汽车系毕业论文范文

电气自动化实习报告一.实习目的生产实习是教学与生产实际相结合的重要实践性教学环节。在生产实习过程中，可以培养我们观察问题、解决问题和向生产实际学习的能力和方法为目标。培养我们的团结合作精神，牢固树立我们的群体意识，即个人智慧只有在融入集体之中才能最大限度地发挥作用。通过这次生产实习，使我在生产实际中学习到了电气设备运行的技术管理知识、电气设备的制造过程知识及在学校无法学到的实践知识。在生产实践中体会到了严格地遵守纪律、统一组织及协调一致是现代化大生产的需要，也是我们当代大学生所必须的，从而近一步的提高了我们的组织观念。我们在实习中了解到了工厂供配电系统，尤其是了解到了工厂变电所的组成及运行过程，使我开阔了眼界、拓宽了知识面，为学好专业课积累必要的感性知识，为我们以后在质的变化上奠定了有力的基础。通过生产实习，对我们巩固和加深所学理论知识，培养我们的独立工作能力和加强劳动观点起了重要作用。　入厂主要安全注意事项1.防火防爆2、防尘防毒3、防止灼烫伤4.防止触电5.防止机械伤害6.防止高处坠落7.防止车辆伤害8.防止起重机械伤害9.防止物体打击 。.设备内作业须知：1.在各种储罐，槽车，塔等设备以及地下室，或是其他密闭场所内部进行工作均属于设备内作业2.设备上与外界连通的管道，孔等均应与外界有效的隔离3.进入设备内作业前，必须对设备内进行清洗和置换4.应采取措施，保持设备内空气良好5.作业前30分钟内，必须对设备内气体采取采样分析，采样应 有代表性6.进入不能达到清洗和置换要求的设备内作业时，必须采取相应的防护措施 7.在容器内工作时因照明良好，照明用电应小于等于36V的防 爆型灯具8.多工种，多层次交叉作业应采取互相之间避免伤害的措施，并且搭设安全梯或是安全平台，比要时由监护人用安全绳栓作业人员进行施工9.设备内作业必须有专人监护，并应有入抢救的措施及有效保 护手段化工生产特点的简要介绍：此次工厂生产以精对苯二甲酸（PTA）为原料，相对分子量为166.13，结构式HOOC[C6H4]COOH，在常温下是白色粉状晶体，无毒易燃，若与空气混合在一定限度内遇火即燃烧故我的车间处于一级防爆区内(聚合电仪)。高纯度对苯二甲酸PTA与乙二醇(EG)缩聚得到聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET),还可以与1,4-乙二醇或1,4-环己烷二甲酸反应生成相应的酯，主要用于生产聚酯。而聚酯纤维是合成纤维最主要的品种，在世界合成纤维总产量中占将近80％的比例，。乙二醇 对二甲苯作原料，用直接催化法方式合成聚酯。最终产品:涤纶长丝、涤纶短丝、低弹丝、高弹丝、差别化和功能化纤维及涤纶短纤维产品，化工生产的特点是1、原料，半成品，成品多分为易燃易爆或是有毒物 2、生产工艺多为高温，高压或是底温高压 3、生产的连续性强，自动化程度高 4、工业三废多，影响环境　.实习过程2、组织参观 在实习开始时，我们对实习单位的参观，以便了解其概况。