简述DNA重组与分子克隆化基本原理与过程

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2022-12-21 18:57:44

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2025-12-04 07:13:37

（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应

外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口（图1.8），当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。

ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在加作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这样，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。

i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：mol/L)。理论上，当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。图1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。当连接混合物中线性质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。

涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：

１）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。

２）末端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

(二）粘端连接

１）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

２）按如下所述设立连接反应混合物：

a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。

b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。

c．加入：10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液１μl

Ｔ４噬菌体ＮＤＡ连接酶 0.1Weiss单位

５mmol/L ATP 1μl

于16℃温育１－４小时

10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液

200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)

50mmol/K MgCl2

50mmol/L二硫苏糖醇

500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）

该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。

另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968)对该酶进行标化。１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England Biolabs公司所定义）。因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss单位表示。\par 目前提供的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。

３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌感受态细胞。

（三）平端ＤＮＡ连接

Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：

１）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。

２）不存在亚精胺一类的多胺。

３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。

４）高浓度的平端。

１．凝聚剂

在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983Zimmerman和Pheiffer,1983ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：

１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。

２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体。\par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。

（１）聚乙二醇（PEG8000）

１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。

２）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。

３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。

４）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。

（２）氯化六氨合高钴

１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。

２）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。

３）与ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

（四）质粒载体中的快速克隆

质粒克隆中最慢的步骤是所需的外源ＤＮＡ片段和相应质粒ＤＮＡ区段的电泳纯化，下面的操作方案[由S.Michaelis(个人通讯）根据Struhl(1985)的方法修订而成]是从纯化的凝胶中回收琼脂糖块，熔化后直接进行质粒和外源ＤＮＡ的连接。这一方法寻平端连接和粘端连接都同样奏效，但需大量的连接酶，而且效率要比标准操作方案约低一个数量级。

１）用适当的限制酶消化外源ＤＮＡ，其量应足以产生约0.2μg的靶片段。反应体积应为20μl或更小。在另一管中，用相应的限制酶消化约0.5μg载体ＤＮＡ，总反应体积为20μl或更小。如载体ＤＮＡ带相同的端，应用磷酸处理如下：用限制酶消化完全后，加2.5μl 100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25单位牛小肠碱性磷酸酶，于37℃温育30分钟。

２）通过琼脂糖凝胶电泳分离目标片段。务必用低熔点琼脂糖灌制凝胶，务必用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的１xTAE作为电泳缓冲液而不是常规的0.5xTBE来配制凝胶并进行电泳。

３）在长波长紫外照射下检查凝胶，根据目标条带的相对荧光强度估计所含ＤＮＡ的量（见附录Ｅ）。用刀片切出目标条带，尽可能少琼脂糖的体积（通常40-50μl)。将切下凝胶片分别放入作好标记的各个微量离心管中。

４）于70℃加热10-15分钏，使琼脂糖熔化。

５）合并熔化的小份凝胶并放到加温至37℃的中一管中，共终体积应不超过10μl,外源ＤＮＡ与质粒载体的摩尔比应接近２：１。

用另外两个管设立两个对照连反应，一个只含质粒载体，另一个只含外源ＤＮＡ片段。

６）将３个管于37℃温育5-10分钟，然后每管加10μl用冰预次的２xT４噬体ＤＮＡ连接酶混合物，在琼脂糖凝固前，充他混匀各管内容物，于16℃温育12-16小时。

２xT４噬菌体ＤＮＡ连接酶混合物可制备如下：

1mol/L Tris.Cl(pH7.6) 1.0μl

100mmol/L氯化镁 1.0μl

200mmol/L三硫苏糖醇 1.0μl

10mmol/L ATP 1.0μl

水 5.5μl

Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶１Ｗeiss单位

混匀后放置于冰浴上。

７）连接反应行将结束时，取出贮存于-70的３管各200μl的冻存大肠杆菌感受态细胞

８）于70℃中热10-15分钟重新溶化连接混合物中的琼脂糖。

９）立即从每管连接混全物中取出５μl加到200μl大肠杆菌感受态细胞中，小心摇晃，快速地混匀内容物。从剩下每管连接混合物中分别再取５μl重复以上步骤，将转化混合物在冰浴上放置30分钟。

10）完成转化方案的其余各步分子克隆化是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。克隆(clone,clon)一词源于希腊文Klon，原意为树木的枝条。在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。分子克隆化-方法(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。(5)克隆的选择：①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。分子克隆化-重要意义分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松驰素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。在基因治疗方面。通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。在工业生产方面，以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。在农业生产方面，植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。

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2025-12-04 07:13:37

用于单细胞测序的细胞条码化的制作方法

admin 2022-06-16 06:16:13 8次

该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。

用于单细胞测序的细胞条码化

1.相关申请的交叉引用

2.本技术要求2019年11月4日提交的，题为“用于单细胞测序的细胞条码化”的第62/930,288号美国临时专利申请的优先权，其全文通过引用纳入本文，用于所有目的。

3.发明背景

4.目前的液滴微流体方法实现了数千细胞的通量。然而，更大的数量可能难以实现。使用微流体技术，至少有三个导致细胞悬浮液死体积和因此用于分析的细胞丢失的因素：1)微流体装置的入口处的剩余液体2)微流体通道预划分中的剩余液体和3)未从微流体装置的出口处收集的材料。此外，非常大的液滴乳化体积，对应于高细胞通量实验，很难以及时的方式产生，由于所需的体积。这可能对于细胞活力和细胞内含有的不稳定的核酸底物(如rna)有不利影响。最后，当产生较大的液滴乳液时，其增加的体积使其难以将单个乳液装载入与热循环仪兼容的单管中，从而进一步限制了大乳液体积的实施。

