请问，如何用实验的手段鉴定非编码RNA？
实验原理
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。
试剂和器材
一、试剂
0.04MNaOH溶液；95%乙醇；无水乙醇；乙醚；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银
酸性乙醇溶液，30ml乙醇加0.3ml HCl
三氯化铁浓盐溶液，将2ml 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400ml浓HCl
苔黑酚乙醇溶液，称取6g 苔黑酚溶于95％乙醇100ml
定磷试剂：
17％硫酸：将17ml浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83ml水中；
2.5％钼酸铵：2.5g 钼酸铵溶于100ml水中；
10％抗坏血酸溶液：10g 抗坏血酸溶于100ml 水，棕色并保存溶液；
临用时将三种溶液和水按下列比例混合：
17％硫酸：2.5％钼酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）
二、材料
干酵母粉。
三、器材
乳钵；容量瓶（10ml），移液管（2.0ml, 5.0ml），量筒（10, 50ml），沸水浴，离心机，布氏漏斗，抽滤瓶，石蕊试纸，滴管等。
操作方法
一、酵母RNA提取
称5g干酵母粉置于100ml烧杯中，加入40ml0.2%NaOH溶液，沸水浴上加热30min，经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性（石蕊试纸检查），3000r/min离心15min。取上清液，加入10ml酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，离心。滤渣先用乙醇洗两次，每次用10ml。再用无水乙醇洗两次，每次10ml，洗涤时间可用细玻璃棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：
二、RNA组份鉴定
取2g 提取的核酸，加入1.5M硫酸10ml, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。
1．嘌呤碱：取水解液1ml 加入过量浓氨水。然后加入1ml 0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱地银化合物沉淀。
2．核糖：取水解液1ml， 三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。
3．磷酸：取水解液1ml，加定磷试剂1ml。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。
酵母rna的提取及组分鉴定实验报告如下。
目的和要求，了解核酸的组成及其提取原理及方法。掌握鉴定核酸组分的方法。
基本原理，由十RNA的来源很多，因提取制备方法也很各异。一般有苯酚法，去污剂法和盐酸瓜法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶十十层被酚饱和的水相中。DNA和蛋白质训留在酚层中。il水层加入乙醇后，RNA即以自色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
酵母的作用
美国、日本及欧洲一些国家在普通的粮食制品如面包、蛋糕、饼干和烤饼中掺入5%左右的食用酵母粉以提高食品的营养价值。酵母自溶物可作为肉类、果酱、汤类、乳酪、面包类食品、蔬菜及调味料的添加剂。
在婴儿食品、健康食品中作为食品营养强化剂。由酵母自溶浸出物制得的5′－核苷酸与味精配合可作为强化食品风味的添加剂。从酵母中提取的浓缩转化酶用作方蛋夹心巧克力的液化剂。
从以乳清为原料生产的酵母中提取的乳糖酶，可用于牛奶加工以增加甜度，防止乳清浓缩液中乳糖的结晶，适应不耐乳糖症的消费者的需要。
1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？
2)RNAgents®总RNA提取系统的工作原理怎样？
3)RNAgents®总RNA提取系统的一般得率是多少？
4)RNAgents®总RNA提取系统的各组分的功能是什么？
5)RNAgents®总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？
6)对初始材料的用量有什么限制？
7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？
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1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？
Promega用于提取总RNA及poly(A)+RNA的系统包括：
：用RNAgents®总RNA提取系统从组织及培养的细胞中提取总RNA。
：用SV总RNA提取系统从组织，血液及培养的细胞中提取总RNA。
：用PolyATtract®mRNA提取系统从总RNA中提取poly(A)+RNA。
：用PolyTtract®ystem1000从组织及培养的细胞中提取poly(A)+RNA。
：用PolyTtract®Series
9600TMmRNA从少量样品中快速提取mRNA（cDNA第一条链的纯化）。
2)RNAgents®提取总RNA提取系统的工作原理怎样？
RNAgents®总RNA提取系统用溶剂法为基础，从多种材料中快速，有效地提取总RNA。
简单而言，有亚硫氢胍及巯基乙醇时，制组织匀浆，可使内源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性。用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇抽提后，RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相。抽提后，用异丙醇将RNA沉淀浓缩。用RNAgents®总RNA提取系统所得RNA纯度好，用途广，适用于PolyATtract®mRNA提取系统。如RNA中必须完全去除染色体DNA，需用1-2个单位的无RNA酶污染的DNA酶处理。然后用65oC加热10分钟，或用苯酚及氯仿抽提使DNA酶失活。
3)RNAgents®总RNA提取系统的一般得率是多少？
得率受多个因素的影响，包括组织来源及培养的细胞数。如提取的RNA量多，可通过光吸收测定（A260读数）来定量RNA，
1OD=40ugRNA。
RNAgents®总RNA提取系统的一般得率
组织
总RNA得率
Hela细胞
1.6mgRNA/10的8次方个细胞
鼠内脏
2.3mgRNA/g组织
鼠脾
8.3mgRNA/g组织
鼠肺
1.9mgRNA/g组织
鼠肾
3.1mgRNA/g组织
鼠肝
8.1mgRNA/g组织
4)RNAgents®总RNA提取系统的各组分的功能是什么？
(1)
变性剂:
柠檬酸钠溶液中含亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸
。可变性细胞内及核蛋白复合物，释放RNA。这些试剂还可有效抑制核酸酶。
(2)
苯酚：氯仿：异戊醇（125：24：1）（pH4.7）:酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。
(3)
乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA所需。
(4)
异丙醇：沉淀浓缩RNA。
5)RNAgents®总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？
苯酚：氯仿：异戊醇的配比是125：24：1，用42mM柠檬酸钠溶液平衡(pH4.3-4.7)。这一配比可有效去除染色体DNA。残留染色体DNA会干扰RT-PCR。
6)对初始材料的用量有什么限制？
最初的设计方案是用作提取比较大量的RNA，RNAgents®总RNA提取系统可从5mg
组织，或5倍10的5次方的细胞中提取RNA。少量RNA提取的步骤可见RNAgents®总RNA提取系统技术手册TB087。初始材料用量的上限是每次用1g组织。
7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？
快速提取RNA用作RT-PCR，可省去在变性溶液中液化和沉淀的步骤。简化的步骤可在90分钟内完成。
http://www.promega.com.cn/files/changjian/rnagents.htm
接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，可去除所有残留的蛋白质和无机盐. RNA样品中如果含有无机盐, 有可能对后续实验操作中的一些酶促反应产生抑制作用。