在实习期间，我们还到其它有关车间去进行专业性的参观，获得了更加广泛的生产实践知识，和更加准确理解了工厂的运作模式。参观中我们着重了解了先进的设计思想和方法、先进工艺方法、先进工装、先进设备的特点以及先进的组织管理形式等。3、车间实习 我们在车间实习是生产实习的主要方式。我们按照实习计划在指定的车间进行实习，通过观察、分析计算以及向车间工人和技术人员请教，圆满完成了规定的实习内容。4、理论与实际的结合 为了能够更加深入的进行车间实习，在实习过程中，我们结合了所学的书本知识与实习的要求，将理论与实际进行了完美的结合，也更加的促使我们不断地进行学习与研究。5、实习日记 在实习中，我们们每天的工作、观察研究的结果、收集的资料和图表、所听报告内容等均记入到了实习日记中以备以后翻阅。　实习内容（一）学习和了解变电所的主要结构种类和常规型变电所设备选型。（二）学习和了解变电所的主要部件的生产技术资料，包 括：各种技术标准，图纸，专用设备说明书等。（三）了解变各类变频器主要技术要求以及使用。常规型变电所设备选型（a）、设备的选择配置应力求小型化，要保证技术先进、工作性能稳定可靠，质量有保证且售后服务跟得上。（b）、所内应采用两台主变，要求节能且有载调压型，一般采用S10或SZ10型变压器，变压器容量要根据电力负荷情况而定，但两台主变容量比不应超过1∶3，阻抗电压、变比、接线组别应相同，误差不超过 5％，为以后变压器并列运行提供条件。（c）、所用变采用1～2台S10－50kVA/35/0.4kV直配变，装在35kV进线外侧或35kV母线上，所用变采用跌落熔断器控制。（d）、高压断路器应采用SF6断路器，35kV断路器采用LW8－35型，10kV断路器采用LW3－10型。（e）、35kV进线采用双回，为环网工程做好准备。(6)35kV母线使用LGJX－120铝绞线，采用单母线不分段接线，10kV母线采用分段接线，出线4～6回为好。（f）、无功补偿容量按主变容量的10％～15％而定，采用BWF－200－1W型电容器，电压为星形接线。（g）、避雷措施：35kV线路采用避雷线，所内采用避雷针和避雷器两种。避雷针使用镀锌圆钢焊接，装设在所区的4个角；避雷器采用金属氧化物避雷器，35kV侧装在母线上，10kV侧装在出线处。（h）、所内隔离开关操作机构上应设"五防"闭锁，由人工或由计算机综合自动化系统实现"五防"。（i）控制、保护、测量部分采用计算机综合自动化管理系统。部分设备简介 均速管流量传感器（以下简称均速管）是基于皮托管测速原理发展而来的一种差压流量传感器。均速管与差压变送器、显示仪表配套使用，可实现对圆管、矩形管道中的液体、气体或蒸汽流量进行测量。均速管可广泛应用与电力、石油、化工、轻纺等行业由于其压力损失小，安装维修简便，特别适合大口径管道流量的测量。起动器（又称软起动器，电机软起动器）软启动器是一种集电机软起动、软停车、轻载节能和多种保护功能于一体的新颖电机控制装置，

