SDS-PAGE 5Xloading buffer 配制过程，注意，问的不是配方，高手进
我想说以下几点：
1.SDS-PAGE
loading
buffer一般配成2X
的，5X
loading
buffer确实过于粘稠，且SDS在低温下难溶于水，这就导致你配的buffer“摇都摇不动”了
2.不知你为何要配那么多loading
buffer（况且是5X的），这些东西都是用量很少的，建议你少配些，比如……10
ml？
3.以下就以2X
loading
buffer（配制10
ml）为例说明配制步骤
首先配制1
mol/L
Tris-HCl(pH6.8)，10%SDS溶液。
然后称取0.02
g溴酚蓝于小烧杯里，依次加入1
mol/L
Tris-HCl(pH6.8)
1ml，10%SDS溶液4ml，甘油2ml，去离子水2ml，2-巯基乙醇1ml。混匀，分装成小份，-20度保存。用时溶解，与样品1:1混合上样。
需要说明的是，2-巯基乙醇是还原剂，也可用前加入，以防失效。
蛋白质的SDS-PAGE一般只会配成5*的loading buffer
DNA的会配成10*的
5×Loading Buffer
250mM Tris-HCl（pH6.8）
10%（W/V）SDS
0.5%（W/V）BPB
50%（V/V）甘油
5%（W/V）β-巯基乙醇
10×Loading buffer
30mM EDTA
50%(v/v) Glycerol
0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF
0.25%(w/v) Bromophenol Blue
1.SDS-PAGE的类型
在SDS-PAGE中，由于蛋白质与SDS结合后都带负电，因此是阳极电泳。
与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳相似，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳也可分为圆盘电泳、垂直平板电泳和水平平板电泳。其中平板电泳较常使用。
SDS-PAGE一般来说不采用连续电泳方式，因为在SDS-PAGE中蛋白质间不存在电荷密度差异，多采用不连续电泳方式。不连续电泳中蛋白质的分离主要取决于其分子大小和形状。不连续电泳的分离胶可以是均一胶，也可以是梯度胶。
2.SDS-PAGE的原理
对于SDS-PAGE，由于在电泳体系中加入了十二烷基硫酸钠（SDS）和强还原剂（如巯基乙醇，二硫苏糖醇等），其中SDS作为阴离子去污剂会破坏蛋白质的氢键和疏水相互作用，导致蛋白质构象改变，而巯基乙醇等可以打开蛋白质分子内的二硫键，使其分解为亚基，因此电泳过程中蛋白质的生物活性丧失或减弱，但电泳后可恢复或部分恢复其活性。
在离子强度低时，主要以单体形式存在的SDS可以与蛋白质结合，生成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，复合物所带的负电荷远远超过蛋白质原有的负电荷，这使得不同蛋白质间电荷的差异被掩盖。而SDS-蛋白质复合物形状都呈椭圆棒形，棒的长度与蛋白质亚基分子量有关，所以在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白只存在分子大小的差别，利用这一点可将不同的蛋白质分开 （分子筛效应），因此SDS-PAGE常用于检测蛋白质亚基的分子量及鉴定纯度。
与常规PAGE类似，不连续SDS-PAGE对蛋白质的分离除了基于分子筛效应外，还基于其对样品的浓缩效应。
3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法
样品缓冲液中须含有3～4倍于蛋白质的SDS以及足够断裂二硫键的β-巯基乙醇或二硫苏糖醇，而且蛋白须完全变性展开。由于每克伸展的蛋白质结合1.4g单体SDS，因此通常在样品缓冲液中加1％～2％（10～20g/L）SDS，在凝胶及电泳缓冲液中加0.1%SDS。
制胶
SDS-PAGE多采用不连续的电泳方式，其制胶方法与常规PAGE的制胶方法基本一致，但由于凝胶中含有SDS，容易起泡，低温下又易结晶析出，因此单体储备液不需抽气，聚合时的凝胶也不适宜在4℃放置。制胶模具的准备也同常规PAGE相同。下面就介绍不连续电泳中的阳极电泳的制胶方法。
（1）凝胶储备液的配制
① 丙烯酰胺储备液T＝30％，C固定，2.6%～3%。
② 4×分离胶缓冲液 如pH＝8.8、1.5mol/L Tris-HCl缓冲液，含0.4%SDS。
③ 4×浓缩胶缓冲液 如pH＝6.8、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液，含0.4%SDS。
④ 10％过硫酸铵溶液（AP）。
注：丙烯酰胺是神经毒剂，应戴手套操作。电泳时的试剂应达到电泳纯，并使用重蒸水配制溶液。
（2）分离胶配方
A液/ml B液/ml 重蒸水/ml 10%AP/μl TEMED/μl
x/30×10=x/310/4=2.510-x/3-2.5约503～5
根据聚合的快慢来调节AP和TEMED的用量，使凝胶在20～60min内聚合。
（3）制备浓缩胶
制备样品和加样
5×样品缓冲液：pH＝6.8、0.06mol/L （0.4mol/L）Tris-Hcl缓冲液，含25％（50％）甘 油、2％（10％）SDS、5％ （体积分数）巯基乙醇和0.1％溴酚蓝。
