质粒系列之什么是质粒
从2020年开始，我的基因编辑系列都会在我的好友果子老师的公众号上首发，他还会为文章写相应的引言等等。但我会把我的原始手稿放在上备份一次。由于第一年学习考试特别多，就停更了很久，最近应该会恢复更新。上次我写了 解剖式学习一个质粒结构--update 。试图在一篇文章中，快速学习质粒结构。思来想去，学习总不能一蹴而就；另外，在见识到本学院博士生PAC和QE过程中评委提问的内容之细节，顿觉现在要开始准备了（评委们真的会请答辩者描述ZFN、TALEN和CRISPR的区别）。于是打算开启一个质粒系列，希望借此补充个人的背景知识，也同样希望大家不吝赐教。
命名由来 如不踏入生命科学领域，我们对质粒的了解只有高中生物课上所提到的：质粒是处于细胞质内环状的DNA。20世纪40年代和50年代，科学家们致力于研究可以在细胞间转移的遗传因子，其中 Joshua Lederberg 因在基因重组和细菌遗传物质方面的发现获得 1958年诺贝尔生理学或医学奖 。Joshua早在1952年曾为这些 可在细胞间转移的遗传物质 命名为 plasmid ，其由cyto plasm 和拉丁文中的 id (it的意思)组成，意为 染色体外遗传因子的总称 。plasmid曾一度被episome（游离基因）替代，直到后来人们发现细胞质内遗传物质无法整合到基因组内，plasmid的名字才被重拾回来。
如何风靡 尽管在1950年代质粒已经被发现，然而质粒进入实验室作为研究工具则等了20年，在这期间，科学家们主要使用的研究工具还是噬菌体。知道1972年的某一天， Stanley Cohen （1986诺贝尔生理学或医学奖获得者）和几个科学家在唠嗑的时候，聊到最近刚发现的限制性内切酶EcoRI，于是他们在餐巾纸上写下实验设计：将四环素抗性质粒pSC101和卡那霉素抗性质粒pSC102经由EcoRI处理后转入大肠杆菌，可能可筛选到双重抗性的大肠杆菌。而这个实验大获成功，成为历史上 第一个质粒克隆实验 。从此， 质粒+限制性内切酶 的组合大放异彩，现如今是再平常不过的工具了。
质粒是可独立于染色体自行复制的环状DNA，常在在细胞、古生菌及真核生物中出现，质粒的存在可为细胞体提供一些特殊的功能，例如抗生素耐药性、毒性等等。所有的天然质粒都有一个 复制起点（origin of replication，它控制着质粒的宿主范围和拷贝数） ，通常还包括一个有利于生存的基因，如 抗生素抗性基因 。目前实验室中使用的质粒通常是人为的，旨在引入外源性基因，这些质粒至少要有 复制起点、筛选标记和克隆位点 。
由于其人工性质，实验室质粒通常被称为 载体（vector）或构建体（constructs） 。质粒构建方法有很多种： restriction enzyme, ligation independent, Gateway, Gibson 等等，我们后面会一个个谈到。克隆方法的选择取决于质粒的结构，常见的质粒类型有: 克隆质粒、表达质粒、基因敲除质粒、报告质粒、病毒质粒、基因组工程质粒 等等。而如何选择质粒载体、工具等等相关内容，希望我们能更新到这部分内容。下面我们就质粒每个元件进行简单的介绍。
参考上 面我们提到的文章 都是基本功！和春卷一起看图学质粒 。 Ori的概念要和启动子区别开来 ，Ori对应的是质粒本身的复制，而 promoter对应的则是基因的转录 ，Ori的强度决定该质粒在细菌中的产量，而promoter则决定基因的表达能力。因此选择Ori时主要依据我们对拷贝数和宿主的需求。
Ori决定着质粒在细胞中的产量，而此时启动子则介导基因的转录，一般来说启动子这一词包括了 启动子和反应原件操纵子（operators） 。启动子区域的序列控制着RNA聚合酶和转录因子的结合，因此启动子决定着基因表达的时间和地点。
promoter介导的DNA转录至RNA过程依赖于 RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP） 。在原核生物中，这部分相对简单，而真核生物则根据不同聚合酶有不同的转录结果。这意味着启动子必须兼容所需的RNA类型， 如果你想让基因表达，即转录mRNA，则此时需要RNAP II；而如果仅仅是要转录出RNA，例如shRNA，CRISPR-Cas9所需的gRNA，此时我们需要的是RNAP III ，而在病毒中则是LTRs，具体可以参考慢病毒相关文章： 慢慢的慢病毒，给我快快的用起来！
同样，根据质粒宿主的不同，启动子的类型也会不同。真核生物启动子有 持续激活型（constitutively active）和严密调控型（carefully controlled） ，此外，启动还会被增强子、绝缘子等原件调控：
常规真核生物启动子：
常规原核生物启动子 ：
Ori完成质粒复制，promoter启动基因转录，基因开始转录后经过延伸，最后必须在正确的位置终止。终止子（terminator）位于被转录基因的下游，通常在任何3'调控元件之后，如PolyA信号。这里有几个概念需要放在一起比较：
（1）promoter 启动子 ：这是一段和RNA聚合酶特异性结合的DNA序列，它位于起始密码子的上游， 启动子本身并不转录 ，只是启动转录。
（2）terminator 终止子： 提供转录终止信号的DNA，这部分DNA转录出来的RNA带有茎环结构（发夹结构），从而造成转录的终止。因此 导致转录终止的不是DNA序列，而是DNA转录出的RNA结构 。
（3）start codon 起始密码子： 肽链翻译的第一个氨基酸的密码子，通常为AUG 甲硫氨酸。
（4）stop codon 终止密码子： 肽链翻译的终止信号密码子，它们有非常华丽的名字：包括 琥珀密码子(UAG)、赭石密码子(UAA)、欧珀密码子(UGA) 。
区别：启动子和终止子是DNA向RNA转录层面的调控因子，均为非编码区的 DNA序列 ；起始密码子和终止密码子都是 mRNA上的氨基酸序列 。表述时建议使用英文名字而非中文，因中文容易混淆。
主要用Rho-依赖和不依赖两种方式：（1）Rho是一种 解旋酶 ，它协助RNA聚合酶在转录本的终止；（2）Rho非依赖途径依赖于RNA转录本中的 GC-rich发夹结构 ，发夹-DNA复合体破坏转录复合体的稳定，启动转录本的分裂，此为质粒中常见的终止方式。
真核生物的终止子要对应其相应的启动途径，主要是RNA聚合酶的区别：
哺乳动物表达质粒主要用于转录mRNA，常用的终止子SV40、hGH、BGH和rbGlob包含AAUAAA序列，可促进Poly A化，从而导致信号终止，如下：
终止子的终止效率并不是百分之百，为保险起见，终止信号可以多加一到两个。
今日简单介绍了质粒的基本元件，涵盖质粒复制起点，质粒转录的起始和结尾，算是有头有尾， 这每一个元件对于质粒骨架的选择都十分重要 ，因此即使是非常基本的内容，但还是需要着重强调。接下来我们会依据今日所学尝试去选择合适自己的质粒，并在酶切上花费一定心思。我们总是在路上，每一天都要为新学到的知识感到快乐，共勉！
质粒属于商标分类第1类0106群组；
经路标网统计，注册质粒的商标达1件。
注册时怎样选择其他小项类：
1.选择注册（用于工业、科学、摄影以及农业、园艺和森林的化学品，群组号：0101）类别的商标有1件，注册占比率达100%
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1.第一步，看箭头：
大多数质粒都会有箭头，箭头有两种解释。一种是转录方向，转录方向主要是由启动子开始的一个大箭头，是启动子启动序列的顺序。另一种是复制起始位点的方向，复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。
还需要提到的是F1启动子（图上的f1 ori）代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA哦，但是可以用来测序。看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。
