杂色废网胶怎么脱色

脱色的时候在脱色液里加入豆制品，比如豆皮，微波炉加热后，放在摇床上摇，可以达到快速脱色的目的，因为豆皮含有高蛋白，蛋白可以吸附R-250，R-250一旦从胶里游离出来，迅速被豆皮捕获，脱色液一直澄清，脱色神速。

(一)标准考马斯亮蓝染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)；

(2)室温下振摇温育4h至过夜；

(3)去除染色液，收集保存可重复使用20-40次：

(4)依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白/每条带。注：使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。将染色液或脱色液在微波炉或水浴中加热，(大约50-60℃)，染色时间可缩短至20min,脱色时间约 1-2h。

(二)快速考马斯亮蓝染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%三lv乙酸中)；

(2)室温下振摇温育20min；

(3)去除染色液，收集保存可重复使用多次；

(4)加入数倍体积的脱色液(25%甲醇、7%乙酸)室温振摇下脱色。必要时可更换脱色液。灵敏度为1.0ug蛋白/每条带。

(三)凝胶铵银染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的50%乙醇和10%乙酸，振摇30min至过夜；

(2)去除50%乙醇和10%乙酸，用去离子水清洗凝胶。加入20%乙醇, 室温振摇30min；

(3)去除20%乙醇，再加5倍体积的20%乙醇，室温振摇30min；

(4)去除20%乙醇，将凝胶转入通风柜内，加入5倍体积的用去离子水配制的5%戊2醛，室温振摇30min；

(5)去除戊2醛，用去离子水清洗凝胶。加入5倍体积的20%乙醇，室温振摇20min；

(6)去除20%乙醇，重复⑥两次；

(7)去除20%乙醇，用去离子水清洗凝胶。再加入5倍体积的用去离子水，室温温育10min；

(8)去除去离子水，加入4倍体积新鲜配制的氨-水/银溶液，室温振摇30min。配制100ml：加1.4ml 14.8mol/L氢氧化铵到100ml水中，再加入190ul　10mol/L氢氧-化钠；放置涡旋器上缓缓加入1ml新鲜配制的硝-酸银溶液(0.8g硝-酸银/ml水)，直至出现沉淀物，但很快溶解；

(9)去除氨-水/银溶液，用去离子水清洗凝胶20min以上，其间更换水数次；

(10)去除水，加入5倍体积新鲜配制的0.005%柠檬酸，0.019%的甲醛。轻柔混匀，数分钟内条带即显现出。当背景开始变化时，去除显影剂，用用去离子水清洗凝胶。在10%乙酸和20%乙醇中温育凝胶，以终止反应。灵敏度为1－10ng蛋白/每条带。

注：操作时，应戴手套并使用洁净的玻璃器皿，以免污染，影响反应的灵敏度。

(四)凝胶中性银染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的30%乙醇和10%乙酸，振摇30min至过夜；

(2)去除乙醇/乙酸溶液，加入5倍体积的30%乙醇, 室温振摇30min；

(3)去除乙醇，再加5倍体积的30%乙醇，室温振摇30min；

(4)去除乙醇，加入10倍体积的去离子水，室温振摇10min；重复用去离子水清洗两次；

(5)去除去离子水，加入4倍体积新鲜配制的0.1%硝-酸银溶液(用室温下贮存于棕色瓶内的20%原液稀释而得)，室温振摇30min；

(6)去除硝-酸银溶液，用去离子水清洗凝胶20s；

(7)去除水，加入5倍体积的2.5%碳酸钠和 0.02%的甲醛(pH<4.0),室温振摇温育，数分钟内条带即显现出。当背景开始变黑时，停止温育；

(8)在1%乙酸内清洗，停止反映。用去离子水清洗，更换数次，每次10min；灵敏度为1－10ng蛋白/每条带。

(五)凝胶铜染色法凝胶铜染色法为考马斯亮蓝或银染色法的替代染色方法

将凝胶lv化铜溶液中温育，在Tris和SDS同时存在时可形成明显的白色不透明的沉淀物。蛋白条仍然清晰，留下一个多肽分离模式的附染图象。由于蛋白质未结合在凝胶上，可通过EDTA去除Cu离子而得以洗脱，因而该方法特别适合需快速定位蛋白条带用于免疫反应，或进一步进行蛋白质化学研究。其染色模式如同考马斯亮蓝或银染色法的凝胶，易进行拍照。

