硫酸铵分级沉淀蛋白质的原理和方法是什么啊

原理就是溶液中的离子强度不同时，不同蛋白质的溶解度不同，步骤就是不断加硫酸铵…以血浆为例：加到盐浓度20~30%时纤维蛋白原沉淀，再加到浓度50%时球蛋白沉淀，饱和时清蛋白沉淀…

一，基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

二，试剂及仪器

1.组织培养上清液、血清样品或腹水等

2.硫酸铵（NH4）SO4

3.饱和硫酸铵溶液（SAS）

4.蒸馏水

5.PBS(含0.2g/L叠氮钠)

6.透析袋

7.超速离心机

8.pH计

9.磁力搅拌器

三，操作步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。

（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS）

1.将767g（NH4）2SO4边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1mol/L,25°C）.

2.其它不同饱和度铵溶液的配制

（二）沉淀

1.样品（如腹水）20000′g离心30min，除去细胞碎片；

2.保留上清液并测量体积；

3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（

4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。

（三）透析

1.蛋白质溶液10000′g离心30min（4°C）。弃上清保留沉淀；

2.将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对

PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；

3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

四，应用提示

（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。

1.边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1(v/v)；

2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）；3.3000′g离心30min（4°C），保留上清液；上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；

4.上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；

5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效

（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。