5.单细胞条码化平台需要昂贵的微流体技术(芯片、油和仪器)和条形码珠。仪器还需要昂贵的现场服务工程师来维护和解决硬件问题。

6.虽然液滴微流体技术改进了可扩展性，除非使用更复杂的芯片上(on-chip)液滴合并和皮注射(picoinjection)功能，否则只支持添加一种溶液。

7.用寡核苷酸直接标记细胞是使用寡聚物-偶联珠的选择。然而，在不破坏细胞生理的情况下，装载到细胞上的寡核苷酸的最大数量约为100-1000万。在nl大小的液滴中，寡核苷酸的终浓度往往将不足以驱动分子生物学反应，因此阻止液滴与直接寡核苷酸标记的细胞兼容。

8.发明概述

9.高密度寡核苷酸，范围达到106至107个分子，可以通过各种方法附接至细胞。例如，可以通过细胞特异性寡核苷酸偶联抗体(stoeckius等2018，genome biology)或通过脂质修饰的寡核苷酸(mcginnis等2019，nature methods)标记细胞。寡核苷酸细胞附接创造了直接在细胞上构建细胞条形码的可能性，例如，通过拆分汇集条形码构建(fan等2015，science)。这些细胞条形码反过来可以用于条码化靶向的细胞的核酸底物。

10.以前，这种形式的细胞条码化的一个要求是，在寡核苷酸裂解或从细胞释放之前，细胞与附接细胞条形码寡核苷酸的互补物必须被共同限制在分区中，此时可以发生与细胞核酸底物的附接。虽然液滴提供划分格式用于这种类型的反应，但是存在一些缺点。首先，单个乳液中液滴的数量上限是约100-200万。为了尽量减少多个细胞共同定位于单个液滴中，可以以大约0.05-0.1的λ装载细胞。基于每个乳液的液滴数量，封装的细胞的数量被限制在最大50,000至100,000。这种细胞通量对于某些类型的实验可能是不足够的，且受到向上可扩展性的限制。第二，由于入口处、微流体和液滴中剩余的细胞悬浮液不能从出口处收获，使用液滴微流体技术的细胞损失很难消除，导致细胞利用率为约60-85％。对于珍贵的细胞，这种水平的细胞利用率可能是不足够的。第三，液滴微流体技术需要芯片、油和仪器，都昂贵且难以支持。第四，在已经形成的液滴中加入试剂并在保持液滴的同时洗涤产物，虽然通过皮注射、液滴合并和磁珠捕获方法是可行的，但不容易工程化。这种限制使得单细胞

dna分析困难，因为简单的液滴微流体技术不支持蛋白酶k消化、随后失活然后加入生物化学品。第五，因为只有100-1000万寡核苷酸可以在不破坏膜的情况下被装载到细胞上，液滴必须有几十pl的体积，以提供足够的寡聚物浓度以驱动分子生物学反应。这些小液滴可能很难通过两个水性入口的微流体技术实现。第六，在进行条码化反应之前，细胞通常必须被清洗以除去其培养基。这明显增加了细胞损失。

11.本方法用液滴解决了上述限制，如下：在细胞上建立细胞条形码后，用与细胞密度匹配的水凝胶溶液重悬细胞，使得细胞不沉降。这可以通过用于保持细胞悬浮的常用试剂实现，例如蔗糖缓冲、percoll(西格玛(sigma))和/或optiprep(西格玛)。然后接着发生水凝胶的固化(solidification)。固化背后的机制取决于用于水凝胶的材料。例如，琼脂糖的固化会由温度下降引起。或者，藻酸盐可以使用钙交联。或者，temed启动了聚丙烯酰胺单体的交联。因此，细胞被分散在整个固化的水凝胶基质中。

12.水凝胶可以经或不经修饰以结合细胞条形码寡核苷酸。例如，细胞条形码寡核苷酸可以在5’端用生物素修饰，亲和素类似物(例如链霉亲和素)可以被偶联至水凝胶材料。因此，当在溶液中时，带有结合的寡核苷酸的细胞将自由移动，然而，一旦水凝胶固化，任何释放的寡核苷酸将在细胞膜的直接的附近结合至基质，在细胞膜存在的地方形成壳或皮。例如，0.01至10％重量/体积(wt/vol)的水凝胶对离子和非离子去污剂、以及低分子量蛋白质、酶和辅因子是多孔的。因此，在将细胞捕获在水凝胶基质中之后，细胞裂解剂(例如0.1％np-40)可以被应用于细胞。裂解剂将通过基质扩散并裂解细胞。细胞条形码寡核苷酸裂解或释放将作为细胞裂解和膜溶解的直接结果发生，或通过特异性或非特异性试剂从细胞裂解或释放寡核苷酸。然后释放的细胞底物核酸将结合至细胞条形码寡核苷酸，其已经被固定在细胞膜/水凝胶界面的壳中。

13.通过细胞/水凝胶界面圈起来的区域的体积基本上是细胞的体积。无论细胞条形码寡核苷酸是否被固定在寡核苷酸的壳上，这种最小体积将显著增加细胞条形码寡核苷酸的有效浓度，达到最大值。这可以补偿，例如，对于在不影响细胞生理的情况下可以被装载到细胞上的细胞条形码寡核苷酸数量有限，例如，每个细胞100-1000万寡核苷酸。对于直径约为9微米的细胞，用200万寡核苷酸的有效浓度将是几百个nm，其为足以支持大多数分子生物学反应(例如逆转录)的浓度。低分子量rna或dna依赖性聚合酶可以与裂解剂一起或之后加入，也可以在中间的洗涤之后加入，以除去或灭活细胞裂解剂。

14.一旦细胞底物核酸加细胞条形码寡核苷酸标签，导致细胞条码化发生，在从固化或未固化的水凝胶基质除去材料之后，文库制备的最后步骤可以在水凝胶基质中或溶液中发生。例如，逆转录酶，由于其低分子量，将流经组合物中高达5％的水凝胶。将其与裂解剂一起，或是与或不与寡核苷酸裂解/释放剂一起应用，将导致以下事件。随着裂解剂溶解细胞膜，细胞条形码寡核苷酸将结合至水凝胶以在细胞膜存在的位置形成壳。释放的rna将结合至在细胞膜存在的壳上固定的寡核苷酸，逆转录酶将合成cdna。这就是条码化反应。一旦发生，水凝胶可以被溶解，制备ngs文库的最终步骤就可以批量完成。