2.第二步，看上面的标签。
报告基因：通常会有一两个蛋白，被用作报告基因，比如常见的copGFP（绿色荧光蛋白），Puro（嘌呤霉素），Lacz（乳糖操纵子）等等。和抗性基因不同，这样的报告基因，并不是为了在大肠杆菌扩增质粒的过程中起作用的。
而是在质粒转入表达体系后起到作用的，基本上就是为了显示过表达或是敲减的基因是否正常运作。有的报告基因会融合在蛋白中表达，有的会另外用一个独立的启动子进行表达（比如shRNA的质粒中）。
3.第三步，看多克隆位点：
MCS（Multiple Cloning Site，也就是多克隆位点），一般图中会把多克隆位点上的酶切位点都标记出来。上面的酶切位点顺序，一般都是按照5`-3`的顺序排列下来的，需要注意的是这样几点。
第一点是要注意，酶切位点边标注了*的一般是指并不仅仅存在一个位点，也就不能用来作为构建质粒的酶切位点。
第二点需要注意的是，有的酶切位点，在序列中只有一个，但它上面也会标注一个*或者（dam），这说明可能这个酶切位点会有CpG岛的甲基化修饰[常见的是XbaI，TCTAG(6m)A中的TC无法切开]，一般也是不能用的。但是非要用这个酶切位点的话，就需要用非甲基化的感受态细胞，如JM109或者JM110。
4.第四步，看多克隆位点的序列：
末端如果有差异的话，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替换1-2个碱基（变成GTG或者GCG这样），从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。而配合扩增和酶切的话，插入片段是允许有3`末端的冗余。
为了可以应付3`末端的冗余碱基，在多克隆位点序列后，会有译码的终止TAA密码，即使插入的片段使得3`末端产生了移码突变，照样能使表达的蛋白正常终止掉（在酵母双杂的AD质粒中，由于插入的是随机cDNA，所以AD的载体上会常见这样的结构）。
扩展资料
分类
1.根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。
接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。
2.根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。
严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。
松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。
3.根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。
不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。常用于流行病学的调查。
参考资料：百度百科-质粒
质粒（plasmid）是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。
质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学形状，有利于细菌在特定的环境条件下生存。
质粒(plasmid) 广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。从分子组成看，有DNA 质粒，也有RNA 质粒从分子构型看，有线型质粒、也有环状质粒: 其表型也多种多样。细菌质粒是基因工程中最常用的载体。
扩展资料：
质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。
将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。
质体与染色体最主要的区分是，质体不是细胞生存所必需，染色体则是细胞生存必需的。大部分的质体都是环状分子，但是也有少数属于线状分子，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。
参考资料：百度百科 质粒
特殊用途载体
载体（Vectors）DNA： 1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区（encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。
载体（Vectors）定义：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)ori复制起始点遗传标记pUCMCSAmpr运送外源基因高效转入受体细胞2、为外源基因提供复制能力或整合能力3、为外源基因的扩增或表达提供条件
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体。
基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。（2）有选择性标记Ampr、Tetr、Kanr等。
（3）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。（4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。（5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。外源DNA插入其中不影响载体的复制且切点是单一的，这样可将多个外源DNA 片段插入其中。避免基因的非控制性扩散。（6）具有对受体细胞的可转移性。（7）具有较好的安全性，不能任意转移。
大肠杆菌质粒载体pBR322结构图克隆位点克隆位点遗传标记基因复制起点
载体的种类按功能分类克隆载体克隆一个基因或DNA片断表达载体用于一个基因的蛋白表达整合载体把一个基因插入到染色体组中
表达载体 用于一个基因的蛋白表达 整合载体 把一个基因插入到染色体组中按来源分类 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 人工染色体载体00
载体的种类和特征质粒* 受体细胞结构插入片断举例E.coli 环状＜8kb pUC18/19 , T-载体等λ噬菌体线状
EMBL系列，λ gt系列丝状噬菌体及噬菌粒＜10 kbM13mp系列粘粒载体35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCVBAC (Bacterial Artificial Chromosome)≈300 kbPel oBAC系列YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母细胞线性染色体kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳类细胞＞1000 kb病毒载体动物细胞SV40 载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体和细菌pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节克隆载体1. 质粒载体（plasimid vectors）2. 噬菌体载体（phage vectors）
第一节克隆载体1. 质粒载体（plasimid vectors）2. 噬菌体载体（phage vectors）3. 柯斯质粒载体（cosmid vectors）4. 人工染色体载体（B/Y/HAC）
质粒的生物学特性（1）质粒的概念的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。