(1)电泳后，凝胶用蒸馏水短时清洗数次，每次30s,勿洗过长时间；

(2)将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.3mol/L CuCl2；

(3)室温振摇5min，较厚的凝胶可适当延长时间。当CuCl2 进入凝胶时，在不含蛋白的区域会出现白色沉淀；

(4)用蒸馏水清洗数分钟，在黑色背景下观察结果。灵敏度为10-100ng蛋白/每条带(0.5mm厚的凝胶)或1ug蛋白/每条带(1mm厚的凝胶)。注：将凝胶在0.25mol/L EDTA、0.25mol/L Tris溶液中温育可使铜染逆转

氨基黑10B使用醋酸来脱色的原理是什么？氨基黑10B - 用途说明

主要用于对聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和硝酸纤维素膜上蛋白质的染色。在电泳后，推荐固定蛋白质在胶上。 胶用 0.1% 氨基黑10B的7% (v/v) 醋酸溶液染至少2 小时，然后用7% (v/v) 醋酸溶液脱色。检测灵敏度大概是考马斯亮蓝R250的20%。

贮存运输：易吸潮密封保存

条带变黄这个现象没有碰到过，什么叫底部条带变成黄色，其它条带呢？有正常的么？染色分快染和慢染，快染做法是先用染色液进行染色1h左右，如果嫌麻烦就在微波炉里加热30s，再染30分钟左右的样子就可以了，然后进行脱色，1小时内更换三次脱色液，基本就可以清楚的看到条带了。慢染是先用脱色液进行15脱色，再在脱色液中加入少量染色液，可以染色过液，这样做的好处是非常省脱色液。之前什么固色这些过程我没采用过，所以没有进行过对比。不过一般染色应该用R250，G250一般用做蛋白质的定量分析。http://liufengsong.blog.163.com/blog/static/3153036520098185460881/这里介绍了G250和R250的区别。试剂和染料时间久一点没什么关系，缓冲液1－2星期重新配制一次，否则tris缓冲液PH值容易变化，会对跑胶结果有影响，具体还有什么问题可以再讨论，因为你给的信息比较少不好做分析。

[实验九　血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳] 【实验目的】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。【实验原理】1．聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺（Acrylam [蛋白质 血清 电泳 酰胺 聚丙烯 凝胶 缓冲液 电泳]

【实验目的】

1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。

3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。

【实验原理】

1．聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺（Acrylamide简写为Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N，N1-methylene-bisacrylamide，简写Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）的作用下，聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联形成就具有三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。为了加速聚合，在合成凝胶时还加入四甲基乙二胺作为加速剂。

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聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。凝胶网孔的大小主要受成胶物的总浓度及Acr和Bis的比例的影响。一般电泳采用成胶物质总浓度为7.5%，此浓度称为标准凝胶浓度。如果改变总胶浓度，也应相应改变Acr和Bis的比例。

2．不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的原理根据凝胶各部分缓冲液的种类及pH值，孔径大小是否相同等，可分为连续系统和不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）。连续系统是指电泳槽内缓冲液的pH值与凝胶中的相同，不连续系统则不同。

不连续圆盘电泳一般是在小玻璃管内进行的。把三种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重叠起来。上层为样品胶，中间为浓缩胶，这两层胶的凝胶浓度为3%是大孔胶，应用Tris-HCl缓冲液，其pH6.7。下层是分离胶，此层凝胶总浓度为7.5%，是小孔胶，也用Tris-HCl缓冲液，pH8.9。上下电泳槽缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3。由于凝胶的孔径和缓冲液的pH值不同，产生浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，使电泳的灵敏度、分辨率提高。

（1）浓缩效应：无论哪种电泳方式，要想得到良好的分离效果，电泳开始前必须使样品中各种成分同处于同一起跑线上。样品加入后颗粒分散，不能从同一起点开始电泳，但样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层，使颗粒同时开始电泳。其机理是样品胶及浓缩胶的Tris-HCl缓冲液pH=6.7，电泳时，HCl全部电离为Cl-，而电泳槽内Tris-甘氨酸缓冲液pH=8.3，甘氨酸等电点pI=6.0，电泳时，甘氨酸仅极少部分电离为甘氨酸负离子（Gly-），一般血清蛋白质点约pI=5.0，也解离为蛋白质负离子（Pr-），其解离度比HCl小，比甘氨酸大。通电后，这三种离子同时向正极泳动，有效泳动率是Cl- ＞Pr- ＞Gly-，电泳时开始时，Cl-泳动最快（称快离子），很快超过Pr-，泳动到最前面，Gly-泳动最慢（称慢离子），泳动到最后，Pr-介于其间，被浓缩成一个狭小的样品薄层。这种浓缩作用可使蛋白质浓缩数百倍。血清蛋白在纸上电泳和醋酸纤维素薄膜电泳上仅可分成5～7个组分。而在聚丙烯酰胺凝胶电泳上则可以分为20～30个成分。

