硫酸苯酚法测多糖有什么要特别注意吗
苯酚硫酸法测定多糖需要注意：①、试管要洗干净，苯酚硫酸法很灵敏，试管没有刷干净会有很大影响。②、操作手法一致，尤其是硫酸加入的方式和速度，要尽量一致。建议用移液管移取，直接松开按住上面的手指，让其自行流下。最后加入硫酸后，立即摇匀和隔段时间摇匀，室温和冰浴，这些都不是造成平行样不平行的原因，只要处理样品方法是一样的，切勿一个样一种方法。③加硫酸必须要快，建议用5mL的移液枪，另外样品的稀释浓度要合理。⑤药品要求：A、
浓硫酸：分析纯,95.5%
B、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。C、
6%苯酚：临用前以80%苯酚配制.（每次测定均需现配）D、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。E、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。F、
5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。G、
6mol/L
氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。H、6mol/L
盐酸。⑥酚要4℃冰箱保存，拿出来到室温后用，加浓硫酸后一定要摇匀，水浴温度和时间尽量一致，冷水冲凉的时间也尽量一致，试样温度不一样对吸光度也有影响，还有可以的话样品和标曲同时做，误差就小了。
多糖样品含量一般为1.0ml。
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。
1、制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1。8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml。
摇匀静置30分钟以后于490nm测吸光度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2、取多糖样品1.0ml，加1.0ml蒸馏水，然后加入6%苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml，在涡旋仪上震荡，充分混匀，静置30分钟，于490nm测定吸光度，并将测得的吸光度带入标准曲线中，可获得多糖浓度。
注意：
（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1—0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
苯酚硫酸法师利用糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物。在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。
此时，对于杂聚多糖，只用葡萄糖溶液做标准曲线，是不准的。有时用多种单糖标准品作标准曲线，但不同单糖标准品在相同浓度下其吸收值相差较大（葡萄糖显色最大），分别制作标准曲线对杂多糖测定的结果也就不同。因此，苯酚硫酸法对于成分复杂的多糖来说，只能是一个参考。
对杂多糖往往不用单一的苯酚硫酸法。比如，采用气相色谱法对杂多糖的组成进行分析，再配合苯酚硫酸法可以得到更可靠的结果，比单用苯酚 硫酸法更可靠、准确。
原理
多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物.再以比色法测定.
试剂
1． 浓硫酸：分析纯,95.5%
2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存.
3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制.（每次测定均需现配）
4． 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖.
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存.
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存.
7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水.
8． 6mol/L 盐酸