质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等）。
（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。（3）质粒的生存
严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）(拷贝数少，为1-5个)
（4）质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）(拷贝数少，为1-5个)松弛型复制控制的质粒（relaxed）(拷贝数多，可达10-200个拷贝)因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
（5）质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。
（6）质粒的可转移性在天然条件下，很多天然质粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。Conjugative plasmid 接合型质粒（自我转移的质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。Non Conjugative plasmid 非接合型质粒（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发的转移到另一个细胞。基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
Tra protein from conjugative plasmid
bom siteMob genemob mRNAMob proteinopenrecipient cellhelper plasmid即mob基因的产物可打开非接合质粒的bom 位点(oriT位点)，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。
质粒DNA的tra基因 E.Coli产生菌毛 宿主与受体细胞结合 遗传物在细胞之间转移（指令）（迁移）大肠杆菌接合（conjunction）
（7）携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
遗传标记基因定义:在基因工程中使用与选择重组体DNA转化细胞的基因1. 指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞2. 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子标记基因的作用
标记基因的种类1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neorb. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdrc. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3. 生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ，GUS，CAT4. 噬菌斑
1.四环素抗性基因（Tcr）Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。2.氨苄青霉素抗性基因（Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。3. 氯霉素抗性基因（Cmr）Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4. 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。20
质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。
（8）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。双螺旋共价闭合环（超螺旋）线状双螺旋（两个裂口）开环双螺旋（一个裂口）
质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。OC L SC
天然质粒的局限性天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。
质粒载体的命名原则人工组建的质粒人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系质粒的编号。
质粒载体的发展概况第一阶段（1977年前） 天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313和pBR322。第二阶段 增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段 完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。
质粒载体的构建质粒构建基本策略1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选择转化体2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组
3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS
质粒构建原则1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS2、正确获得构建质粒载体的元件：酶切、PCR3、组装合适的选择标记基因4、选择合适的启动子5、提高外源DNA的容量灭活一些有害基因，比如与质粒移动有关的基因，或影响质粒复制的负调控基因等。6、需要灭活初始质粒上的某些编码基因7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单
质粒载体：作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。
质粒载体的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000 扩增基因
高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数 扩增基因低拷贝质粒来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选
质粒载体的分类（1）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1、pMB9 松弛型质粒。具有低分子量、高拷贝数的优点。
具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数1000－3000个！用途：适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。
（2）低拷贝数的质粒载体（3）温控的质粒载体由pSC101派生来的载体。特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。（3）温控的质粒载体一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2温度低（<37 oC），拷贝数很少；温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个。