将蛋白质溶液与5×样品缓冲液以4：1（体积比）的比例混合（如果蛋白质溶液浓度过高，需预先脱盐处理）后，在100℃水浴中加热3～5min，使蛋白质充分变性，再于10000r／min离心5min，取上清加样。
电泳
电泳缓冲液：pH＝8.3，0.025mol/L Tris-0.192mol/L Gly缓冲液，含0.1％SDS。
1、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用很好的并且长期的保护SH基团，得到较窄的谱带另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，以防止银染时的纹理现象。
染色和检测
（1）考马斯亮蓝法，在SDS-PAGE后，凝胶的固定和染色时间应比常规PAGE的长1倍左右，或用多倍体积染色液染色，以排除SDS的影响。
（2）银染法，在电泳后染色之前，必须将凝胶多次漂洗，以除去SDS。
4.影响分离结果的因素
缓冲系统
在SDS对蛋白质的助溶作用以及负电荷的包裹作用影响下，蛋白质的分离仅依据亚基的分子大小，因此缓冲系统的选择比较简单，只要利于分离并保持蛋白质的稳定以及不与SDS发生相互作用即可。常用的缓冲系统有 Tris-Gly缓冲液，其余如磷酸缓冲液（多用于连续电泳）、Tris-醋酸盐缓冲液、Tris-硼酸盐缓冲液、咪唑缓冲液以及SDS-尿素系统 （用于分离低分子量蛋白样品）。离子强度一般为0.01～0.2mol/L。
SDS-PAGE为阳极电泳，在凝胶缓冲液中加入 0.1％SDS，在样品缓冲 液中加1％ ～2％SDS和1％～6％巯基乙醇 （或3％二硫苏糖醇），并加适量溴酚蓝，在电极缓冲液中加0.1％SDS，不连续电泳的凝胶缓冲液和样品缓冲液中还需加适量甘油。
凝胶浓度
由于凝胶浓度决定凝胶孔径大小，而凝胶孔径影响电泳效果 （即凝胶的分子筛效应）。特别是对于SDS-PAGE，由于电泳分离只取决于SDS-蛋白质亚基胶束的大小，因此凝胶浓度的选择尤为重要。应根据样品中蛋白质的分子量范围选择合适的凝胶浓度
C=2.6% C=5%
凝胶浓度（T）/%分子量范围/kDa凝胶浓度（T）/%分子量范围/kDa
5
10
15
20
25-200
10-70
＜50
＜40
5
10
15
20
60-170
20-100
10-50
5-40
一. 实验原理：
SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子 量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子 量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
二. 试剂和器材：
试剂：1. 5x样品缓冲液(10ml)：0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8)，5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。
5. TEMED(四乙基乙二胺)原液
6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制)
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪 ，电泳槽，水浴锅，摇床。
三. 实验操作
1. 样品制备
将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。放入100℃加热5-10min，取上清点样。
2. 分离胶及浓缩胶的制备
① 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干
② 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板
③ 按如下体积配制10%分离胶8.0 ml，混匀：ddH2O 3.0 ml1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml30% Acr-Bis 2.8 ml10% SDS 80 ul10%AP 56 ulTEMED 6 ul。
④ 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合
⑤ 按如下体积配制6%浓缩胶3.0 ml，混匀：ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30% Acr-Bis2.0 ml 400 ul 600 ul10% SDS 10% AP TEMED36ul 24ul 4ul。
⑥ 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳
⑦ 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl
⑧ 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.
⑨ 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液(10 ml 冰乙酸45 ml乙醇45 ml蒸馏水)至完全脱净。
聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，可根据蛋白亚基分子量不同将分离蛋白，SDS-PAGE电泳凝胶好坏直接关系到电泳能否成成，一般浓缩胶和分离胶的pH分别是6.7和8.9.