（2）电荷效应：蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的样品薄层，进入分离胶。由于各种蛋白质分子的等电点不同，在同一pH的缓冲液中所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个圆盘状的蛋白质区带。

（3）分子筛效应：各种蛋白质分子由于分子大小和构象不同，因而通过一定孔径的分离胶时所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同，表现的泳动率的不同而被分开。即使蛋白质所带的净电荷相似，也会由于分子筛效应被分开。

【器材和试剂】

1． 器材电泳仪、圆盘电泳槽、微量加样器、注射器、50ml小烧杯

2． 试剂

（1）30%丙烯酰胺储存液：丙烯酰胺30.0g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。

（2）催化剂（10％过硫酸铵）：过硫酸铵1g 加水至10ml，临用前现配。

（3）加速剂：四甲基乙二胺 (TEMED）

（4）分离胶缓冲液（pH8.8）：取三羟甲基氨基甲烷（Tris ）36.3g，加入1 mol /L HCl 48ml ，再加蒸馏水至100ml， 4℃保存。

（5）浓缩胶缓冲液（pH6.8）：取6.0g Tris，用1 mol /L HCl 48 ml，再加蒸馏水至1000ml，4℃保存。

（6）电泳缓冲液（pH8.3）：取28.8g甘氨酸，6.0g Tris，分别溶解后，加蒸馏水到100ml ，4℃保存。

(7)染色液：考马斯亮蓝R-2500.46g、甲醇（可用无水乙醇代替）110ml、28ml冰乙酸，TritonX-100 1ml,溶解后补足水至总体积400ml。

（8）脱色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用无水乙醇代替）110ml，冰乙酸28ml，TritonX-100 8ml,补足水至400ml。

（9）保存液 : 7%冰醋酸。

（10）样品稀释液：浓缩胶缓冲液25 ml加入蔗糖10g及0.05％溴酚蓝5ml，最后加水至100ml。

【操作步骤】

1．凝胶柱的制备

（1）取两端已有金钢砂磨平的10cm×0.6cm 的玻璃管。在距一端7cm和7.5cm处，各划一条线。插入橡皮垫中，垂直安放于试管架中。

（2）按下表配制分离胶，迅速用滴管将其沿管壁加入玻璃管内，至7 cm画线处。

分离胶(ml)

浓缩胶(ml)

30%丙烯酰胺

2.50

1.00

分离胶缓冲液(pH8.8)

1.25

—

浓缩胶缓冲液(pH6.8)

—

1.25

蒸馏水

6.20

7.65

TEMED

0.05

0.05

10%过硫酸铵

0.05

0.05

总体积

10

10

丙烯酰胺浓度（g%）

7.5

3.0

（3）随即用5ml注射器经针头沿玻璃管壁加入蒸馏水约0.5cm高度，加水时要缓慢，尽量减少凝胶表面的震动与混合。静置，待凝胶聚合后(约20min)，去除水相，然后用吸水纸吸干残余的液体。

（4）按上表配制浓缩胶，立即用滴管沿凝胶管壁加至7.5cm处，并随即沿管壁缓慢加入蒸馏水约0.5cm高度，静置20分钟。

2．样品配制正常入血清0.3ml，加入样品稀释液1.7ml，轻摇混匀。

3．电泳

（1）将上述制备好的凝胶管分别插入上电泳槽的橡胶塞孔中，高出槽底。

（2）下电泳槽加入10倍稀释的电泳缓冲液，随后放入带凝胶管的上电泳槽。

（3）加样：用微量注射器取样品液加30μl ，沿管壁慢慢加在浓缩胶面上，再用缓冲液沿管壁缓慢加在样品液上（防止与样品液混合稀释），直到加满玻璃管，在电泳槽先加入少量缓冲液，检查一下是否漏水，如不漏水，加入适量缓冲液，然后将带电极的盖放好。

（4）电冰：将上层电极糟的电极接在电泳仪的负极、下层电极糟的电极接在电泳仪的正极、接好电源。调节电流为lmA /管。待示踪剂进入分离胶时，调节电流为3mA/管。当示踪剂移至距玻璃管下口时，停止电泳。

4．剥胶取下凝胶管，用带有10cm 长针头的注射器，内装蒸馏水做润滑剂，沿管壁插入管内，边注入水边旋转玻璃管。直至胶柱与管壁分开。然后用吸耳球轻轻在胶管的一端加压，使凝胶从玻璃管中缓慢滑出。