15.上述工作流程都不需要微流体技术(芯片、油和仪器)，且批量发生。这种形式的一个好处是可支持多步骤反应。例如，如果需要dna基因型信息，流经水凝胶的第一试剂可以是蛋白酶k，例如热敏蛋白酶k。其将消化核小体和染色质辅助蛋白，使dna可及于进一步的分子生物学。通过对细胞膜的破坏，细胞条形码寡核苷酸可以在细胞膜存在的地方结合形

成壳。蛋白酶k可以失活，dna聚合酶与试剂一起流入水凝胶中，例如，可以发生通过模板导向-dna合成条码化。一旦条码化，文库制备的最后步骤可以在水凝胶内部或外部进行。

16.细胞可以在其原始培养基中与水凝胶材料混合。一旦固化，可以洗涤水凝胶以去除培养基。此外，由于每个细胞都会有一组细胞条形码克隆的寡核苷酸，所以水凝胶基质中捕捉的每个细胞会被条码化。这两个因素将细胞利用率从起始材料增加到接近100％。

17.在一些方面，提供个体细胞或个体细胞核和交联水凝胶的混合物。在一些实施方式中，个体细胞包含附接至个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。

18.在一些实施方式中，个体细胞包含锚定于个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含锚定于个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含脂质部分，其中脂质部分将异源条码化寡核苷酸锚定在细胞膜中。

19.在一些实施方式中，水凝胶被共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，水凝胶被非共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，该分子选自下组：生物素、链霉亲和素、抗体、适配体、镍(ni)、铕(eu)或包含至少6个连续核苷酸的序列的多核苷酸，其与异源条码化寡核苷酸中的序列完全互补。

20.在一些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，核或细胞包括片段化的核dna，其中片段化的dna在片段末端包含共有衔接子序列。

21.在一些实施方式中，水凝胶包括藻酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖、胶原、纤维蛋白(fibrin)、聚乙二醇(peg)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(聚hema)、聚乙烯醇(pva)或聚己内酯(pcl)。

22.在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含细胞特异性条形码序列和3’序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续的胸腺嘧啶的多聚t序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如至少8个、至少10个、至少12个，例如6-30个)连续核苷酸的随机序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续核苷酸的目标基因特异性序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如，5-100个，5-25个)连续核苷酸的衔接子。在一些实施方式中，衔接子可以在例如来自细胞或核的片段化dna的末端于共有衔接子序列互补。

23.在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸还包含5’pcr柄(handle)序列。

24.在一些方面，提供了将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸的方法。一些实施方式中，所述方法包括：提供(i)具有附接至细胞的细胞膜的异源条码化寡核苷酸的细胞或分离的细胞核或(ii)包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸的细胞核；混合该细胞或核与液态水凝胶；在该细胞或核周围交联水凝胶，其中水凝胶形成固体凝胶；从细胞膜或核膜释放异源条码化寡核苷酸以产生释放的异源条码化寡核苷酸；允许该异源条码化寡核苷酸从细胞膜或核膜释放以定位在细胞或核周围的固化的水凝胶上；将异源条码化寡核苷酸附接至细胞多核苷酸或其拷贝或其cdna上，以形成条码化细胞多核苷酸；并溶解固化水凝胶或从固化水凝胶中提取条码化细胞多核苷酸，从而从水凝胶中释放条码化细胞多核苷酸，从而将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸上。

25.在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸结合至细胞或核周围的固化的水凝胶。在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸扩散至细胞或核周围的固化的水凝胶，使得异源条码化寡核苷酸定位

灵巧的宝贝

2025-12-04 07:13:37

保留时间的理论

保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间，不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间，因此保留时间是色谱分析法比较重要的参数之一。

保留时间由物质在色谱中的分配系数决定：

tR = t0(1 + KVs / Vm)

式中tR表示某物质的保留时间，t0是色谱系统的死时间，即流动相进入色谱柱到流出色谱柱的时间，这个时间由色谱柱的孔隙、流动相的流速等因素决定。K为分配系数，VsVm表示固定相和流动相的体积。这个公式又叫做色谱过程方程，是色谱学最基本的公式之一。

在薄层色谱中没有样品进入和流出固定相的过程，因此人们用比移值标示物质的色谱行为。比移值是一个与保留时间相对应的概念，它是样品点在色谱过程中移动的距离与流动相前沿移动距离的比值。与保留时间一样，比移值也由物质在色谱中的分配系数决定：

R_f=\frac{V_m+KV_s}

其中Rf是比移值，K表示色谱分配系数，VsVm表示固定相和流动相的体积。

基于热力学的塔板理论

塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。

根据塔板理论，待分离组分流出色谱柱时的浓度沿时间呈现二项式分布，当色谱柱的塔板数很高的时候，二项式分布趋于正态分布。则流出曲线上组分浓度与时间的关系可以表示为：

C_t=\frac{\sigma\sqrt{2\pi}} e^{-\frac{(t-t_R)^2}{2\sigma^2}}

这一方程称作流出曲线方程，式中Ct为t时刻的组分浓度；C0为组分总浓度，即峰面积；σ为半峰宽，即正态分布的标准差；tR为组分的保留时间。

根据流出曲线方程人们定义色谱柱的理论塔板高度为单位柱长度的色谱峰方差：

H=\frac{\sigma^2}

理论塔板高度越低，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。决定理论塔板高度的因素有：固定相的材质、色谱柱的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。

塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。如塔板理论认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有径向扩散，这些都是不符合色谱柱实际情况的，因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。

基于动力学的Van Deemter方程

Van Deemter方程是对塔板理论的修正，用于解释色谱峰扩张和柱效降低的原因。塔板理论从热力学出发，引入了一些并不符合实际情况的假设，Van Deemter方程则建立了一套经验方程来修正塔板理论的误差。

Van Deemter方程将峰形的改变归结为理论塔板高度的变化，理论塔板高度的变化则源于若干原因，包括涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等。