国外称为Soft Starter。它的主要构成是串接于电源与被控电机之间的三相反并联闸管及其电子控制电路。运用不同的方法，控制三相反并联闸管的导通角，使被控电机的输入电压按不同的要求而变化，就可实现不同的功能。　电磁阀　电磁阀是用来控制流体的方向的自动化基础元件，属于执行器；通常用于机械控制和工业阀门上面，对介质方向进行控制，从而达到对阀门开关的控制。变频器实习期间主要接触到西门子、 富士、 安川 、丹拂斯等。我们知道交流电动机的同步转速表达式位：n＝60 f(1－s)/p (1)式中 n———异步电动机的转速； f———异步电动机的频率；

s———电动机转差率；p———电动机极对数。

由公式可知，转速n与频率f成正比，只要改变频率f即可改变电动机的转速，当频率f在0～50Hz的范围内变化时，电动机转速调节范围非常宽。变频器就是通过改变电动机电源频率实现速度调节的，是一种理想的高效率、高性能的调速手段。

变频器原理：利用二极管的单通性整流将交流变为直流；再用逆变块产生所需要频率的交流。而逆变块主要也是利用二极管的通断实现将直流变为交流，其频率大小由通断变化快慢决定，从而实现频率改变。变频器控制方式

低压通用变频输出电压为380～650V，输出功率为0.75～400kW，工作频率为0～400Hz，它的主电路都采用交—直—交电路。其控制方式经历了以下四代。

U/f=C的正弦脉宽调制（SPWM）控制方式

电压空间矢量（SVPWM）控制方式

矢量控制（VC）方式

直接转矩控制（DTC）方式

矩阵式交—交控制方式

.实习感悟生产实习是培养高素质工程技术人才的一个重要实践性教学环节，是将学校教学与生产实际相结合，理论与实践相联系的重要途径。其目的是使我们通过实习在专业知识和人才素质两方面得到锻炼和培养，从而为毕业后走向工作岗位尽快成为业务骨干打下良好基础。通过生产习，使我们了解和掌握了变电所的主要结构、生产技术和工艺过程；使用的主要工装设备；产品生产用技术资料；生产组织管理等内容，加深对变电所的工作原理、设计、试验等基本理论的理解。使我们了解和掌握了变电所的工作原理和结构等方面的知识。为进一步学好专业课，从事这方面的研制、设计等打下良好的基础。在这次生产实习过程中，不但对所学习的知识加深了了解，更加重要的是更正了我们的劳动观点和提高了我们的独立工作能力等。

关键词：成膜助剂在乳胶漆中的应用 ；应用

1前言

建筑涂料在涂料工业中占有很重要的地位，目前，国内建筑涂料在涂料中的比重日渐增大。随着人们生活水平的口益提高．对建筑用乳胶漆的质量要求也越来越高，而涂料成膜的好坏直接影响涂层的性能。

一般人们认为乳胶漆在较短的时间内就能完全成膜，而忽略了各个成膜阶段的温度控制，特别是外用乳胶漆在施工后的温度变化较大，使最终涂层的性能不理想，如光泽下降、附着力差、耐擦洗性差、耐沾污性不良、耐候性不理想等等。有效地添加成膜助剂，可较大幅度地降低成膜温度，是改善乳胶漆低温施工性能的有效措施。本文对几种成膜助剂在乳胶漆中的应用进行了一系列实验，对建筑用乳胶漆的配方设计具有一定的参考作用。

2实验部分

与溶剂型涂料不同，乳胶漆的成膜机理一般分为以下过程：

第一，充填过程。乳胶漆施工后，水分挥发，当乳胶微粒占膜层74％(体积)时，微粒相互靠近而达到密集的充填状态。组分中的乳化剂及其他水溶性助剂留在微粒间隙的水中。

第二，融台过程。水分继续挥发，高聚物微粒表面吸附的保护层破坏．裸露的微粒相互接触，其间隙愈来愈小，至毛细管径大小时，由于毛细管作用，其毛细管压力高于聚合物微粒的抗变形力，微粒变形，最后凝集、融合成连续的涂膜。这一过程是乳液能否成膜的关键，若乳液颗粒的玻璃化温度(Tg)较高(为了使涂膜具有良好的机械性能,耐候性和耐沾污性，Tg值一般不能太低)，在较低环境温度下，就很难变形，从而会使融合过程受阻，导致不能成膜，这时往往需要用成膜助剂协助成膜。

第三，扩散过程。残留在水中的助剂逐渐向涂膜扩散，并使高聚物分子长链相互扩散，形成具有良好性能的均匀涂膜。

成膜助剂是一种可以挥发的暂时性增塑剂，能促进乳胶粒了的塑性流动和弹性变形，改善其聚结性，可在广泛的施工温度范围内成膜、理想的成膜助剂应具有下列特性：作为聚合物乳液的良溶剂，可降低聚台物的最低成膜温度；在水巾溶解性小；具有-定的挥发性，成膜过程中能滞留在涂膜中发挥作用，成膜后全部挥发，不影响涂膜性能；不影响乳液的稳定性。