5．固定将胶柱移入12.5%的三氯乙酸溶液中，固定10min。向装有凝胶柱的试管中加入染色液，

6.染色与脱色将固定后的凝胶柱移入染色液， 60℃水浴中染色10～20min，随后移入脱色液中，60℃脱色30～60min。

7.保存将脱色后的凝胶柱移入7%冰乙酸溶液中，密封保存，观察结果, 记录血清蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳可分多少区带。

【注意事项】

1．Acr和Bis都是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用、但在形成凝胶后则无毒，操作时应尽量避免接触皮肤，并注意洗手。

2．蛋白加样量要合适。加样量太少，条带不清晰；加样量太多则泳道超载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。

3．过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10%过硫酸铵必须现用现配，4℃冰箱贮存不超过48h。

4.灌制凝胶时，应避免产生汽泡，因为汽泡会影响电泳分离效果。

5.刚灌注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加1～2cm高的水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶的胶面。

1、先过滤。制药厂生产下来的废醋酸，会有一些其他不可溶性的杂质，要先除去；

2、用苯萃取，取上层液体加热蒸馏。加热到80.1℃左右时馏分为苯，可再利用；继续加热，蒸出水份，再加热，把温度控制在117.9℃——118℃左右，所得馏分即为醋酸；

3、加活性炭或焦炭吸附色素，加入适量的氯化钙吸收所含的少量水份，过滤即得较纯净的醋酸。

微生物学实验室常用试剂与培养基

第一节 常用试剂及其使用方法

一、诊断用纸片

⑴ 杆菌肽纸片（0.04U/片）：抑菌圈>10mm为敏感。质控菌株: D群链球菌阴性, A群链球菌阳性。

⑵ SMZ纸片（1.25μg/片、23.75μg/片）：出现抑菌圈即为敏感。质控菌株：D群链球菌阳性， A群链球菌阴性。

⑶ 新生霉素纸片（5.0μg/片）：抑菌圈≥16mm为敏感。质控菌株：表皮葡萄球菌阳性，腐生葡萄球菌阴性。

⑷ O129纸片、奥普托欣（Optochin）纸片：参见第五节《生化试验培养基》。

二、诊断用血清

1.沙门菌属诊断血清

⑴ A-F群O多价诊断血清。

⑵ 特异O群因子诊断血清：常用的有O2，O4，O7，O9，O10诊断血清。

⑶ 特异H因子诊断血清 常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子诊断血清。

2.志贺菌属诊断血清

志贺菌属4种多价血清：痢疾志贺菌Ⅰ、Ⅱ血清，福氏志贺菌多价血清及分型血清（1～6型），宋内志贺菌诊断血清，鲍氏志贺菌多价血清及分型血清。

3.致病性大肠埃希菌诊断血清

肠致病性大肠埃希菌（EPEC）诊断血清，产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）诊断血清，肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）诊断血清，肠出血性大肠埃希菌（EHEC）诊断血清O157： H 7。

4.霍乱弧菌O1、O139混合多价诊断血清及稻叶、小川、彦岛O139分型血清

5.脑膜炎奈瑟菌多价血清及分群血清

6.链球菌分类诊断血清

7.肺炎链球菌诊断血清

8.耶尔森菌诊断血清

三、常用染色液

1.革兰染色液

⑴ 结晶紫溶液 A液：结晶紫 20g，95%乙醇20 ml； B液：草酸铵 0.8g， 蒸馏水80 ml。

染色前24h将A液、 B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。

⑵ 碘液:碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。

将碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升蒸馏水, 使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至碘、碘化钾完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。

⑶ 脱色液：95%乙醇

⑷ 复染液：沙黄2.5g，95%乙醇100ml为贮存液，取贮存液10ml，加蒸馏水90ml为应用液。

2.抗酸染色液

⑴ 碱性复红染色液： ①萋纳石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和溶液10ml，5%石炭酸溶液90ml。 ②脱色液：浓盐酸3ml，95%乙醇97ml。③复染液(吕弗勒美蓝液)：美蓝乙醇饱和溶液30ml，100g/L氢氧化钾溶液0.1ml，蒸馏水100ml。

⑵ 金胺O-罗丹明B染色液： ①罗丹明B液：罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml。②1g/L金胺O液：金胺O液0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸 5ml,混匀。③3%盐酸乙醇。④稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液100ml,加蒸馏水90ml,混匀。

3.鞭毛染色液(改良Ryu法)