由于色谱柱内固定相填充的不均匀性，同一个组分会沿着不同的路径通过色谱柱，从而造成峰的扩张和柱效的降低。这称作涡流扩散

纵向扩散是由浓度梯度引起的，组分集中在色谱柱的某个区域会在浓度梯度的驱动下沿着径向发生扩散，使得峰形变宽柱效下降。

传质阻抗本质上是由达到分配平衡的速率带来的影响。实际体系中，组分分子在固定相和流动相之间达到平衡需要进行分子的吸附、脱附、溶解、扩散等过程，这种过程称为传质过程，阻碍这种过程的因素叫做传质阻抗。在理想状态中，色谱柱的传质阻抗为零，则组分分子流动相和固定相之间会迅速达到平衡。在实际体系中传质阻抗不为零，这导致色谱峰扩散，柱效下降。

在气相色谱中Van Deemter方程形式为：

H=A+\frac{\mu}+C\mu

其中H为塔板数，A为涡流扩散系数，B为纵向扩散系数，C为传质阻抗系数，μ为流动相流速。

在高效液相色谱中，由于流动相粘度远远高于气相色谱，纵向扩散对峰型的影响很小，可以忽略不计算，因而Van Deemter方程的形式为：

H = A + Cμ

【基本技术和方法】

色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。

吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。

分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。

离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。

排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。

色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。

分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。

【柱色谱法】( Column chromatography)

所用色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装有吸附剂。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各单体中的规定。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果，除另有规定外通常多采用直径为0.07-0.15mm的颗粒。吸附剂的活性或吸附力对分离效果有影响，应予注意。

吸附剂的填装干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞，加入适量的流动相，旋开活使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。湿法：将吸附剂与流动相混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整。

俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下，液面将柱表面相平时，即加试样溶液。

试样的加入除另有规定外，将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起。或将试样溶于适当的溶剂中。与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状；将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解，可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

洗脱除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大小，递增变换流动相的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。

【纸色谱法】(Paper chromatography)

以纸为载体，用单一溶剂或混合溶剂进行分配。亦即以纸上所含水分或其他物质为固定相，用流动相进行展开的分配色谱法。

所用滤纸应质地均匀平整，具有一定机械强度，必须不含会影响色谱效果的杂质，也不应与所用显色剂起作用，以免影响分离和鉴别效果，必要时可作特殊处理后再用。

试样经层析后可用比移值（Rf）表示各组成成分的位置（比移值=原点中心至色谱斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离之比），由于影响比移值的因素较多，因此一般采用在相同实验条件下对照物质对比以确定其异同。作为单体鉴别时，试样所显主色谱斑点的颜色（或荧光）与供置，应与对照（标准）样所显主色的谱斑点或供试品-对照品（1∶1）混合所显的主色谱斑点相同。作为质量指标（纯度）检查时，可取一定量的试样，经展开后，按各单体的规定，检视其所显杂质色谱斑点的个数或呈色（或荧光）的强度。作为含量测定时，可将色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定，也可用色谱扫描仪测定。

1、下行法所用色谱缸一般为圆形或长方形玻璃缸，缸上有磨口玻璃盖，应能密闭，盖上有孔，可插入分液漏斗，以加入流动相。在近缸顶端有一用支架架起的玻璃槽作为流动相的容器，槽内有一玻璃棒，用以支持色谱滤纸使其自然下垂，避免流动相沿滤纸与溶剂槽之间发生虹吸现象。

取适当的色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条，离纸条上端适当的距离（使色谱纸上端能足够浸入溶剂槽内的流动相中，并使点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处）用铅笔划一点样基线，必要时色谱纸下端可切成锯齿形，以便于流动相滴下。

将试样溶于适当的溶剂中，制成一定浓度的溶剂。用微量吸管或微量注射器吸取溶剂，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干。样点直径一般不超过0.5cm，样点通常应为圆形。

将点样后的色谱滤纸上端放在溶剂槽内，并用玻璃棒压住，使色谱纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂，点样基线在支持棒下数厘米处。色谱开始前，色谱缸内用各单体中所规定的溶剂的蒸气饱和，一般可在色谱缸底部放一装有流动相的平皿，或将浸有流动相的滤纸条附着在色谱缸的内壁上，放置一定时间，俟溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。然后添加流动相，使浸没溶剂槽内滤纸，流动相即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开至规定距离后，取出滤纸，标明流动相前沿位置，俟流动相挥散后按规定方法检出色谱斑点。

2、上行法色谱缸基本和下行法相似，唯除去溶剂槽和支架，并在色谱缸盖上的孔中加塞，塞中插入玻璃悬钩，以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上。色谱滤纸一般长约25cm，宽度则视需要而定。必要时可将色谱滤纸卷成筒形。点样基线距底边约2.5cm，点样方法与下行法相同。色谱缸内加入适量流动相，放置，俟流动相蒸气饱和后，再下降悬钩，使色谱滤纸浸入流动相约0.5cm，流动相即经毛细管作用沿色谱滤纸上升，除另有规定外，一般展开至15cm后，取出晾干，按规定方法检视。

色谱可以向一个方向进行，即单向色谱；也可进行双向色谱，即先向一个方向展开，取出，俟流动相完全挥发后，将滤纸转90°，再用原流动相或另一种流动相进行展。亦可多次展开，连续展或径向色谱等。

【薄层色谱法】(Thin-layer chromatography)

按各单体所规定的载体，放入适当容器，加入适量水以配成悬浮液，在厚度均匀一致的50×200mm或200×200mm平滑玻璃板上将此悬浮液均布成0.25mm的厚度，风干后一般在110℃下干燥0.5-1h（或按单体规定）。

以离薄层板一端约25mm的位置作为点样基线，用微量吸管按规定量吸取试样液和对照（标准）液，点于基线上，点与点之间的距离在10mm以上，液点的直径约3mm，风干后，基线一端向下，将薄层板放入展开溶剂，溶剂层深10mm，并预经开展溶剂的蒸汽饱和。在展开溶剂从基线上升至规定距离（一般为15cm）后，取出薄层板，风干，然后按规定的方法，对斑点的位置和颜色进行检查。

