关于病毒纯化

在接种10d后采收病叶，在0.02mol/L的磷酸缓冲液（pH8），含有0.02mol/Lβ-巯基乙醇和Al203（每1g叶片+1.4m1缓冲液+0.15g.A12O3）中研磨。在1500r/min下离心15～20min后，将上清液与磷酸钙溶液（0.8ml/g叶片组织）充分混合。继续在1500r/min下离心15～20min。收集上清液，在78000r/min下离心3h。将沉淀物溶于0.01mol/LEDTA（pH6.0），并用柠檬酸调至pH5.0，再离心使病毒粒子沉淀。再用NaOH调上清液至pH6.0，通过高速离心富集病毒粒子。将沉淀物溶于0.01mol/LEDTA（pH6.0）中，在此条件下，病毒粒子保持良好的稳定性。以曼陀罗作为病毒提取源的植物可以获得400μg/g组织的产量。有些分离物不能采用这种方法提纯，需要在研磨时加入聚乙二醇（PEG.6000）和0.1mol/L.NaCl。详细参见Fulton，R.W.Virology.1967，32：153。另一种从Nicotiana.edwardsonii组织中提纯病毒的方法是利用Triton.X-100，程序包括采用碳素冻融法和二乙醚-CC14对叶片提出物进行澄清。

病毒名称：玉米褪绿矮缩病毒Maize chlorotic dwarf virus（MCDV）。

分类地位：属于矮化病毒属Waikavvirus，伴生病毒科Sequiviridae。在国际病毒分类委员会（ICTV）中的编码为00.065.0.02.003。

病毒异名：Ohio corn stunt agent（GSA-OH）。

病毒提纯：在含有0.5%2-巯基乙醇的0.1mol/L或0.5mol/L（pH7）磷酸钾缓冲液中将发病的玉米组织匀浆（2ml缓冲液/g组织）。用纱布包裹并用力挤压出汁液，然后加入氯仿（1/3～1/2体积）乳化使其澄清。回收水相，并采用下述方法之一加以纯化：

①将澄清的提纯液离心（100000g，1h）。将沉淀在0.1mol/L或0.5mol/L（pH7）的磷酸钾缓冲液中悬浮过夜，然后在溶解于0.5mol/L（pH7）磷酸钾缓冲液中10%～40%的蔗糖梯度中离心。回收含有病毒的区带，并通过再次沉淀、重新悬浮于0.5mol/L（pH7）磷酸钾缓冲液中，去掉蔗糖（Louie，Knoke&Gordon，1974）。

②加入聚乙二醇（平均分子质量为6000～7500u）至6%（W/V）的浓度、氯化钾至4%（W/V）的浓度。在室温下缓慢搅拌1h。离心（10000g）20min，以1/50～1/30的体积（相对于初始提取液）将沉淀重新悬浮于0.5mol/L（pH7）的磷酸钾缓冲液中。通过在蒸馏水中透析沉淀病毒、经低速离心后重新悬浮于0.5mol/L（pH7）的磷酸钾缓冲液中将其浓缩2～3倍。可以用等密度氯化铯平衡离心法进一步纯化病毒。

病毒理化特性：

①病毒粒子：等径球状粒体，直径约30nm，沉降系数约183±6S.A260/A280为1.92±0.04。由聚丙烯酰胺凝胶电泳和沉降速率确定的粒子分子质量约3.2（±0.2）*106u。

②核酸：单链RNA，占粒体重量的大约36%。四种核苷酸所占的比例为G24，A30，C17，U29（Gingery，1976）。

株系：该病毒的典型株系采自美国的俄亥俄州（Nault et al.，1973）。几个来自阿拉伯高粱的分离物与该典型株系在所导致的矮化、褪色与叶片撕裂的程度不同（Nault&Bradfute，1979）。据报道，有一个分离物比典型株系导致较严重的三级脉条纹，但较为轻微的矮化（Nault et al.，1976）。在不同株系和分离物之间尚未发现血清学差异。

其他：在发现MCDV之前，人们曾认为美国大多数表现矮化、黄化或红叶这类变色症状的玉米植株发生了由某种螺原体（spiroplasma）导致的玉米矮化病。但是，MCDV与这类症状的频繁而密切的联系表明，在大多数情况下，该病害为玉米褪绿矮缩而非玉米矮化病。在美国，只从来自路易斯安那与得克萨斯的几个玉米标样中鉴定出了玉米矮化螺原体（Bradfute&Robertson，1974；Gordon&Nault，1977）。与此相反，在墨西哥玉米的类似症状则通常是由螺原体引起的（Davis，1973）。迄今只发现水稻东格鲁球状病毒、MCDV与叶蝉介体具有半持久性关系（Ling，1966；Nault et al.，1973）。

具体操作方法如下：

（1）仙台病毒法融合：

①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。并使两

细胞相互凝聚；

②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和

Mg2+，最适PH为8.0一8.2；

③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；

④融合成巨大细胞，仍需ATP。

（2）聚乙二醇（PEG）法：

聚乙二醇（PEG）结构为：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大于200小

于

6000者均可用作细胞融合剂。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。

一

般选用分子量为4,000，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3

调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不

易操作。

此外，还有物理方法：离心、振动、电刺激等。

木本指示植物：考虑到该病早期症状与生理性病害和虫害等症状较难区分，且缺乏敏感的指示植物，症状出现缓慢，因而生物学鉴定是不可靠的。

椰子：接种的树苗，在未展开的幼叶下的第三或第四片复叶出现斑点，生长缓慢，叶片大小及数量减少，不能正常结果。

槟榔、高行李叶椰子、马尼拉棕Adonidiamerrillii：叶片也能形成褪绿或黄色斑点。

检测技术：缺乏敏感的指示植物，症状出现缓慢，生物学鉴定CCCVd是不可靠的。目前主要采用分子诊断技术，即分别采用或结合采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和斑点杂交技术。两者结合起来准确率更高，可在症状出现前数个月检测植株是否感染。