A液：5%石炭酸10ml，鞣酸2g，饱和硫酸铝钾溶液 10ml； B液：结晶紫乙醇饱和液。应用液A液10份,B液1份,混合,室温存放备用。

4.异染颗粒染色液

甲液：甲苯胺蓝 0.15g，孔雀绿2g/L， 95% 乙醇2.0ml，蒸馏水100ml。乙液：碘 2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml。

先将碘化钾加入少许蒸馏水(约2ml),充分振摇,待完全溶解,再加入碘,使完全溶解后, 加蒸馏水至300ml。

5.荚膜染色液

⑴ 印度墨汁或50g/L黑色素水溶液

⑵ 5g/L苯胺蓝水溶液。

第二节 基础培养基

一、液体基础培养基

1.蛋白胨水

[用途]

用于细菌靛基质试验；一般细菌培养和传代。

[配法]

蛋白胨（或胰蛋白胨）10g，氯化钠 5g，蒸馏水1L。

将上述成分溶于水中，校正pH 至7.2,分装试管，每管2~3ml，置121℃灭菌15min备用。

[质量控制]

大肠埃希菌生长良好，靛基质阳性；伤寒沙门菌生长良好，靛基质阴性。

2.营养肉汤

[用途]

一般细菌的增菌培养，加入1%的琼脂粉亦可作营养琼脂。

[配法]

蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L。

将上述成分称量混合溶解于水中，校正pH至7.4，按用途不同分装于烧瓶或试管内。经121℃灭菌15min，作无菌试验后冷藏备用。

[质量控制]

金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、化脓性链球菌生长良好。

[保存]

置冰箱3周内用完。

3.牛肉浸液培养基

[用途]

细菌培养最基础的培养基，除用于一般细菌的培养外，又可以作营养琼脂及其它培养基的基础。

[配法]

新鲜除脂牛肉 500g，氯化钠5g

蛋白胨10g，蒸馏水1L。

先将牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切块绞碎。称取500g置容器加入蒸馏水1L，搅匀后置冰箱过夜，次日煮沸加热30min，并用玻棒不时搅拌用绒布或麻布进行粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。在过滤中加入蛋白胨10g、氯化钠5g溶解后，用氢氧化钠溶液校正pH至7.6~7.8，并加热煮沸10min，补充蒸馏水至1L，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，经121℃15min灭菌备用。

[用法]

根据用途不同可以制成营养肉汤，以此为基础制成其它培养基。如制作固体培养基，加入琼脂15 ~20g/L即可。

[质量控制]

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌等均生长良好。

[保存]

置4℃冰箱内可以使用较长时间。

注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量为3～5g/L。

二、固体基础培养基

1.营养琼脂

[用途]

一般细菌和菌株的纯化及传种。[配法]

蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂粉（优质）12g，蒸馏水1L。

将上述成分(除琼脂外)溶于水中，校正pH 7.2～7.4后加入琼脂，煮沸溶解，根据用途不同进行分装，经121℃灭菌15min，倾注平板或制成斜面，冷藏备用。

[质量控制]

金黄色葡萄球菌菌落呈浅黄色； 痢疾志贺菌菌落无色；铜绿假单胞菌 菌落无色或浅绿色。

[保存]

置4℃冰箱保存，2周内用完。

2.血琼脂培养基

[用途]

一般病原菌的分离培养和溶血性鉴别及保存菌种。

[配法]

pH 7.4~7.6牛肉浸液琼脂 100ml，脱纤维羊血(或兔血) 5~10ml。

将血琼脂基础经121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右以无菌手续加入羊血，摇匀后立即倾注灭菌平皿内，待凝固后，经无菌实验冷藏备用。

[质量控制]

化脓性链球菌ATCC 19615生长良好，β-溶血；肺炎链球菌ATCC 6303生长良好，α-溶血；表皮葡萄球菌ATCC 12228 生长良好,不溶血。

[保存]

置4℃冰箱，1周内用完。

3.巧克力琼脂培养基

[用途]

主要用于嗜血杆菌的分离培养，亦可用于奈瑟菌的增殖培养。

[配法]

鲜牛肉浸出液1L， 蛋白胨10g,

氯化钠5g，琼脂粉12g，无菌脱纤维

羊血或兔血100ml。

将上述成分（除兔血外）加热溶解，调pH至7.2，置121℃15min高压灭菌，待冷至约85℃，以无菌方式加入兔血，摇匀后置85℃水浴中，维持该温度10min，使之成巧克力色。取出置室温冷至约50℃，倾注平板或制成斜面备用。

[质量控制]

流感嗜血杆菌ATCC 10211、肺炎链球菌ATCC 6305生长良好，菌落典型。

[保存]

置4℃冰箱，1周内用完。

4.胱氨酸胰化酪蛋白琼脂

[用途]