【气相色谱法】(Gas chromatography)

气相色谱法是在以适当的固定相做成的柱管内，利用气体（载气）作为移动相，使试样（气体、液体或固体）在气体状态下展开，在色谱柱内分离后，各种成分先后进入检测器，用记录仪记录色谱谱图。

在对装置进行调试后，按各单体的规定条件调整柱管、检测器、温度和载气流量。进样口温度一般应高于柱温30-50度。如用火焰电离检测器，其温度应等于或高于柱温，但不得低于100℃，以免水汽凝结。色谱上分析成分的峰的位置，以滞留时间（从注入试样液到出现成分最高峰的时间）和滞留容量（滞留时间×载气流量）来表示。这些在一定条件下，就能反应出物质所具有特殊值，并据此确定试样成分。

根据色谱上出现的物质成分的峰面积或峰高进行定量。峰面积可用面积测定仪测定，按半宽度法求得（即以峰1/2处的峰宽×峰高求得）。峰高的测定方法是从峰高的顶点向记录纸横座标准垂线，找出此垂线与峰的两下端联结线的交点，即以此交点至峰顶点的距离长度为峰高。

定量方法可分以下三种：

1、内标准法取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量，各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调制标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱，根据色谱图取标准被测成分的峰面积和峰高和内标物质的峰面积和峰高的比例为纵坐标，取标准被测成分量和内标物质量之比，或标准被测成分量为横坐标，制成标准曲线。

然后按单体中所规定的方法调制试样液。在调制试样液时，预先加入与调制标准液时等量的内标物质。然后按制作标准曲线时的同样条件下得出的色谱，求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰积或峰高之比，再按标准曲线求出被测成分的含量。

所用的内标物质，应采用其峰面积的位置与被测成分的峰的位置尽可能接近并与被测成分以外的峰位置完全分离的稳定的物质。

2、绝对标准曲线法取标准被测成分按依次增加或减少阶段法，各自调制成标准液，注入一定量后，按色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高为纵坐标，而以标准被测成分的含量为横坐标，制成标准曲线。然后按单体中所规定的方法制备试样液。取试样液按制标准曲线时相同的条件作出色谱，求出被测成分的峰面积和峰高，再按标准曲线求出被测成分的含量。

3、峰面积百分率法以色谱中所得各种成分的峰面积的总和为100，按各成分的峰面积总和之比，求出各成分的组成比率。

【气液色谱法】（gas-liquid chromatography)

这时所指的气液色谱法，主要用于各种香料物质的分析，基本条件和参数主要依照美国精油协会（EOA）于1979年所建议的方法。其基本原理、操作、标准状态等均与上述气相色谱法相同。

1、柱用304号合金所制不锈钢管，长3m，内径2.16-2.57mm，外径3.18mm。底物：极性柱为聚乙二醇20M（Carbowax 20M）,分子量约2万；非极性柱为气相色谱级甲基硅氧烷（SE-30），或二甲基硅氧烷（OV-1或OV-101）。底物浓度：重量的105。固体载体：10目或20目熔融煅烧过的硅藻土，经硅烷化和酸洗后，其自由倾落密度为0.2g/cm3，最小120目，最大80目。装填密度每cm3应大于0.24g。

2、载气氦, 氮。最低流量为每分钟25-50ml。

【分析状态】

极性柱：起始温度，最低75度；最终温度，最高225度。升温速度，每分钟2-8度。

非极性柱：起始温度，最低75度；最终温度，不超过275度；升温速度，每分钟2-8度。

进样温度：225-250度。试样量：0.1-1ul。

检测器：用热导池。检测器的操作条件应维持恒定。

糟糕的金针菇

2025-12-04 07:13:37

试验段合成的介孔二氧化硅纳米粒子（质谱）。染料—合成了掺杂软件修改先前报告方法。8异硫氰酸罗丹明B（瑞达国贸，奥德里奇）（5毫克）或异硫氰酸荧光素（荧光，奥德里奇）（4毫克）反应44µ升3（黄芪多糖，西格玛，98%）（摩尔比染料：黄芪多糖）1 : 10）在1毫升乙醇在黑暗。氢氧化钠（0.35毫升，2米）加入50毫升的cetyltrimethylam—溴化铵（铵，苯，99 + %）溶液（0.1克50毫升水）。混合物被加热到70摄氏°，其次是加入0.5毫升的正硅酸乙酯（正硅酸乙酯，苯，98%）50µ升aps-modified染料溶液。1分钟后，0.5毫升乙酸乙酯（乙酸乙酯，samchun，99.5%）被添加，和由此产生的混合物搅拌70°为30，年龄2小时沉淀，离心收集和清洗与水和乙醇的四倍。最后，该pore-generating模板，表面活性剂，去除酸性乙醇回流解决方案。一个教学透射电子显微镜（日本电子公司）用于透射电子显微镜（透射电镜）分析。平均大小的软件估计测量尺寸200粒子。表面改性的软件。表面干的是功能与胺组的治疗黄芪多糖。微软的（0.1毫克）是分散在10毫升乙醇。解决办法是回流3小时，其次是增加了40µ升的AP。后离心，洗涤用乙醇胺，微软本发明涉及了5毫升乙醇。配体交换铁3o4纳米晶体。分散的Fe3O 4纳米晶包覆油酸合成有机物通过先前报告的程序。132-bromo-2-methyl—丙酸（bmpa，奥德里奇，98%）（0.5克）和柠檬酸（samchun）（0.05克）溶解在混合的氯仿和二甲基甲酰胺（50/50伏，15毫升）。14合成的纳米晶（15毫克）分散在bmpa溶液搅拌过夜30°C .最后，ligand-exchanged纳米晶体的检索离心分离和再分散在5毫升乙醇。合成铁3o4-与表面改性聚乙二醇。微软的胺官能分散（1毫升）反应5毫升的ligand-exchanged铁3o4纳米晶体色散。本铁3o4-微软被检索由离心洗乙醇消除多余的铁3o4纳米晶体。由此产生的铁3o4—微软是混有25毫克甲氧基聚（乙烯乙二醇）琥珀戊二酸（mpeg-sg，分子量5000，sunbio）溶解在5毫升乙醇。将混合物搅拌一夜之间在30°首席技术官诱导共价键之间的残余胺基团的表面和琥珀的群体的聚乙二醇。搬迁后未mpeg-sg离心，25毫克甲氧基分享到