（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳。

可以有效地检测CCCVd，这种技术应用于口岸检疫、田间调查和病害监测。具体方法为，第四片以下的复叶上剪下小叶，于3倍体积0.1mol/LNa2SO3中研磨，纱布过滤后10000r/min，离心10min，加入聚乙二醇（分子量6000）至终浓度为5%，4℃下1～2h，低速离心后沉淀用1mmol/L的CTAB（十六烷三甲基溴化胺）悬浮，再用3倍体积的无水乙醇沉淀，即得到总核酸粗提液。提取的核酸在5%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，切下相应的条带，并在聚丙烯酰胺凝胶（含8mol/L的尿素）中变性电泳，此时类病毒RNA的单体、双体与细胞内RNA相互分离，经碱性甲苯胺蓝、溴化乙啶或硝酸银染色，可观察到特异的类病毒RNA条带。切下类病毒RNA条带，浸解和洗脱凝胶，无水乙醇沉淀，即得部分纯化的类病毒核酸。纯化的核酸经高压注射器注入到椰子实生苗上，观察是否出现症状，以确证类病毒的存在。

（2）分子杂交。

CCCVd经克隆或通过PCR扩增后，作为模板，合成与之互补的核酸，然后再用同位素标或生物素标记作为探针，用于杂交试验检测序列和CCCVd相同的分子，是一种十分灵敏的检测方法。

（3）电泳杂交。

将以上两种技术结合起来，即利用单向或双向电泳法将核酸分离，转移到杂交膜上，然后与其同位素标记探针进行杂交。这种方法最为准确和灵敏。

检疫危险性评价：本病的病原体椰子死亡类病毒，可经椰子繁殖材料进行远距离传播，对椰子可构成严重危害。国内尚未发生。季良进行危险性评价时，危险度值9分，为高危检疫性有害生物。鉴于其危害性，及CPPC、NAPPO、APPPC等均将其列为检疫性病害，我国也应考虑列入进境植物检疫潜在危险性有害生物名单。

地理分布：菲律宾。

检疫国家和地区：中国、巴西、保加利亚、荷兰、罗马尼亚、马来西亚、美国、秘鲁、欧盟、欧洲和地中海植保组织、斯洛伐克、智利、菲律宾、澳大利亚、印度尼西亚、阿尔及利亚、冰岛、摩洛哥等。CPPC、NAPPO、APPPC将OCCVd列为检疫性病害，而EPPO未将之列入名单。在EPPO地区，CCCVd对许多椰子树和其他一些单子叶植物具有潜在危害。但是，由于缺乏研究资料，无法具体列出寄主范围，也无法进行危险性分析。

应检植物：椰子等棕榈科植物。

检疫措施：进口时须经国家质量监督检验检疫总局特许审批，限量进口，并要求附有出口国《检疫证书》，保证不带此类病毒。入境后须经指定的隔离检疫站进行一年以上生育期检验，确认无病者，交还进口货主，并在隔离条件下繁殖无病毒种苗，才可允许用于生产种植。从理论上讲，最有效的检疫措施是禁止椰子种子或繁殖材料（包括胚胎培养物）从疫区进入EPPO地区，除非经过分子方法检测这些材料不带这种类病毒。

电镜法

直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)，EM 法观察的灵敏度较低，要求每毫升粪便样品中至少有大约 106个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。电镜法的缺陷在于设备昂贵，不能广泛普及；检测结果与操作者的技能和经验有直接关系；灵敏度相对较低；不适于大规模流行病学调查。

免疫法

包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。RIA法的灵敏度比IEM 法可 提高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA 法的不足之处在于它需要 6 d，且需要放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与 RIA 法相当，该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。1992年Jiang 等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后，建立起的 NV 酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围还比较窄。酶链免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是可广泛应用的检测方法。由于NLV培养还未成功，原来用作试剂的病毒抗原数量受到限制，用分子生物学技术已经可以人工重组NV的衣壳蛋白，从而解决了上述问题。

分子生物学检测方法

杂交技术和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的NV，尤其是低浓度的NV感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。

等温核酸扩增法 (NASBA)直接扩增RNA 来检测 NV，样品中病原RNA得到指数级扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。该方法的灵敏度略低于 RT-PCR 法；整个过程只有一步RNA扩增，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染；缩短了操作时间；假阳性率低。 RT-PCR检测食物中NV存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问题，因此病毒富集浓缩、样品处理是检测的关键，其中有两个重要方面影响检测结果，一是样品中病毒浓缩后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和纯度。

病毒浓缩

病毒浓缩 NV 浓缩方法一般分为两大类，一类为有机絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG 是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改变样品 pH 值，使毒粒与样品微粒分开，PEG 把病毒沉淀下来，达到浓缩的目的。目前对于固体样品 PEG 沉淀法是最有效的浓缩方法。

膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法，通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒，这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。检测海水、生活污水中的NV曾用过这种方法，为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。

核酸提取

食品样品成分复杂，所含有的脂肪、蛋白质、金属离子等物质都是 RT-PCR 反应抑制因子。NV是单链RNA病毒，核酸提取方法的优劣取决于两个方面：核酸的质量和去除抑制因子的能力。应用较成熟广泛的是胍法 RNA 提取法，即（异）硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，该方法改进后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等产品，与石英砂、磁珠等多孔颗粒相结合，已结合了poly(dT) 或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA，去除反应抑制因子。石英砂或磁珠纯化 RNA与传统的有机试剂（异丙醇、乙醇）沉淀 RNA 相比起来，效果较好，只是成本偏高。