成膜助剂的种类很多，包括醇类(如笨甲醇)、酯醇类(如Texanol酯醇等)、醇醚类(如乙二醇丁醚、丙二醇苯醚等)、醇醚酯类(如己二醇丁醚醋酸酯等)等。常用的成膜助剂有Texanol酯醇、苯甲醇(BA)、乙二醇丁醚(EB)、丙二醇苯醚(PPH)。以下就这几种常用的成膜助剂进行比较试验。

2．1主要仪器设备最低成膜温度仪(日本理学工业公司，IV605)

2．2试验用的乳液本试验采用在国内具有代表性、使用广泛的纯丙、苯丙、醋丙、叔醋等乳液，如长兴、巴斯夫、联碳、国民淀粉、罗门哈斯、江苏口出集团、北京东方化工J一、北京通州互益化工厂、北京振翔贸易公百公司、山东青州宝达化工厂、北京科信工业贸易有限责任公可等的产品，因篇幅关系，本文仅提供部分试验数据。

2．3成膜助剂在乳液及涂料中的性能试验相容性试验：乳液与成膜助剂Texanol酯醇、苯甲醇、乙二醇丁醚、丙二醇苯醚直接混合，搅拌均匀，观察乳液的性状。

乳液粘度的测定：在相容性正常的乳液中加人成膜助剂后测定其牯度，观察粘度变化情况。

乳液摄低成膜温度的测定：将可相容的乳液与几种成膜助剂混合，测定其最低成膜温度(MFT)。

乳液冻融稳定性试验：将相容性正常的乳液加入相应量孔液最低成膜温度降至0℃的最你用量)的Texanol、BA、EB和PPH成膜助剂．于-10％的冰箱中放置16h取出后于标准条件(室温23±2℃，相对湿度50±5％)下放置8h，如此反复5个循环，观察乳液最终状态。

乳液贮存稳定性试验：将相容性正常的乳液加入相应量(乳液最低成膜温度降低至0℃的最低用量)的Texanol酯醇、苯甲醇、EB、PPH成膜助剂，在标准条件(室温23±2℃，相对湿度50±5％)下放置3个月，定期观察乳液的状态，测定其粘度、pH值。

2．4涂料的性能检测

选用不同的成膜助剂(Texanol、EB、PPH和BA)，比较其对涂料性能的影响。PPH和BA不能直接加入，将其与醇类溶剂混合，在配漆过程中缓慢滴加，以防止造成絮凝；EB若在搅拌情况下缓慢加入，可不与醇类溶剂混合，但加入速度应缓慢。

依据国家标准GB／T9755—95进行性能测试(耐老化性除外)，在耐擦洗性方面Texanol酯醇有比较突出的优势，很可能是因为其他成膜助剂与纯丙乳液的相容性不好，影响了乳液成膜，从而对涂料的性能造成影响。生产时应注意成膜助剂不能添加太快，以免产生絮凝而影响涂料的性能。

3结果与讨论

3．1成膜助剂与乳液的相容性

成膜助剂与乳液的相容性试验结果：BA、EB、PPH在6512苯丙乳液中相容性好，PPH在除纯丙乳液外的其他乳液中相容性好，但这几种成膜助剂都要缓慢滴加。否则也容易造成絮凝。对于纯丙乳液，加人此三种成膜助剂都会产生絮凝，有时可以将这几种成膜助剂与醇类溶剂混合后加到乳液中，以免造成破乳。Trexanol酯醇与我们收集到的任何一种乳液的相容性都很好，且添加方式简易，不容易造成破乳，对乳液具有普遍性。

3．2对乳液粘度的影响加入成膜助剂后，乳液的粘度基本上都有所增大。这是因为成膜助剂会软化乳液粒子，乳液粒子溶胀而变大，只要加量适当，不会影响乳液的使用。但是，由于乳液粒子的溶胀，其表面上起保护作用的表面活性剂及保护胶体的浓度相应降低．甚至被大量成膜助剂取代，而使乳液不稳定。

