2巯基乙醇的作用是什么

文献信息：

Abe, T., et al. (2017). "Germ-Cell-Specific Inflammasome Component NLRP14 Negatively Regulates Cytosolic Nucleic Acid Sensing to Promote Fertilization." Immunity 46 (4): 621-634.

先看一下图中的缩写：

IP全称是immunoprecipitation，即免疫沉淀，这一步主要是为了纯化目的蛋白。

IB全称是immunoblotting，即免疫印迹，也就是常规的Western Blotting，用于显示目的蛋白。

WCL全称是whole cell lysates，即整个细胞的裂解成分。

HC全称是heavy chain，即重链，

LC全称是light chain，即轻链。

将图分为三部分，先看第一部分，即上面的部分，“+”表示含有这种蛋白，“-”表示没有，这个实验一共做了四组，从左到右分别为：①只表达HA-cGAS的293T细胞；②共同表达HA-cGAS与NRLP14-FL的293T细胞；③只表达STING-HA的293T细胞；④共同表达STING-HA与与NRLP14-FL的293T细胞，如下所示：

再看第二部分WB的图，WB的图就是使用含有FLAG抗体的珠子拉下来的蛋白做的，使用拉下来的这些蛋白再做WB，它的原理前面已经描述过了。使用FLAG抗体的珠子拉下来的蛋白使用HA抗体来进行检测，其结果如下：

从上面的图像可以看出以下信息：

第一， HC与LC条带都非常明显，之所以出现这个条件是因为，在WB之前进行的蛋白变性这一步，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇，巯基乙醇会把抗体的重链和轻链之间的二硫键破坏，从而使的抗体变成重链分子55KD和轻链分子25KD，因此会在结果中呈现两个条带。

第二， 第一组（只表达HA-cGAS的293T细胞）中没有条带，第二组（共同表达HA-cGAS与NRLP14-FL的293T细胞）没有条带，第三组（只表达STING-HA的293T细胞）有一点点条带，第四组（共同表达STING-HA与与NRLP14-FL的293T细胞）条带明显，这说明NLRP14与STING有相互作用，为什么说有相互作用呢？因为我们是用FLAG抗体来拉的蛋白，从理论上讲，我们只能拉下FLAG标记的NLRP14，也就是NLRP14-FL（FL就是FLAG），但是，从拉下的蛋白中用HA进行检测，居然检测出来了HA标记的STING，这就说明，使用FLAG拉NLRP14-FL时，这个蛋白复合物中含有STING-HA。

再看图的第三部分，也就是下面的这一部分，是用FLAG抗体和HA抗体来进行检测整个细胞的裂解液，是作为阳性对照（有的文献中会标明input组），如下所示：

其中右侧的WCL表示的是整个细胞的裂解液，也就是还没有使用FLAG抗体的珠子去拉的时候的样本，也就是说直接裂解了293T细胞后的样本，从这个结果中可以得到以下信息：

第一， 在使用FLAG抗体进行检测全蛋白时，相当于阳性对照。第一组（只表达HA-cGAS的293T细胞）中没有条带，因为这种293T细胞中只有HA标记的cGAS，第二组（共同表达HA-cGAS与NLRP14-FL的293T细胞）有条带，因为FLAG抗体能检测出使用了FLAG标记的NLRP14，NLRP14的蛋白分子量大概是125kD，第三组（只表达STING-HA的293T细胞）没有条带，因此这种293T细胞只表达HA标记的STING；第四组（共同表达STING-HA与与NLRP14-FL的293T细胞）条带明显，因为这个细胞中含有FLAG标记的NLRP14。

第二， 使用HA抗体检测全蛋白，这是阳性对照，是说明细胞中含有相应的蛋白。我们可以发现，第一组（只表达HA-cGAS的293T细胞）在27kD附近没有条件，在50kD部分有条带，这说明，全蛋白中含有HA标记的cGAS（cGAS的蛋白分子量是62kD，多数蛋白标签的分子量很少，基本可以忽略），做这个实验主要是作为阳性对照；第二组（共同表达HA-cGAS与NLRP14-FL的293T细胞）在37kD附近没有条带，在50kD附近有条带；结合前面的结果来看，就说明这个细胞中含有HA标记的cGAS（因为它的分子量大概是50kD），还含有FALG标记的NLRP14（因为NLRP14的蛋白分子量大概是125kD）；第三组（只表达STING-HA的293T细胞）在37kD处有条带，这说明细胞中含有HA标记的STING（因为STING的分子量大概是35kD）；第四组（共同表达STING-HA与与NLRP14-FL的293T细胞）在110kD处有条带，在37kD处也有条带，这说明这种细胞中含有NLRP14与STING。

从上面的图片可以知道，在做Co-IP实验时。需要设立阳性对照组来证明你的细胞中有某个蛋白A与B，再使用抗蛋白A的抗体来拉A蛋白，再使用抗蛋白B的抗体来检测拉下来的蛋白，如果检测到了蛋白B，就说明蛋白A与蛋白B有相互作用。

如需编辑回答或插入图片，请点击标题到问题详情页1. 所含试剂：

（1）胍盐：a.盐酸胍；b. 异硫氰酸胍；

作用：强烈的蛋白质变性剂；

（2）重蒸酚

★区别于饱和酚

重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂)，并用等体积的0.5mol/L Tris-Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris-Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，主要用于DNA的抽提。