（4）插入失活型质粒载体如pDF41、pDF42、pBR322。无抗生素抗性抗生素抗性
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。外源DNA片段插入会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmr等）失活。如pDF41、pDF42、pBR322。外源DNA无抗生素抗性抗生素抗性
质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
（5）正选择的质粒载体质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型，直接选择转化后的细胞，提高了选择的敏感性。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体（图4-11）的主要组成部分，包括大肠杆菌的启动子及操纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。
经典的大肠杆菌质粒载体pSC101质粒载体天然质粒，属严紧型低拷贝质粒。9.09 kb。四环素抗性Tetr。
ColE1天然质粒，属松弛型、高拷贝质粒，6.6Kb。有氯霉素扩增效应，每个细胞拷贝
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）
选择标记大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成噬菌斑。•colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。•唯一的克隆位点EcoR I 正好位于这个基因的内部。可以通过插入失活筛选。
③不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因
ceaimmkil结构基因免疫基因溶菌基因②杀死不含有ColE1细菌的原因cea + kil基因产物产生菌对细菌素有自身免疫性大肠杆菌所产生的细菌素称为大肠菌素(colicin),它除作用于某些型别的大肠杆菌外,还能作用于亲缘关系相近的志贺菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和巴氏杆菌等。③不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因imm基因
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。
唯一的克隆位点EcoR IEcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。Colicin E1外源DNA无Colicin用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。
pBR322：人工构建载体p:质粒；BR：质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母；322：实验编号三个亲本质粒：
pSF2124pMB1pSC101三个亲本质粒：pMB1:出发质粒(ColE1)pSF2124: AmprpSC101: Tetr把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。4.36kb的环状双链DNA，碱基序列已经全部清楚。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。
3个会导致Ampr基因失活9个导致Tetr基因失活氨苄青霉素和四环素抗性24个单一克隆位点。
pBR322的优点①双抗生素抗性选择标记抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重组体质粒的有效方法，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞®在Amp或Tet中都死亡。获得重组载体的寄主细胞®在Amp或Tet其中之一中死亡。
不含质粒载体含有空质粒载体含有重组质粒载体AmpAmp＋Tet
pBR322重组克隆的筛选重组克隆的“插入失活”筛选方法pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr——→在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；pBR322—→插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。
②分子小，克隆能力大③高拷贝数④安全⑤具有较多的单一酶切位点（24种）
长度4363bp，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源DNA片段。③高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可1000~3000copies④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。载体越小越好。>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。缺失流动基因（mob）。这样，质粒就不会从一个细菌接触转移到⑤具有较多的单一酶切位点（24种）
pBR322的缺点保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
PBR322的改进①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。
②改造EcoR I 位点pBR325：使EcoRI 也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。
pUC系列载体在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19
加入一个在5端带有10个多克隆位点的基因lacZ’
（1）元件来源a .ori来自pBR322质粒的复制起点b. 标记基因（ampr）:pBR322的Ampr基因
Lacz基因编码的半乳糖苷酶是四聚体。Lacz’基因含有lacz基因的前59个密码子，a序列，编码a肽。c. lacz’基因：大肠杆菌lac操纵子DNA区段，编码β-半乳糖苷酶a-肽链，是LacZ氨基端的一个片段.载体用于可编码半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。d. MCS 多克隆位点。
（2）克隆位点具有MCS（多克隆位点）区段：位于lacZ’基因的5’端。10个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏该基因功能。
有mcs的存在，lacz’基因仍然能编码a肽。如果外源基因插入此mcs区，该基因失活。
x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal 蓝色
菌落蓝白选择的原理：IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，乳糖类似物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱导乳糖操纵子结构基因的表达，即可诱导lacz’所编码的半乳糖苷酶氨基末端片段（α－肽）的合成。x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal蓝色x－gal水解后呈现蓝色
