苯酚-硫酸法的操作

淀粉、纤维素的构成单位是葡萄糖，但植物多糖的话，种类就很多了，构成的单元也很多，多种单糖---果糖、半乳糖、木糖、甘露糖等等都可以作为构成单位。比如银耳多糖、香菇多糖，成分极为复杂。

苯酚硫酸法师利用糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物。在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。

此时，对于杂聚多糖，只用葡萄糖溶液做标准曲线，是不准的。有时用多种单糖标准品作标准曲线，但不同单糖标准品在相同浓度下其吸收值相差较大（葡萄糖显色最大），分别制作标准曲线对杂多糖测定的结果也就不同。因此，苯酚硫酸法对于成分复杂的多糖来说，只能是一个参考。

对杂多糖往往不用单一的苯酚硫酸法。比如，采用气相色谱法对杂多糖的组成进行分析，再配合苯酚硫酸法可以得到更可靠的结果，比单用苯酚 硫酸法更可靠、准确。

DNS 法为在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

浓硫酸：分析纯,95.5%

B、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。C、

6%苯酚：临用前以80%苯酚配制.（每次测定均需现配）D、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。E、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。F、

5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。G、

6mol/L

氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。H、6mol/L

盐酸。⑥酚要4℃冰箱保存，拿出来到室温后用，加浓硫酸后一定要摇匀，水浴温度和时间尽量一致，冷水冲凉的时间也尽量一致，试样温度不一样对吸光度也有影响，还有可以的话样品和标曲同时做，误差就小了。

2、原因如下：

苯酚硫酸法测定多糖原理是：多糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg/ml范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收，因而可用比色法在此波长下测定。而上述反应过程不受蛋白质影响。

3、补充：

苯酚-硫酸比色法是Dubois M等在1951年提出并建立的一种用于多糖含量测定的方法，也被称为苯酚-硫酸分光光度法或苯酚-硫酸法，其应用广泛。具体方法是待测定多糖样品液1

mL，加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀后迅速加入浓硫酸5mL，再次迅速摇匀，然后置沸水浴加热30min，冷水迅速冷却至室温，按分光光度法在490nm波长处测定吸光度值。该法操作简便，快捷灵敏，且不需贵重仪器，但准确性和重现性受实验条件影响较大，其原理是利用多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，进而和苯酚缩合成有色化合物，在490nm处进行比色测定。

苯酚硫酸法测多糖。

是将多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖。

单糖中再加入苯酚反应（在强酸条件下）生成橙色衍生物。

在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。

若要一起加入，先配成溶液的话。要先将苯酚溶于（温）水，然后将浓硫酸绶绶倒入。切不可将溶液注入水中。

在单因素试验基础上,选择对多糖含量测定结果产生显著影响的4个显色因素:6％苯酚用量、浓硫酸用量、反应温度、水浴显色时间进行正交试验,获得传统苯酚-硫酸法测定多糖含量的最佳显色条件是1 mL 6％苯酚溶液、7 mL浓硫酸、4℃反应温度、30 min水浴显色.改进后的多糖含量测定的显色条件即按照1:7的比例直接配制苯酚-硫酸显色液,在4℃条件下加入样品溶液,在90℃水浴进行30 min显色后,于490 nm处测定吸光度,计算多糖含量.通过传统最佳显色方法的验证试验和改进后的显色方法测定多糖含量的结果比较,表明改进后的方法具有操作简便、精密度高、准确度高、实用性强的优势.