如何正确使用乙酸

河豚毒素（TTX）定量酶联免疫检测试剂盒说明书

ELISA-kit for TTX

本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定河豚鱼中的河豚毒素（TTX）。该测试盒反应孔可拆卸，可测单份样品，也可测多份样品。定量分析时需有含450nm波长的微孔板酶标仪。

1 概要

河豚毒素（TTX）是一种强神经毒素，其性质稳定，加热、盐腌及高温烹煮均不易使其被破坏。河豚鱼中常含有河豚毒素。我国沿海居民素有食用河豚鱼的习惯。因误食或食用加工不当的河豚鱼而发生人畜中毒的事件每年都有发生。故准确检测河豚鱼中的河豚毒素对预防和控制河豚毒素中毒，具有重要意义。本检测方法具有灵敏、快速、简便、特异性好、取样量小并可同时检测大量样品等优点。

2 测定原理

本试剂盒采用固相酶联免疫吸附原理，利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板，加入河豚毒素标准品或样品、抗河豚毒素单克隆抗体进行孵育后，将未与包被抗原结合的抗体洗去；再加入酶标记的抗鼠IgG抗体孵育，加入显色液，经过终止液终止后，用酶标仪在450nm处测定OD值。

3 提供的物品

微孔板

5个浓度的TTX标准溶液（各0.5mL）

标准1：0ng/mL ……………………………………………………………直接使用

标准2：10.0ng/mL ………………………………………………………直接使用

标准3：20.0ng/mL ………………………………………………………直接使用

标准4：50.0ng/mL ………………………………………………………直接使用

标准5：200.0ng/mL………………………………………………………直接使用

抗体溶液(6mL) …………………………………………………………………直接使用

酶标物(12mL) …………………………………………………………………直接使用

显色液(12mL) …………………………………………………………………直接使用

终止液(6mL) ………………………………………………………………………直接使用

浓缩洗液(30mL) …………………………………………………………………稀释使用

4 盒中未提供，需自备物品

微孔板酶标仪（含450nm）、离心机、电炉、微量移液器、磁力搅拌器

量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸、分液漏斗

乙酸、氢氧化钠、去离子水或蒸馏水、PBS缓冲液

5 操作者注意事项

标准溶液中含有TTX毒素，应特别小心。

终止液为0.5M硫酸，避免接触皮肤。

每次加样后立即将所有试剂放回2~8 ℃。

每步加样时间应控制在5min内。

孵育过程中应避光。

不要使用过期试剂盒。

不要交叉使用不同批号试剂盒中的试剂。

6 储存条件

保存试剂盒于2~8℃。不要冷冻

显色液对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

将不用的微孔板放进原铝箔袋中，置2~8℃保存。

7 试剂变质的标志

标准1的吸光度值小于0.5个单位（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。

8 样品处理

8.1 鲜河豚鱼中河豚毒素的检测

----称取5g河豚鱼样品(肌肉、皮或内脏)，剪碎，加入25mL 0.1%的乙酸，用烧杯在电炉上煮沸搅拌10min。此步骤应注意不要让液体沸出容器，应控制加热温度，并不断搅拌。

----待冷却至室温后，上清用快速定性滤纸过滤于50mL离心管中

----沉淀用20mL0.1% 乙酸洗到烧杯中，再煮沸3min

----冷却至室温后，所有的液体及煮沸的样品都加到离心管中，3000rpm离心10min。

----取上清，量体积，置分液漏斗中

----加入等体积乙醚，振摇1分钟，静置分层。放出水层，量体积后至另一分液漏斗中，再加入等体积的乙醚，振摇1分钟，静止分层。

----将水层放入50mL容量瓶中，用1M氢氧化钠调节提取液中的pH值至6.5~7.4，然后加入PBS至50mL，提取液4℃保存备用。

8.2 鱼片、鱼干制品中河豚毒素的检测

-----样品中的TTX用0.1%乙酸在水浴中超声提取，提取液中的TTX用ELISA方法进行检测，若样品中TTX含量低于检出限则报告为<100mg/kg；样品中TTX含量在100~3000mg/kg之间，直接按ELISA实验结果报告；如果样品中TTX含量达到3000mg/kg，则需采用小鼠生物测定法进行验证，确认毒性反应后再按照ELISA实验结果报告。

9 酶免疫分析程序

----浓缩洗液为10倍浓缩液，使用时与去离子水或蒸馏水按体积比1:9稀释后使用。

----取所需数量的板条插入微孔架，用洗液洗涤微孔板3min×2次，记录样品及标准的位置。

----加入50mL标准品或处理好的样品到微孔，每个标准和样品必须使用新的吸头。

----加入50mL抗河豚毒素单克隆抗体溶液到每个微孔（注意移液器管尖不要接触到孔中的液体，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。