常用于测定脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及营养要求较高细菌的糖发酵试验。

[配法]

胱氨酸0.5g, 胰化酪蛋白20g,氯化钠5g，亚硫酸钠0.3g，琼脂3.5g，酚红0.0175g，蒸馏水1L。

将上述成分（酚红除外）混合溶解，调pH至7.2，加入酚红指示剂。分装试管，115℃灭菌15min。

[用法]

用于测定糖发酵时，按需要加入各种糖溶液，将待检标本直接种于培养基管内，置35℃孵箱，18~24h观察结果。培养基由红色变为黄色为阳性，不变色为阴性。

第三节 保存和增菌培养基

一、菌种保存培养基

[配法]

蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠3g，磷酸氢二钠2g，琼脂粉4.5g，蒸馏水1L 。

将上述成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.4~7.6，分装试管2/3左右高度，121℃高压灭菌15min，成为半固体培养基，备用。

[质量控制]

培养基呈淡黄色半固体状。大肠埃希菌(ATCC 25922)生长良好,动力阳性；福氏志贺菌(ATCC 12022)生长良好,动力阴性；金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)生长良好,动力阴性。

二、增菌培养基

1.葡萄糖肉汤

[用途]

用于血液增菌。

[配法]

蛋白胨(或月示 胨)10g，氯化钠5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖3g，枸橼酸钠3g，5g/L对氨基苯甲酸水溶液10ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml，青霉素酶1000 U。

将蛋白胨、氯化钠混合于肉浸液中加热溶解，再加入葡萄糖、枸橼酸钠、对氨苯甲酸及硫酸镁，继续煮沸5min，并补足失水，调整pH至7.8。

过滤分装，每瓶50ml，高压灭菌115℃20min后，每瓶加入青霉素酶50 U，经无菌试验合格后，冷却备用。

[用法]

将采取的血液标本，以无菌手续注入培养瓶中（血液1ml，培养液10ml），置35℃培养箱内，每天1次取出观察结果。如有细菌生长，可出现数种不同的表现，应随时作分离培养，可选用血琼脂、伊红美蓝琼脂及巧克力琼脂平板等。无细菌生长表现的培养瓶，需连续观察7d，仍无细菌生长方可弃去。在观察的过程中，至少应作两次分离培养。

注:

⑴ 枸橼酸钠为抗凝剂，可使血液加入培养基中不凝固。

⑵ 对氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺类药物的抑菌作用。

⑶ 硫酸镁主要抑制血液中存在的四环素、金霉素、新霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用。

⑷ 本培养基近年来有许多改良配方，如加入0.3%～0.5%酵母浸膏以增加营养；加0.2%核酸刺激细菌生长；加0.1%粘液素能被覆于细菌的表面，保护细菌免受抗体破坏；加入聚茴香脑磺酸钠（SPS）能中和补体的抗药作用从而提高检出率。

2.血液增菌培养基

[用途]

血液和骨髓液病原菌的增菌培养。

[配法]

蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏粉3g，枸橼酸钠3g，磷酸氢二钾2g，5g/L对氨基苯甲酸溶液5ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml， 4g/L酚红溶液6ml，青霉素酶50 U，聚茴香脑磺酸钠(SPS) 0.3g，蒸馏水1L。

将上述成分（除酚红指示剂、青霉素酶外）混合加热溶解，校正pH至7.4，再加酚红，过滤分装每瓶30～50ml，经121℃灭菌15min和35℃24h无菌试验备用。临用时每瓶加入1.5～2.5 U青霉素酶。

[质量控制]

伤寒沙门菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化脓性链球菌ATCC 19615、肺炎链球菌ATCC 6305、金黄色葡萄菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27853均生长良好。

3.亚硒酸盐增菌培养基

[用途]

沙门菌增菌培养。

[配法]

蛋白胨5g，乳糖4g，磷酸氢二钠4.5g，磷酸二氢钠5.5g，亚硒酸氢钠4g，蒸馏水1L。

先将亚硒酸盐加到200ml蒸馏水中，充分摇匀溶解。其它成分称量混合，加入蒸馏水800ml，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH 7.0~7.1(通过调整磷酸盐缓冲对的比例来校正pH值)。最后分装于15×150mm的试管内，每管10ml。置水浴隔水煮沸10~15min，立即冷却，置4℃冰箱保存备用。

[用法]

取新鲜标本1g或棉拭子采样直接种于该培养管内。摇动后置35℃培养过夜。如发现均匀混浊，管底有红色沉淀物，表示细菌生长。然后取培养物分离在选择性培养基上，如SS琼脂、麦康凯琼脂平板等，进行培养。