3．3对乳液MFT的影响

成膜助剂对乳液MFT的影响：对于相容性好的乳液，要达到最低成膜温度O℃时的成膜助剂的用量，对于苯丙乳液，加入苯甲醇的用量比。Texanol酯醇小，这可能是因为相似相容原理，苯甲醇能在最大程度上软化苯丙乳液粒子，使之以较少的用量就将乳液的最低成膜温度降至0℃，但其毒性较大，对其他类型的乳液相容性也较差，必须与醇类溶剂配合使用。EB可溶于水，加到乳液中后，不易与乳液粒子接触，所以其用量相应要大些，但由于其挥发速度与水相当，甚至更快，所以对成膜不利。进而影响涂层的性能。PPH对苯丙乳液的效果好些，但由于其在水中的溶解度略大，不易与乳液粒子接触。因此，对于PPH可相容的乳液，与Texan0l酯醇效果差不多，但对十纯丙乳液或其他类型的乳液，Texanol酯醇在加入方式上比其他成膜助剂简易，且用量不大。

3．4对乳液冻融稳定性的影响加入成膜助剂对乳液的冻融稳定性有一定影响。经过5次循环以后，乳液均凝聚，其原因是成膜助剂使乳液粒子溶胀，且使保护胶体浓度相应降低的缘故，所以若用成膜助剂与乳液配制成基料再使用，就要注意不能在低温下放置贮存。