----每孔加入酶标物100mL，37℃孵育60min。

----用洗液洗涤微孔板3min×5次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。

----每孔加入显色液100mL（2滴），37℃孵育12min。

----每孔加入终止液50mL（1滴），立即用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值（OD值）。

注：在定量分析中，显色液和终止液需要用移液器准确量取。

10 样品浓度计算

以标准溶液OD值与标准1的OD值的比值为纵坐标（即标准品OD比），所对应标准溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，制作标准曲线。根据样品OD值与标准1的OD的比值（即样品OD比），可从曲线上得到对应点的横坐标，即为TTX浓度的对数值，求得反对数即为测定液中TTX浓度C（ng/mL），按下列公式计算出样品中TTX含量：

TTX含量（mg/kg）= 10×C×K

式中：C：测定液中TTX浓度（ng/mL）

K：提取液的稀释倍数

11 主要技术指标及参数

11.1 最低检出浓度10.0 ng/mL。

11.2 加标回收率在70~120%，条内变异系数＜10%，条件变异系数＜15%。

步骤：

①在混合液中加入饱和Na2CO3溶液，震荡、静置，此时发生分层现象（上层乙酸乙酯，下层乙酸钠、Na2CO3、乙醇混合液），用分液漏斗分离出乙酸乙酯。

②蒸发下层的混合液体，使乙醇蒸发出来。

③蒸馏剩余混合液（乙酸钠和Na2CO3），因为乙酸钠易发生水解

CH3COONa + H2O = CH3COOH + NaOH

蒸馏不断分离出乙酸。（由于乙酸的不断蒸发，使得反应能够不断向右进行， 此处用到勒夏特列原理）

方程式：

2CH3COOH + Na2CO3 = 2CH3COONa + CO2↑ + H2O

CH3COONa + H2O = CH3COOH + NaOH

冰醋酸

乙酸（acetic acid）分子中含有两个碳原子的饱和羧酸。分子式。它是一种有机化合物，是典型的脂肪酸。因为是醋的主要成分，又称醋酸。乙酸在常温下是一种有强烈刺激性酸味的无色液体。 乙酸的熔点为16.5℃（289.6 K）。沸点118.1℃（391.2 K）。相对密度1.05，闪点39℃，爆炸极限4%～17%（体积）。纯的乙酸在低于熔点时会冻结成冰状晶体，所以无水乙酸又称为冰醋酸。乙酸易溶于水和乙醇、乙醚和四氯化碳。其水溶液呈弱酸性。乙酸盐也易溶于水。当水加到乙酸中，混合后的总体积变小，密度增加，直至分子比为1∶1 ，相当于形成一元酸的原乙酸，进一步稀释，体积不再变化。其分子结构模型如图。

乙酸分子模型

乙酸的实验式为，化学式为。常被写为、或来突出其中的羧基，表明更加准确的结构。失去H后形成的离子为乙酸根阴离子。乙酸最常用的正式缩写是AcOH 或 HOAc，其中Ac代表了乙酸中的乙酰基（）。酸碱中和反应中也可以用HAc表示乙酸，其中Ac代表了乙酸根阴离子（），但很多人认为这样容易造成误解。上述两种情况中，Ac都不应与化学元素中锕的缩写混淆。

乙酸的化学反应。对于许多金属，乙酸是有腐蚀性的，例如铁、镁和锌，反应生成氢气和金属乙酸盐。因为铝在空气中表面会形成氧化铝保护层，所以铝制容器能用来运输乙酸。金属的乙酸盐也可以用乙酸和相应的碱性物质反应，比如最著名的例子：小苏打与醋的反应。除了醋酸铬，几乎所有的醋酸盐能溶于水。

乙酸能发生普通羧酸的典型化学反应，特别注意的是，可以还原生成乙醇，通过亲核取代机理生成乙酰氯，也可以双分子脱水生成酸酐。

同样，乙酸也可以成酯或氨基化合物。如乙酸可以与乙醇在浓硫酸存在并加热的条件下生成乙酸乙酯。

440℃的高温下，乙酸分解生成甲烷和二氧化碳或乙烯酮和水。

尽管从乙酸在水溶液中的离解能力来看它是一个弱酸，但是乙酸是具有腐蚀性的，其蒸汽对眼和鼻有刺激性作用。广泛存在于自然界，例如在水果或植物油中主要以其化合物酯的形式存在；在动物的组织内、排泄物和血液中以游离酸的形式存在。乙酸是一种简单的羧酸，是一个重要的化学试剂。乙酸也被用来制造电影胶片所需要的醋酸纤维素和木材用胶粘剂中的聚乙酸乙烯酯，以及很多合成纤维和织物。在家庭中，乙酸稀溶液常被用作除垢剂。食品工业方面，在食品添加剂列表E260中，乙酸是规定的一种酸度调节剂。