悦耳的斑马

2025-12-04 07:13:37

橙皮素(3’，5，7-三羟基-4-甲氧基黄酮，3’，5，7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone)常见于柑橘类果实中。流行病学研究表明，每日增加橙皮素的摄入量能够减少人类心血管疾病的死亡率，肺癌和哮喘。也有研究显示，橙皮素能够有效治疗许多疾病，其能够产生广泛的生物效应，包括血管舒张作用、抗氧化剂作用、神经保护作用、消炎作用、抗病毒效果和降低胆固醇的作用(wangh，wangh，zhangh，etal.inhibitoryeffectsofhesperetinonnav1.5channelsstablyexpressedinhek293cellsandonthevoltage-gatedcardiacsodiumcurrentinhumanatrialmyocytes[j].actapharmacologicasinica，2016，789：98-108.)。橙皮素的结构式如下面的式i所示。

橙皮素的配糖形式是橙皮苷。橙皮苷具有多种生物功能，如清除自由基、抗氧化作用和保护神经，还潜在地预防老年痴呆症、抗抑郁症、抗炎、预防癌症和心血管疾病(a.hirata，y.murakami，m.shoji，y.kadoma，s.fujisawa，kineticsofradical-scavengingactivityofhesperetinandhesperidinandtheirinhibitoryactivityoncox-2expression，anticancerres.25(2005)3367-3374.)。

α-葡萄糖苷酶(ec3.2.1.20)是一种分解代谢酶，能够将淀粉及糖原水解成葡萄糖。在人体中，α-葡萄糖苷酶调节血糖水平，提供维持健康状态的能量。但是，对于患有ii型糖尿病的病人而言，α-葡萄糖苷酶活性高时，水解糖原能力强，提升了血浆中的葡萄糖水平，从而加重了ii型糖尿病，甚至会引起临床上的严重后果。

因此，出于药用目的抑制α-葡萄糖苷酶，已经有多种α-葡萄糖苷酶抑制剂进入临床应用，例如阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。α-葡糖苷酶抑制剂通过维持体内血糖在一个稳定的水平，预防或治疗糖尿病。已有的α-葡糖苷酶抑制剂(包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇)是一类具有糖结构的新型抗糖尿病药物，可以明显降低ii型糖尿病人餐后血糖水平，减少糖尿病并发症的发生(何素婷，陈代杰.具有α-葡糖苷酶抑制作用的抗糖尿病药物[j].工业微生物，2003，33(1)：43-49.)。

此外，也有文献提出α-葡萄糖苷酶是一种附睾标志物(epididymalmarker)，与肿瘤的转移和增长过程相关(j.f.guerin，h.b.ali，j.rollet，c.souchier，j.c.czyba，alpha-glucosidaseasaspecificepididymalenzymemarker.itsvalidityfortheetiologicdiagnosisofazoospermia，j.androl.7(1986)156-162；s.atsumi，c.nosaka，y.ochi，h.iinuma，k.umezawa，inhibitionofexperimentalmetastasisbyanalpha-glucosidaseinhibitor，1，6-epi-cyclophellitol，cancerres.53(1993)4896-4899；r.pili，j.chang，r.a.partis，r.a.mueller，f.j.chrest，a.passaniti，thealpha-glucosidaseiinhibitorcastanosperminealtersendothelialcellglycosylation，preventsangiogenesis，andinhibitstumorgrowth，cancerres.55(1995)2920-2926.)。

目前，尚需要开发新的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

技术实现要素：

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，惊奇地发现，橙皮素能够有效地抑制α-葡糖苷酶，具有制备糖尿病特别是ii型糖尿病的药物的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及橙皮素或其药学上可接受的盐或者橙皮苷或其药学上可接受的盐在制备如下的(1)-(3)中任一项中的用途：

(1)α-葡糖苷酶抑制剂，

(2)治疗和/或预防糖尿病的药物，

(3)治疗和/或预防肿瘤的药物例如抑制肿瘤转移和/或增长的药物。

在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述糖尿病为ii型糖尿病。

在发明中，通过抑制动力学和分子动力学模拟积分法评价橙皮素对α-葡萄糖苷酶的影响。本发明人发现，橙皮素能够可逆地抑制α-葡萄糖苷酶，且抑制类型为斜率-抛物线混合类型(ic50＝0.38±0.05mm；kislope＝0.23±0.01mm)；另外，这种抑制是伴随蛋白质三级结构变化的。基于橙皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，其能够用于制备防治糖尿病特别是ii型糖尿病(例如与α-葡萄糖苷酶相关的ii型糖尿病)的药物。

肿瘤细胞中具有α-葡萄糖苷酶，α-葡萄糖苷酶参与到肿瘤细胞相互作用的转移过程以及肿瘤细胞表面某些寡糖的合成。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤转移和/或增长为α-葡萄糖苷酶参与的肿瘤转移和/或增长。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的橙皮素或其药学上可接受的盐，和/或橙皮苷或其药学上可接受的盐；可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料(例如载体或赋形剂)。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，其还包含选自如下的一种或多种：

阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇、二甲双胍、促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、gpl-1受体激动剂、ddp-4酶抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，其为口服制剂或注射剂。

通常本发明药物组合物含有0.1重量％-90重量％的橙皮素或橙皮苷和/或其药学上可接受的盐。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将橙皮素或橙皮苷和/或其药学上可接受的盐与一种或多种固体或液体药物赋形剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的橙皮素或橙皮苷或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片、双层片或多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分橙皮素或橙皮苷或其药学上可接受的盐与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分橙皮素或橙皮苷或其药学上可接受的盐制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明橙皮素或橙皮苷，或其药学上可接受的盐的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明在再一方面涉及一种药物产品，其包含独立包装的药物制剂1和药物制剂2，其中：