因为苯酚是酸性的，酸性条件（pH<7）下DNA会分配于有机相，故不能用重蒸酚。本实验中Trizol溶液pH<7，故要使用重蒸酚。适合RNA的抽提。

作用：有机溶剂；蛋白质变性剂；

个人觉得不要自己配了还是买trizol 试剂盒吧，自己配的麻烦还不容易操作。

Trizol可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，同时使RNA酶变性失活，保护RNA的完整性。Trizol的主要成分为异硫氰酸胍、酚和B-巯基乙醇，异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

提取中加入氯仿，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层，上层为水相，PH 5.1左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚与溶液的界面。加入异丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除杂质。

判断RNA 的质量主要有两个标准，一是完整性（是否被降解），二是纯度。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现28S、18S和5S rRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。

完整性的图片大致如下图所示：

RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm，所以 280nm常用来表示蛋白质吸光度；而260nm为DNA的吸光度。

理论上， 纯的RNA情况下：OD260/OD280的值为2，纯的DNA情况下：OD260/OD280的值为1.8.

OD260反映的是溶液中核酸的浓度，OD280反映的是溶液中蛋白质或者氨基酸的浓度。

样品中如果含有蛋白质及苯酚，A 260 /A 280 比值会明显下降。对于纯的样品只要读出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA，或者40微克/ml 单链DNA（RNA），或者20微克/ml 寡核苷酸计算。

OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，纯度已经很高了。

纯DNA：OD 260 /OD 280 ≈1.8(>1.9，表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.9 <OD 260 /OD 280 <2.0（2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

提取前需要准备：

75%的乙醇（提前于-20冰箱保存）、氯仿、RNAase-free water、1.5ml Eppendorf离心管、Tips（RNAase-free）。

需要特别注意的是 一定要带好手套和口罩，做好个人防护工作！！！并且也可以防止RNA降解

步骤：

（1） 培养细胞： 收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

（2） 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入0.8~1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。

（3）按200ul氯仿/ ml Trizol的量加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。注：剧烈震荡使基因组DNA断裂。

（4）4℃离心，12000rpm，15min。注：离心后分为三层，下层为红色的苯酚—氯仿层，中间层和上层的水样层，RNA存在于水样层中。若只提RNA，千万不要吸取中间层和下层酚—酚相，可保存于4℃冰箱。

（5）将上层水相转移至另一个EP管中，加入等体积的异丙醇并混匀(约500ul)，室温放置10min或者-20冰箱沉淀2h，也可以-20冰箱沉淀过夜。

（6）4℃离心，12000 rpm，10min，用枪头小心吸走液体，RNA沉于管底。

（7）用0.5ml 75%冰乙醇洗涤RNA沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

（8）4℃离心，8,000rpm，5min。重复两次。弃去乙醇后，室温干燥RNA沉淀5-10min。

（9）可用50ul H2O溶解RNA样品，55-60℃ 溶解5-10min，保存于-80℃。

所得RNA可以继续用于下游实验。

蛋白质电泳前，需用样品缓冲液处理，样品缓冲液中除SDS外，还有还原剂β-巯基乙醇，它可将蛋白质分子中的S-S（二硫键）还原。电泳样品制备时加热，就是为了加速这些组分与蛋白质的反应。

问一下你们试验提取的是不是总蛋白？还是特定的一种蛋白？我想应该是提的总蛋白，那么就应该做到：尽量提取完全；应使所有蛋白全部处于溶解状态；防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性。看看你的目的蛋白的特性，是亲水性的还是疏水性的，再决定留上清还是沉淀，如你的样品是蛋白质沉淀物，加入50--100ul的SDS加样缓冲液并在同样加热后在上样

β巯基乙醇0.3%(v/v)：每100ml中含β巯基乙醇0.3ml0.1%SDS：每100ml的组织裂解液含有0.1克的SDS 不好意思，刚才表述不清楚这个意思我明白v/v你可以写成volume to volumew/v ：weight-volume percentage，percent weight per volume，Weight-in-volume etcEXPLANTATION:v/v2% v/v means that the volume of the substance is 2% of the total volume of the solution or mixturew/van abbreviation for "weight by volume," a slightly confusing phrase used in chemistry and pharmacology to describe the concentration of a substance in a mixture or solution. The weight by volume is the mass (in grams) of the substance dissolved in or mixed with 100 milliliters of solution or mixture. For example, the concentration of fluoride in toothpaste is usually about 0.15% w/v, meaning that there is 0.15 gram of fluoride per 100 milliliters of toothpaste. Thus 1% w/v is equal to 1 gram per deciliter (g/dL) or 10 grams per liter (g/L). 谢谢受教了。 SSR wrote:不好意思，刚才表述不清楚这个意思我明白【求助】关于elsevier的offp【共享】关于投稿时候选择【求助】EHJ100天了【求助】First name和last nam【求助】欲投BBRC但图片大于【求助】毕业的论文是必须【求助】请教＂awaiting rev【转贴】审稿体会：细节决【求助】如何获得清晰得【求助】editor怎么总在换呀【求助】一篇SCI文章可以有【求助】投稿JBJS(Br)图片要【求助】急！