料，用熔点较高的石蜡进行包埋；

当切片较薄时（在8μm以下），选用熔点较高的石蜡包埋；

夏季宜采用熔点较高的石蜡（56,58℃）,冬季宜选用熔点较低的石蜡（52,54℃）。切片

传统的切片方法是将包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，粘于小木块上，上机切片。

新型的切片方法是将包埋框（见下图）代替木块的支撑作用，上机切片。

切片的厚度可以根据自己的实验要求来确定，一般在8μm-20μm范围内。

（下图为传统切片机与新型自动切片机）07

7.粘片与烤片

粘片：用粘片剂将蜡片牢附于载玻片上，防止在后续的操作中材料脱落。

在载玻片上涂抹粘片剂（甲液），再滴蒸馏水（乙液），放上蜡片，用滤纸吸取多余的水分。

烤片：将载玻片放于40℃展片台中烤干。

常用的粘片剂为郝伯特(Haupt) 配方：

甲液：明胶 1g 乙液：甲醛 4 ml

蒸馏水 100ml 蒸馏水100ml

甘油 15 ml

苯酚2g08

8.脱蜡与复水、染色

脱蜡目的：干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液中进行染色。

复水目的：脱蜡后的材料，如果不经过复水，直接进入染色剂中，材料将会严重变形，甚至难以染色。

染色目的：使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色和足够强的差异以便于观察。

总体流程：二甲苯1/2 二甲苯+1/2纯酒精100%酒精95％酒精85％酒精番红（4h以上）95％酒精固绿（迅速）95％酒精（迅速）100%酒精1/2 二甲苯+1/2纯酒精二甲苯二甲苯，以上各级约需5～10分钟，已注明时间的除外。

染色剂：1%番红（85%酒精配制）

0.5%固绿（95%酒精配制）09

9.切片脱水、透明和封固

接上步，在载玻片上滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，进行封片。

切片放入42℃温箱中干燥过夜。镜检，将合格的切片贴上标签。

封固剂选择加拿大树胶（Canada balsam）或中性树胶

至此，植物组织的石蜡切片大功告成！

石蜡制片程序及环节繁多，需数日才能完成1个周期，但切片可长期保存，供教学、科研及病理诊断及复察，并可利用蜡块作其他项目的回顾性研究。病理常规制片过程中已简化了一些细的环节或缩短了部分处理时间以适应临床需要（可缩短至2天）。虽然冰冻切片大大快于石蜡切片，但所显示的形态结构却不如前者，因此病理医生最后还需要根据石蜡切片作出准确诊断。

对于各种乳化型产品要分两个配料罐进行。在一个罐内将蜡料、油溶性染料、亲油性较强的乳化剂一起混合加热到90℃左右，使之互相溶化呈均匀透明。在另一罐内将水溶性染料、水和亲水性较强的乳化剂混合加热到80℃左右（如果物料中有挥发性较强的胺类或氨水等则加热到60℃）。上述两种液体物料制备完成后，将后者缓慢地加入前者，并不断地搅拌，再加入适当的香精即告完成。

在自行车、汽车等车辆表面涂一层上光蜡，能增加物件漆膜亮度，使物件更为美观。上光蜡的配制方法如下。

一、配方

蓖麻油：60 氢氧化铝粉：30 凡士林：5 煤油：5

二、制法

按配方先将氢氧化铝粉加入蓖麻油中，再加煤油、凡士林，放于三滚机上研磨成白色细腻的膏体即为车辆上光油。

丙酮，汽油、石油醚、乙醚、甲乙酮、甲基异丁基酮、二异丁基酮、四氢呋喃、二甲苯、氯仿、四氯化碳、二硫化碳、糠醛等等，都可以溶解蜡。

分子一元醇与长链脂肪酸形成的酯质。在化学结构上不同于脂肪，也不同于石蜡和人工合成的聚醚蜡。故亦称为酯蜡。蜡是不溶于水的固体，温度稍高时变软，温度下降时变硬。其生物功能是作为生物体对外界环境的保护层，存在于皮肤、毛皮、羽毛、植物叶片、果实以及许多昆虫的外骨骼的表面。

高分子一元醇的长链脂肪酸酯称为真蜡，如蜂蜡的主要组分是长链一元醇(C26～C36)的棕榈酸酯，羊毛蜡是很复杂的混合物，含有酯蜡、醇和脂肪酸。纯化后称为羊毛脂，是羊毛固醇的脂肪酸酯。

扩展资料：

蜡的凝固点都比较高，约在38～90℃之间。碘值较低(1～15)说明不饱和度低于中性脂肪。蜡通常在狭义上是指脂肪酸、一价或二价的脂醇和熔点较高的油状物质；广义上通常是指具有某些类似性状的油脂等物质。在不同的场合下对于“蜡”的定义也有所区别。但在广义上，蜡通常是在指植物、动物或者矿物等所产生的某种常温下为固体、加热后容易液化或者气化、容易燃烧、不溶于水、具有一定的润滑作用的物质。

参考资料来源：百度百科-蜡