所述药物制剂1包含有效量的橙皮素或其药学上可接受的盐，和/或橙皮苷或其药学上可接受的盐；

所述药物制剂2包含选自如下的一种或多种：

阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇、二甲双胍、促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、gpl-1受体激动剂、ddp-4酶抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物产品，其中，所述药物制剂1或药物制剂2独立地为口服制剂或注射剂。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制α-葡糖苷酶的方法，包括施加于对象有效量的橙皮素或其药学上可接受的盐，和/或橙皮苷或其药学上可接受的盐的步骤；优选地，所述对象为细胞；更优选地，所述细胞为哺乳动物细胞或者微生物细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述的抑制方法，是非治疗目的的。

在本发明的一个实施方案中，所述的抑制方法，其中，所述哺乳动物细胞为人的体细胞例如人胰岛细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述的抑制方法，其中，所述微生物细胞为细菌细胞、霉菌细胞或酵母菌细胞；优选地，为酿酒酵母细胞。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗糖尿病的方法，包括给予受试者有效量的橙皮素或其药学上可接受的盐和/或橙皮苷或其药学上可接受的盐、本发明的药物组合物或者本发明的药物产品的步骤。

当用于上述治疗和/或预防和/或辅助治疗时，治疗和/或预防有效量的橙皮素或橙皮苷或其药学上可接受的盐可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，以含有该活性成分与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。并且应认识到，本发明活性成分和药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体药物组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，橙皮素或橙皮苷或其药学上可接受的盐用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001-1000mg/kg体重/天，例如介于0.01-100mg/kg体重/天，例如介于0.01-10mg/kg体重/天。

本发明中，

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

发明的有益效果

橙皮素或其药学上可接受的盐能够有效地抑制α-葡糖苷酶，具有制备糖尿病特别是ii型糖尿病的药物的潜力。

附图说明

图1a：底物体系含橙皮素的条件下，对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线。n＝4。其中，横坐标表示橙皮素的浓度(mm)，纵坐标表示α-葡萄糖苷酶的相对活性。

图1b：底物体系不含橙皮素的条件下，对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线。n＝4。其中，横坐标表示橙皮素的浓度(mm)，纵坐标表示α-葡萄糖苷酶的相对活性。

图2：橙皮素对α-葡萄糖苷酶的可逆抑制曲线。其中，横坐标表示酶浓度[e]，纵坐标是吸光度的值。橙皮素浓度分别为0mm、0.2mm、0.5mm、1.0mm和2.0mm，在图中依次用：■、●、▲、和◆代表。■所标记的曲线作为对照曲线。

图3：橙皮素对α-葡萄糖苷酶抑制作用的时间进程动力学曲线。其中，橙皮素浓度分别为0.05mm、0.2mm、0.3mm、0.5mm和0.8mm，在图中依次用：■、●、▲、和◆代表。其中，横坐标表示时间(min)，纵坐标表示α-葡萄糖苷酶的相对活性。

图4a：橙皮素抑制α-葡萄糖苷酶的双倒数曲线图。其中，横坐标是底物浓度的倒数，单位是mm-1，纵坐标是吸光度的值的倒数。橙皮素浓度分别为0mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm和0.4mm，在图中依次用：■、●、▲、和◆代表。

图4b：斜率对橙皮素浓度的二次做图，数据来自图4a。其中，横坐标表示橙皮素的浓度(mm)，纵坐标表示不同浓度的橙皮素的双倒数曲线的斜率。

图5a：橙皮素影响下的α-葡萄糖苷酶的荧光分光光度测量图。横坐标是荧光分光光度计的发射波长，单位是nm，纵坐标是α-葡萄糖苷酶吸收的荧光强度。其中1-7分别依次代表橙皮素浓度0mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.1mm和0.15mm。

图5b：α-葡萄糖苷酶吸收的荧光强度最高峰值对应波长与橙皮素浓度二次做图。横坐标是橙皮素浓度，单位是mm，纵坐标是α-葡萄糖苷酶吸收的荧光强度最高峰值对应的荧光分光光度计的发射波长，单位是nm。数据来自图5a。

图5c：最大荧光强度与橙皮素浓度的曲线图。横坐标是橙皮素浓度，单位是mm，纵坐标是橙皮素影响下的α-葡萄糖苷酶最大荧光吸收强度。

图5d：最大荧光强度差与橙皮素浓度的二次做图。横坐标是橙皮素浓度的倒数，单位是mm-1，纵坐标是消去最大自然荧光强度影响的α-葡萄糖苷酶荧光吸收强度。

图6：ans荧光强度与橙皮素浓度的柱形图。横坐标是橙皮素浓度，单位是mm，纵坐标是ans荧光吸收强度。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1.实施例所用试剂

本发明中，橙皮素、α-葡萄糖苷酶、pnpg、ans均购自sigma-aldrich(usa)公司。其余试剂为国产分析纯。

α-葡萄糖苷酶(来自酿酒酵母)酵母菌的α-葡萄糖苷酶和人体中的是类似的。其底物是糖原，产物是葡萄糖，已被证实(岳振峰，陈小霞，彭志英.α-葡萄糖苷酶研究现状及进展[j].食品与发酵工业，2000，26(3)：63-67.)。

pnpg，4-硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷，其结构式如下面的式ii所示。

有研究证实，α-葡萄糖苷酶是属于键专一性酶，主要是作用于化学键，对底物配对的要求相对宽松(岳振峰，陈小霞，彭志英等.α-葡萄糖苷酶研究现状及进展[j].食品与发酵工业，2000，26(3)：63-67，98.)。pnpg是本领域人员熟知的研究α-葡萄糖苷酶应该使用的底物。

ans，即8-苯氨基-1-萘磺酸，其结构式如下面的式iii所示。

2.部分溶液的配制

(1)α-葡萄糖苷酶溶液：α-葡萄糖苷酶溶于50mm的磷酸缓冲液，ph7.0。α-葡萄糖苷酶配制时浓度为10μm。用于下面的实施例。如果没有特别说明，反应体系中α-葡萄糖苷酶的反应初始浓度均为0.1μm。

