苯酚硫酸法测定多糖含量的计算方法

原理

多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

试剂

1．

浓硫酸：分析纯，95.5%

2．

80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3．

6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

4．

标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。

5．

15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6．

5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7．

6mol/L

氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8．

6mol/L

盐酸

操作

1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：

①取样品1克（湿样）加1ml

15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。

②离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。）

③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L

盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

④定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L

氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2

ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。

很高兴为您解答，祝你学习进步！

【梦华幻斗】团队为您答题。有不明白的可以追问！

如果您认可我的回答。请点击下面的【选为满意回答】按钮，谢谢！

苯酚硫酸测定糖需要注意哪些问题

原理

糖硫酸作用先水解单糖,并迅速脱水糖醛衍物,与苯酚橙黄色化合物.再比色测定.

试剂

1． 浓硫酸：析纯,95.5%

2． 80%苯酚：80克苯酚（析纯重蒸馏试剂）加20克水使溶解,置冰箱避光期储存.

3． 6%苯酚：临用前80%苯酚配制.（每测定均需现配）

4． 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或析纯葡萄糖.

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使溶解,置冰箱期储存.

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使溶解,置冰箱期储存.

7． 6mol/L 氢氧化钠：120克析纯氢氧化钠溶于500ml水.

8． 6mol/L 盐酸

多糖含量的测定粗多糖中的总糖含量使用苯酚-硫酸法进行测定，还原糖用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定，多糖含量=总糖-还原糖。/link?url=7RqQEukuWLobPMaTxCPaH0JB0Fq9N0HCkv0tLe9fyGKc3VL0wNcBtj1d5EiYKtdT10r6rKXeKQ8RwiV6Pdknps8K3H0juhVsedDlo1ntaZK具体方法见百度文库

苯酚硫酸法测多糖，苯酚硫酸怎么配制

在单因素试验基础上,选择对多糖含量测定结果产生显著影响的4个显色因素:6％苯酚用量、浓硫酸用量、反应温度、水浴显色时间进行正交试验,获得传统苯酚-硫酸法测定多糖含量的最佳显色条件是1 mL 6％苯酚溶液、7 mL浓硫酸、4℃反应温度、30 min水浴显色.改进后的多糖含量测定的显色条件即按照1:7的比例直接配制苯酚-硫酸显色液,在4℃条件下加入样品溶液,在90℃水浴进行30 min显色后,于490 nm处测定吸光度,计算多糖含量.通过传统最佳显色方法的验证试验和改进后的显色方法测定多糖含量的结果比较,表明改进后的方法具有操作简便、精密度高、准确度高、实用性强的优势.

标准液的制法：取100mg葡萄糖（104℃烘干至恒重）在100ml的容量瓶定容。分别取溶液1ml、2ml、3ml、4ml、6ml、8ml至100ml的容量瓶中，制成10ug/mg、20、30、40、60、80ug/mg的标准液。

苯酚溶液的制法：称取5g的苯酚，加入95ml蒸馏水，溶解。

反应液：分别取1ml的标准液，加入1ml的苯酚溶液，迅速加入5ml的浓硫酸，震荡摇匀。在沸水浴中加热15min后冷却到室温，在490nm波长下测定其吸光值。

我这两天刚做出来的，但是我的浓度是用的20ug/mg、40、60、80、100、120，其他的细节都是一样的。我只是按照我做的给你说的，你也可以灵活变通，比如沸水浴的时间，波长的选择都是按照自己的实验具体确定的，但是还是有些细节不能忽视的，比如苯酚要求用182℃蒸馏后得到的馏分，如果试验经费允许可以直接买重蒸酚，普通苯酚和重蒸酚价格相差有点大。具体我们可以讨论，我也是试验很多方法自己总结出来的，用苯酚测定糖是个技术活，而且冒着有毒的危险。

文献报道中，苯酚制剂的制备方法如下：取苯酚200g，加铝片O.2g和碳酸氢钠O.1g，蒸馏，收集182摄氏度馏分，称取20g，加入300ml蒸馏水混匀，溶解即得。置棕色瓶中，放冰箱内备用。

制备苯酚制剂的目的，就是因为苯酚的纯度对实验影响很大，不得已而为之。

如果限于实验室条件不能进行高温蒸馏，那么建议你采用蒽酮硫酸法测定多糖，很可能比NDS测定方法重现性还好，但需注意一点：蒽酮剧毒！所以一般用的都是NDS方法，虽然麻烦一些。

（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。

（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。

（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。

（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。

一）苯酚法测定可溶性糖

【实验原理】

植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

【实验仪器及试剂】

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。

2．试剂：

（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。

（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。

（3）浓硫酸（比重1.84）。

（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。

（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。

【实验步骤】

1．标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。

式中：C一标准方程求得糖量（ug）

α一吸取样品液体积（mL）

V－提取液量（mL）

n一稀释倍数

W一组织重量（g）

可溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100

问题一：苯酚-硫酸法的注意 （1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1――0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。

问题二：苯酚硫酸法测定多糖需要注意哪些问题 苯酚硫酸法测定多糖需要注意哪些问题

原理

多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物.再以比色法测定.

试剂

1． 浓硫酸：分析纯,95.5%

2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存.

3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制.（每次测定均需现配）

4． 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖.

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存.

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存.

7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水.

8． 6mol/L 盐酸

问题三：硫酸苯酚法测多糖有什么要特别注意吗 苯酚硫酸法测定多糖需要注意：①、试管要洗干净，苯酚硫酸法很灵敏，试管没有刷干净会有很大影响。②、操作手法一致，尤其是硫酸加入的方式和速度，要尽量一致。建议用移液管移取，直接松开按住上面的手指，让其自行流下。最后加入硫酸后，立即摇匀和隔段时间摇匀，室温和冰浴，这些都不是造成平行样不平行的原因，只要处理样品方法是一样的，切勿一个样一种方法。③加硫酸必须要快，建议用5mL的移液枪，另外样品的稀释浓度要合理。⑤药品要求：A、 浓硫酸：分析纯,95.5% B、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。C、 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制.（每次测定均需现配）D、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。E、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。F、 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。G、 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。H、6mol/L 盐酸。⑥酚要4℃冰箱保存，拿出来到室温后用，加浓硫酸后一定要摇匀，水浴温度和时间尽量一致，冷水冲凉的时间也尽量一致，试样温度不一样对吸光度也有影响，还有可以的话样品和标曲同时做，误差就小了。

问题四：苯酚-硫酸法的介绍 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

问题五：苯酚硫酸法测多糖，苯酚硫酸怎么配制 苯酚硫酸法测多糖，苯酚硫酸怎么配制

在单因素试验基础上,选择对多糖含量测定结果产生显著影响的4个显色因素:6％苯酚用量、浓硫酸用量、反应温度、水浴显色时间进行正交试验,获得传统苯酚-硫酸法测定多糖含量的最佳显色条件是1 mL 6％苯酚溶液、7 mL浓硫酸、4℃反应温度、30 min水浴显色.改进后的多糖含量测定的显色条件即按照1:7的比例直接配制苯酚-硫酸显色液,在4℃条件下加入样品溶液,在90℃水浴进行30 min显色后,于490 nm处测定吸光度,计算多糖含量.通过传统最佳显色方法的验证试验和改进后的显色方法测定多糖含量的结果比较,表明改进后的方法具有操作简便、精密度高、准确度高、实用性强的优势.