[质量控制]

培养基应呈淡黄色或无色，透明无沉淀物。增菌灵敏度：伤寒沙门菌1×10-5，鼠伤寒及副伤寒沙门菌1×10-7。

[保存]

4℃保存，1周内用完。

注：

⑴ 亚硒酸盐，包括亚硒酸钠、亚硒酸氢钠均可使用，但以亚硒酸氢钠效果为好。

⑵ 磷酸盐缓冲对中，两者的用量比例与亚硒酸盐及蛋白胨的品种有关。制备前应进行调试，其总量为10g/L。

⑶ 在制备过程中，亚硒酸盐不能直接加热。隔水煮沸时间亦不能超过规定时间，否则亚硒酸盐会变质，生成红色沉淀物。

⑷ 培养基应呈淡黄色，有红色沉淀物出现时不可再用。

4.SS增菌液

[用途]

用于沙门、志贺菌的增菌。

[配法]

月示 胨 2g，蛋白胨8g，牛肉膏3.5g，酵母膏2g，葡萄糖2g，枸橼酸铁10g，硫代硫酸钠10g，亚硫酸钠0.7g，胆盐5.5g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0.1g，去氧胆酸钠(进口) 1.5g，煌绿0.005g，蒸馏水1L。

将上述成分加热溶于水中，调pH至7.1，分装试管（15×150mm），每管5~7ml，隔水煮沸5min备用。

[用法]

取粪便标本1g直接种于增菌液内，35℃16~18h培养，取出转种于分离培养基即可。

[质量控制]

培养基应呈淡黄色或略呈淡绿色。伤寒沙门菌ATCC 50096、福氏志贺菌ATCC 12022 生长良好；大肠埃希菌ATCC 25922 生长抑制。

注：

⑴ 切勿高压，隔水煮沸时间不超过5min。

⑵ 煌绿用量应根据不同产品批号酌情增减。

5.碱性蛋白胨水

[用途]

霍乱弧菌增菌培养。

[配法]

蛋白胨 20g，氯化钠5g，蒸馏水100ml。

将上述成分溶解于水中,校正pH 至8.6，分装于试管8~10ml，经121℃灭菌15min备用。

[用法]

将待检标本接种到碱性胨水中，置35℃培养6~8h，霍乱弧菌呈均匀混浊生长，表面有菌膜出现。取表面菌液一白金环移种到碱性琼脂、庆大琼脂或TCBS琼脂平板上。必要时做第二次增菌。

[质量控制]

有条件的实验室可用标准菌株，一般临床实验室可用非01群弧菌，培养后生长良好者方可使用。霍乱弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌生长良好（6h）；大肠埃希菌ATCC 25922不生长（6h）。

[保存]

置4℃冰箱，2周内用完。

注：若在每升碱性胨水中加入1%亚碲酸钾溶液0.5~1.0 ml，则成为亚碲酸钾碱性胨水，其增菌效果更为理想。

第四节 分离培养基

一、革兰阳性杆菌分离培养基

1.罗-琴改良培养基

[用途]

用于结核分枝杆菌培养。

[配法]

磷酸二氢钾2.4g，硫酸镁0.24g，枸橼酸镁(或枸橼酸钠) 0.6g，天门冬素3.6g，甘油12ml，蒸馏水600ml，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1L，2%孔雀绿水溶液20ml。

先将磷酸盐、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素及甘油，加热溶解于600ml蒸馏水中。再添放马铃薯粉，边放边搅，并继续置沸水中加热30min，待冷却至60℃左右时，加入鸡卵液1L及孔雀绿溶液20ml，充分混匀后，用无菌操作分装于灭菌试管，每支5~6ml，塞紧橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器内制成斜面，经85℃1h间歇灭菌2次(或高压灭菌115℃20min)，待凝固后经无菌试验，4℃冷藏备用。

[用法]

取晨咳痰或其它体液标本，经消化处理和离心沉淀的浓缩液0.1ml（约2滴）滴种于培养基的斜面上，尽量摇晃，置35℃5%~10%二氧化碳温箱内培养1~4周，观察结果。凡在1周内发现生长的菌落，一般不可能是结核分枝杆菌；在2周后生长的菌落，奶油状，略呈黄色，粗糙突起，不透明，即取菌进行涂片染色镜检及鉴定。

[质量控制]

用结核分枝杆菌菌株作阳性培养试验。

[保存]