α-互补：pUC类载体带有lacz’基因，编码半乳糖苷酶氨基端片段（α-肽），此片段与宿主细胞所编码的羧基端半乳糖苷酶实现基因内互补，形成有功能的半乳糖苷酶，称α-互补。
α-互补（α-complementation）α-互补是指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖lac 操纵子中的lacZ 基因编码β-半乳糖苷酶，如果lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15 基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第个氨基酸的lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码N-端140 个氨基酸的lacZ 基因（称为lacZ'），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。
菌落蓝白斑选择的原理：在基因克隆时，细菌在含有IPTG和x－gal的培养基中进行培养。IPTG诱导质粒的lacz’基因产生α-肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使x－gal水解，产生蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝色。当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使lacz’失活，不能表达α-肽，破坏了互补作用，细胞内无有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。
互补显色反应
a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达500-700个拷贝
PUC载体的优点：a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达个拷贝b 具有MCS片段，可把具有两种不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC类载体上。2.6kbc 可以用组织化学方法检测重组体（蓝白斑筛选）.
pGEM载体总长度为2743bp 含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个lacZ’编码基因
一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。
pGEM系列与pUC系列之间的主要差别pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于Lac z’基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。pGEM 系列与pUC 系列之间的主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7 启动子和SP6 启动子，它们为RNA 聚合酶的附着提供特异性识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ‘ 基因中多克隆位点区的两侧，若在反应体系中加入纯化的T7 或SP6 RNA 聚合酶，便可以将已经克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA 。质粒载体pGEM-3Z 和pGEM-4Z 在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6 和T7 这两个启动子的位置互换、方向相反而已。
pGEM-3Z：多拷贝装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’ 装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达
注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等
穿梭质粒载体这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。这类载体既具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.穿梭载体(shuttle vector)是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体.这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.61
用Taq酶的PCR产物3’端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5’端突出的T，它们之间可以连接，即TA克隆。
When it comes to treating diseases like cancer, modern medicine has an impressive arsenal. And one of its most versatile weapons are Y-shaped proteins called monoclonal antibodies. Our immune systems already produce their own antibodies (plasma cell), they come in billions of variations, each matching a specific target, such as a particular toxin, bacteria or virus. When they bind to their target, they send a signal, this bacterium is now marked for destruction. These naturally- produced antibodies are pretty effective. In the 1970s, scientist figured out how to mass produce them.
K
solutionCAS号：39450-01-6级别：PCR
Grade分子量：～18kDa活力：≥600U/ml，35℃
浓度：20mg/mlDNase,RNase：None
detected性状：液体，是一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的
丝氨酸蛋白酶
，
来源于
白色念球菌
(.
Tritirachium
album.
)，具有很高的
比活性
。EDTA等鳌合剂或SDS等
去垢剂
不能使
蛋白酶K
失活，反而增强和稳定酶活性，并在较广的PH范围内（PH4-12.5）均有活性。在组织或细胞核酸分离时，使核酸酶（RNA和DNA）以及反应中其他酶失活。用途：生化研究。广谱蛋白酶，95C
加热10
分钟，则完全失活。可替代
DEPC
处理
RNA
抽提
用的
离心管
和枪头，实现灭活
RNase
A
的目的，也用于处理
RNase-Free的水。充分降解组织或细胞中蛋白质分子特别是核酸，以达到释放和萃取高质量核酸的辅助试剂。用于
质粒
或基因组DNA、RNA的分离以及蛋白多肽印迹实验。保存：2～8℃
第二个问题：质粒有时候不仅仅是将目的基因导入受体细胞，比如导入大肠杆菌中，很多目的基因就随质粒的复制而复制，随质粒基因的表达才表达！因此需要这些元件！
