硫酸盐还原菌杀灭方法

硫酸盐还原菌 (Sulfate-Reducing Bacteria，简称SRB) 是一种厌氧的微生物。广泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油气井等缺氧环境中。

据不完全统计，S R B 目前已有1 2 个属4 0 多个种 ，S R B 的分类学研究进展比较缓慢。目前已知的S R B 从生理学上分为两大亚类

Ⅰ类

如脱硫弧菌属、脱硫单胞菌属、脱硫叶菌属和脱硫肠状菌属，其特点是可利用乳酸、丙酮酸、乙醇或某些脂肪酸为碳源及能源，将硫酸盐还原为硫化氢；

Ⅱ类

如脱硫菌属、脱硫球菌属、脱硫八叠球菌属和脱硫线菌属，它们的特别之处是可以氧化脂肪酸，并将硫酸盐还原为硫。现在，随着研究的进展，陆续又有一些新的种属被命名。

1、成分：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL，pH7.2~7.5。

2、制法：加热溶解，调pH值，分装于三角瓶中121℃，20min高压灭菌。硫酸盐还原菌是一种厌氧微生物，生存在土壤、海水、油气井等缺氧并富含水分的环境中，会把硫酸盐还原成硫化氢。

虽然从理论上讲，SRB为严格的厌氧菌，但随着研究的深入，已有研究结果表明SRB并非严格意义上的绝对厌氧，而是兼性厌氧。

但总体上来说，SRB对氧还是极其敏感的，因此对其培养与分离关键要采用严格的厌氧技术培养SRB不仅仅要求周围生长的环境是无氧的，还有培养基中氧化还原电位必须在-100mV以下。

所以通常在培养基中加入一些强还原剂，如巯基乙醇、抗坏血酸、L2半胱氨酸盐酸盐，这些物质受热容易分解，所以要采用过滤除菌的方法单独灭菌 ⑴中温型：30-40 ℃ 之 间

⑵高温型：55-60 ℃ 之 间 ⑴稀释摇管法

稀释摇管法是稀释倒平板法的一种变通形式，先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化并保持在50℃左右，将已稀释成不同梯度的菌液加入到这些已熔化好的琼脂试管中，迅速充分混匀。待凝后,在琼脂柱表面倒一层灭菌的液体石蜡和固体石蜡的混合物，使培养基尽量隔绝空气。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。

困难之处在于菌落的挑取，首先需用一只灭菌针将覆盖的石蜡盖取出，然后再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，放在培养皿中，最后用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察并转移菌落。

该法的不足之处是观察与挑取菌落比较困难，但在缺乏专业设备的条件下，此法仍是一种方便有效地进行厌氧微生物分离、纯化和培养的低成该方法

⑵叠皿夹层法

叠皿夹层法实质是将菌夹在上下两层培养基之间，使其造成一个相对无氧的环境，从而使SRB能在夹缝中生长。

具体做法是将已经富集好的菌液采用无菌操作技术稀释成不同浓度。将含有质量分数为2%琼脂的固体培养基熔化并保持在50℃左右，在无菌条件下，向培养皿（90mm×15mm）的皿盖中倒入约1/3高度的固体培养基，待其刚刚冷凝后，将不同浓度的稀释液吸取适量，快速涂布平板上，使稀释液渗透约30s后，在培养皿的中间位置倒入同种营养型固体培养基，直到将溢未溢的突起状态，随后迅速盖上皿盖并往下压，最终皿内不能有气泡。

去掉培养皿内外两层侧壁间多余的琼脂，并在其中灌入适量熔化的石蜡，使培养皿侧壁缝隙被石蜡密封，尽量不要留有气泡。培养一周后，在加有二价铁离子的平板中会长出黑色的SRB菌落，在酒精灯旁加热使固体石蜡熔化，由于上下两层培养基凝固时间不同，所以当移去内皿后，用镊子很容易将上层培养基揭起，从而露出下层培养基的菌落。当需要进行菌落挑取时,可以对其进行切块转移，放入液体培养基时捣碎即可。

该方法的优点是培养物均采用涂布或划线生长于营养琼脂夹层中，取菌落时可很方便地做到定点取菌，同时该方法不需要另外创建一个无氧环境，故省时、省力，具备了所有好氧、厌氧分离方法的优点。

⑶Hungate滚管技术

Hungate滚管技术是培养厌氧菌最佳的方法。滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术。目前国内外很多专门做厌氧培养的实验室大都采用此技术。

Hungate滚管技术是指将适当稀释度的菌液，在无菌无氧条件下接入含有琼脂培养基的厌氧试管中，然后将其在滚管机或冰盘上均匀滚动，使含菌培养基均匀地凝固在试管内壁上。当琼脂绕管壁完全凝固后，琼脂试管即可垂直放置贮存，并可使少量的水分集中在底部，经过几天的培养后，就可见到厌氧管内固体培养基内部和表面有菌落出现。挑取菌落时也很方便，可以在酒精灯旁用自制的玻璃细管接种针挑取生长状态良好的菌落，快速接到液体培养基中富集培养。

Hungate滚管技术的优点在于，培养基可以在厌氧管内壁上形成一层均匀透明的薄层，同时菌落可以埋藏在培养基内部或生长在表面，同平板涂布法相比，与氧气接触的机会大大减少。