置4℃冰箱内2~4周有效。

注：

⑴ 本培养基由Lowenstein-Jenden设计的基础上改良。

（2）本培养基pH约为6.0左右，一般无须校正。

（3）间歇灭菌的温度不宜超过90℃。

2.血清斜面培养基(吕氏血清斜面)

[用途]

用于白喉棒状杆菌培养。

[配法]

1%葡萄糖肉汤(pH 7.6)100ml，无菌动物血清(牛、羊、猪、兔) 300ml。

将上述成分混合后，分装于试管内，每管约4~5ml。斜插在血清凝固器内（或蒸笼）加热80~85℃30min，使血清凝固成斜面，冷却后放4℃冰箱内。取出后采用间歇灭菌法，85℃灭菌30min，连续3天，经无菌试验证明无杂菌生长即可应用。

微生物学实验室常用试剂与培养基 第一节 常用试剂及其使用方法 分类:默认栏目2006.2.21 20:54 作者：hbmzhsh | 评论：2 | 阅读：1037

微生物学实验室常用试剂与培养基

第一节 常用试剂及其使用方法

一、诊断用纸片

⑴ 杆菌肽纸片（0.04U/片）：抑菌圈>10mm为敏感。质控菌株: D群链球菌阴性, A群链球菌阳性。

⑵ SMZ纸片（1.25μg/片、23.75μg/片）：出现抑菌圈即为敏感。质控菌株：D群链球菌阳性， A群链球菌阴性。

⑶ 新生霉素纸片（5.0μg/片）：抑菌圈≥16mm为敏感。质控菌株：表皮葡萄球菌阳性，腐生葡萄球菌阴性。

⑷ O129纸片、奥普托欣（Optochin）纸片：参见第五节《生化试验培养基》。

二、诊断用血清

1.沙门菌属诊断血清

⑴ A-F群O多价诊断血清。

⑵ 特异O群因子诊断血清：常用的有O2，O4，O7，O9，O10诊断血清。

⑶ 特异H因子诊断血清 常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子诊断血清。

2.志贺菌属诊断血清

志贺菌属4种多价血清：痢疾志贺菌Ⅰ、Ⅱ血清，福氏志贺菌多价血清及分型血清（1～6型），宋内志贺菌诊断血清，鲍氏志贺菌多价血清及分型血清。

3.致病性大肠埃希菌诊断血清

肠致病性大肠埃希菌（EPEC）诊断血清，产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）诊断血清，肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）诊断血清，肠出血性大肠埃希菌（EHEC）诊断血清O157： H 7。

4.霍乱弧菌O1、O139混合多价诊断血清及稻叶、小川、彦岛O139分型血清

5.脑膜炎奈瑟菌多价血清及分群血清

6.链球菌分类诊断血清

7.肺炎链球菌诊断血清

8.耶尔森菌诊断血清

三、常用染色液

1.革兰染色液

⑴ 结晶紫溶液 A液：结晶紫 20g，95%乙醇20 ml； B液：草酸铵 0.8g， 蒸馏水80 ml。

染色前24h将A液、 B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。

⑵ 碘液:碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。

将碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升蒸馏水, 使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至碘、碘化钾完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。

⑶ 脱色液：95%乙醇

⑷ 复染液：沙黄2.5g，95%乙醇100ml为贮存液，取贮存液10ml，加蒸馏水90ml为应用液。

2.抗酸染色液

⑴ 碱性复红染色液： ①萋纳石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和溶液10ml，5%石炭酸溶液90ml。 ②脱色液：浓盐酸3ml，95%乙醇97ml。③复染液(吕弗勒美蓝液)：美蓝乙醇饱和溶液30ml，100g/L氢氧化钾溶液0.1ml，蒸馏水100ml。

⑵ 金胺O-罗丹明B染色液： ①罗丹明B液：罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml。②1g/L金胺O液：金胺O液0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸 5ml,混匀。③3%盐酸乙醇。④稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液100ml,加蒸馏水90ml,混匀。

3.鞭毛染色液(改良Ryu法)

A液：5%石炭酸10ml，鞣酸2g，饱和硫酸铝钾溶液 10ml； B液：结晶紫乙醇饱和液。应用液A液10份,B液1份,混合,室温存放备用。

4.异染颗粒染色液

甲液：甲苯胺蓝 0.15g，孔雀绿2g/L， 95% 乙醇2.0ml，蒸馏水100ml。乙液：碘 2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml。

先将碘化钾加入少许蒸馏水(约2ml),充分振摇,待完全溶解,再加入碘,使完全溶解后, 加蒸馏水至300ml。

5.荚膜染色液

⑴ 印度墨汁或50g/L黑色素水溶液

⑵ 5g/L苯胺蓝水溶液。