(2)pnpg溶液：溶于50mm磷酸缓冲液，ph7.0，pnpg浓度为5mm。pnpg在反应体系中的浓度是2mm。

(3)橙皮素溶液：用100％dmso完全溶解橙皮素，再用50mm磷酸缓冲液，稀释至橙皮素浓度为100mm，此时dmso为5％。此橙皮素溶液为母液，使用时按照需求浓度进行稀释，稀释液使用5％dmso。这里5％dmso由5体积的dmso与95体积的去离子水配制得到。

实施例1：橙皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

下面在底物体系含橙皮素和不含橙皮素两种条件下，分别进行实验操作。

一、底物体系含橙皮素

1.实验方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分别与不同浓度的橙皮素溶液以20∶1的体积比混合，混合后橙皮素的浓度依次为0mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm，在25℃下水浴10min，得到11份混合物。

(2)上述混合物每份分别取10μl，加入到1ml底物体系中，其中底物体系由pnpg溶液与相应浓度的橙皮素溶液以95∶5的体积比配制得到。这里加入橙皮素的目的是为了确保加入到底物体系之后，橙皮素的浓度与加入之前保持一致。底物pnpg的反应初始浓度均为2.0mm，α-葡萄糖苷酶的反应初始浓度均为0.1μm。

(3)使用紫外分光光度计，在发射波长400nm/min条件下，测量α-葡萄糖苷酶的活性变化，测定温度为25℃。

反应的整个过程从酶促反应动力学角度看包括3个阶段：一级反应、混合级反应和零级反应。需要在一级反应反应阶段进行测量，故操作时要迅速，滴加混合物后即开始测量，经过约1分钟后，从仪器显示的酶活性曲线上可看出过渡为混合及级应，则停止测量。

上述操作，对于每个橙皮素浓度，平行进行4次实验(n＝4)，取平均值。

2.实验结果

结果如图1a所示。

结果表明，橙皮素在酶活性剩余一半时的浓度(ic50)为0.38±0.05mm(n＝4)。

二、底物体系不含橙皮素(稀释效应实验)

1.实验方法

按照前面“底物体系含橙皮素”的实验方法进行，不同之处在于底物体系含pnpg，不含橙皮素。

每个橙皮素浓度，平行进行4次实验(n＝4)。

2.实验结果

结果见图1b。

由于底物体系没有橙皮素，酶体系加入到底物体系中测活时，橙皮素就被稀释了。图1b显示，通过稀释，酶活性能够恢复一部分，没有完全失活。说明橙皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。

图1b还显示，甚至在完全灭活的情况下，即橙皮素浓度为2.5mm时(如图1a，纵坐标都降到约0了)，酶的活性能够恢复至70％。这表明橙皮素与酶是可逆结合的，酶的活性可通过简单的稀释效应恢复。

实施例2：抑制可逆性的验证实验

为了检测和验证橙皮素作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的可逆性，进一步证明实施例1的实验结果，在改变橙皮素浓度的条件下，做出酶残余活性与酶浓度的关系。

1.实验方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分别与不同浓度的橙皮素溶液(橙皮素浓度：0mm、0.2mm、0.5mm、1.0mm和2.0mm)以20∶1的体积比混合，25℃下水浴10min，得到5份混合物。

(2)将上述混合物分别取10μl加入到1ml底物体系中，其中底物体系由pnpg溶液与相应浓度的橙皮素溶液以95∶5的体积比配制得到。底物pnpg的反应初始浓度为2.0mm，[e]表示α-葡萄糖苷酶的反应初始浓度，依次为0.02μm、0.05μm、0.1μm、0.15μm、0.20μm。

(3)用紫外分光光度计测量在发射波长400nm/min条件下，α-葡萄糖苷酶的活性变化，测定温度为25℃。具体操作参照实施例1。

上述操作，对于每个橙皮素浓度，平行进行4次实验(n＝4)。

2.实验结果

结果如图2所示。

结果表明，随着抑制剂橙皮素浓度的升高，直线穿过原点，直线的斜率逐渐降低，说明橙皮素诱导抑制的作用是可逆的。如果是不可逆的情况，抑制剂浓度增加的曲线会与对照曲线(即图2中■所标记的曲线)斜率相同，并会与x轴相交于相对应酶浓度的位置。

图2的结果明确地证明，橙皮素与α-葡萄糖苷酶是可逆结合的。

实施例3：橙皮素对α-葡萄糖苷酶抑制作用的时间进程动力学

1.实验方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分别与不同浓度的橙皮素溶液(0mm、1mm、4mm、6mm、10mm、16mm)以20∶1的体积比混合，得到6份混合物，在25℃下水浴，指定的时间间隔：1、2、3、4、5、10、15、20、25、30min，将上述混合物分别取10μl，加入到相对应橙皮素浓度的底物体系(1ml)中，其中底物体系由pnpg溶液与相应浓度的橙皮素溶液以95∶5的体积比配制得到。底物pnpg的反应初始浓度为2.0mm，α-葡萄糖苷酶的反应初始浓度为0.1μm。

(2)用紫外分光光度计在发射波长400nm/min条件下，测量α-葡萄糖苷酶的活性变化，测定温度为25℃。具体操作参照实施例1。

2.实验结果

如图3所示。

图3显示，在橙皮素(浓度在0.05-0.8mm)与酶混合水浴的时间间隔内，酶没有显著的动力学进程。酶失活的反应在很短的时间内就到达了平衡，这证明了橙皮素能够非常迅速地与酶结合，并没有经过特殊的过程就使催化活动失活，同时说明了α-葡萄糖苷酶上有橙皮素特定的结合位点。换言之，快速失活而没有任何明显的渐进的动态过程表明的具体对接橙皮素的位置可能位于酶活性部位的口袋里。