3．5对乳液贮存稳定性的影响

成膜助剂对乳液的贮存稳定性没有影响(仅针对相容性好的乳液)，随着时间的推延，有些乳液的pH值略微下降，这是中和乳液时所用的氨水挥发所致。

乳胶漆成膜机理：

乳胶漆涂料的成膜分为三个过程，乳胶颗粒紧密堆积，乳胶颗粒融结、聚合物链端相互扩散。

乳胶漆涂布于基底上，涂料中挥发分（主要为水分）外蒸内吸，涂料固含量不断增加，颗粒相互接近最后达到最紧密的堆积。

干燥继续进行，覆盖于乳胶颗粒表面的吸附层被破坏，裸露的聚合物颗粒表面直接接触，在聚结溶剂的溶涨溶解作用下，颗粒软化变形融结而成连续薄膜。

乳胶颗粒融结同时和之后，聚合物表面的链端分子相互渗透、扩散，涂膜进一步均匀化。

乳胶漆成膜与天气状况关系很大，高温、大风，低湿度，低温、过度潮湿等都将导致乳胶粒子成膜不良，影响涂膜性能。

备胎说车

原创

2020-5-12 18:34 · 知名汽车领域创作者

6年没换过防冻液，车子会坏吗微信.mp3

8:28

来自备胎说车

不同的车子，出厂自带的防冻液都是不一样的。6年要不要换？不换会不会坏？看类型、分情况的。

防冻液也有寿命

无机盐型防冻液一般1~2年更换

防冻液主要成分3个：去离子水、防冻剂、缓蚀剂。

中石化科学研究院有论文，《汽车发动机冷却液组成与性能的关系》里面讲：目前市场上的防冻液，基本上都是用乙二醇作为防冻剂，小部分用丙二醇。

所以，防冻液的种类不同，主要就是缓蚀剂的成分不同，最后的寿命表现也就有所不同，大致上分为叫什么？“普通型”和“长效型”。

缓蚀剂主要有3种配方：无机盐型、有机酸型和复合型。

无机盐型的缓蚀剂消耗是比较快的，使用寿命一般只有1到2年，开个25000km到30000km差不多就要补加腐蚀抑制剂了，用不到6年的。

好，问题来了，我怎么知道用的是不是普通型的？说明书上是有写的，上面就是可以看的。

比如说：吉利远景，2万km就要更换防冻液了；哈弗H6，27500km换一次。一看，比较短的就是普通型嘛。

长效有机酸型防冻液保质期长，问题不大

长效有机型防冻液保质期比较长，问题是不大的，相对于无机盐型的缓蚀剂来说，有机酸型的缓蚀剂在使用的过程中消耗要慢很多。

还是前面那篇论文：有机酸型的防冻液，寿命一般是3到5年，10到15万km，也不需要补加添加剂什么的。

本田飞度、现代ix35这些车型，防冻液更换周期就是10万km的。

国内的家用车，6年的行驶里程普遍也是在10万km左右，你就记一个，差不多了。

iCET，《2018中国乘用车实际道路行驶与油耗分析年度报告》上面：国内的乘用车，在2018年的平均行驶里程是17213km。

6年一乘，10.3万km，差不多就是10万km。所以，6年这个节点，是可以考虑换一下防冻液的，防患于未然。

就好比是：一匹拉磨、干重活的马，在那边走啊走啊走啊，它哪怕力气很大、耐力很好，但是最终还是会老的，还是要光荣下岗的。

到了6年的时候，拍拍它的肩膀，让它去退休，是不是？善始善终。

即使防冻液寿命超6年，蒸发损耗要留意

除了刚才说的那2种，其实还有一些防冻液，所谓的“保质期”比6年长很多。

用这些防冻液的，主要是一些日系车型：雷克萨斯ES，保养手册上写的，16万km第1次换；马自达阿特兹，20万km或者10年换。

再极端一点，斯巴鲁森林人，保养手册上写的：斯巴鲁纯正冷却液，第1次22万km或者11年之后再换。

对于这些车型，相对就比较放心，只要不漏，过了六年是没有问题的

目前公司主要产品为医用生物降解聚酯材料——聚乳酸及其共聚物。公司秉承专业、专心、专注的工作理念，以一流的产品、一流的服务，以真诚的态度取得客户的信任和合作，共创美好的未来。

专 业：专业的研发队伍、专业的技术服务

专 心：专心做人、专心做事

专 注：专注生物降解材料研发

主要产品：

医用生物降解聚合物

● 聚乳酸（PLA）

● 聚乳酸/乙醇酸共聚物（PLGA）

● 温敏聚乳酸水凝胶（MPEG-PLA、MPEG-PLGA）

● 聚乙二醇/聚乳酸共聚物(PLA-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLGA)

● 端羧基聚乳酸(OH-PLA-COOH、OH-PLGA-COOH)

● 端羟基聚乳酸（OH-PLA-OH,OH-PLGA-COOH)

● 聚己内酯及共聚物（PCL，P(LA-CL)

● 聚三亚甲基碳酸酯及其共聚物（TMC、P(LA-TMC)）

● 聚对二氧环已酮及其共聚物（PPDO、P(LA-PDO)）

单 体

● 丙交酯（外消旋、左旋）LA

● 乙交酯GA

● 三亚甲级碳酸酯TMC

● 对二氧环己酮PDO

制 品

● 电纺丝

● 多孔泡沫支架（片状/管状/棒状）

● 纤维

● 聚乳酸膜

项目\品名 乙二醇乙醚 乙二醇丁醚

纯度%（WT） 99.0 99.0

沸程℃（馏出物体积不少于95%） 130-137 165-175

密度（D 4 20 ） 0.925-0.935 0.895-0.905

酸度（以醋酸计）（WT） ≤ 0.01 ≤0.01

水分%（WT） ≤0.1 ≤0.1

主要用于硝基纤维素、醋酸纤维素，合成树脂、油漆的溶剂，涂料工业用于配制油漆稀释剂、脱漆剂及制造喷漆的原料，制药工业用作药物萃取剂、塑料工业用于树脂增塑剂、纺织工业用作纤维润滑剂、化纤油剂的分散剂，还可用作农药分散剂、干洗溶剂、切削油溶剂以及有机合成中间体、矿物油乳的辅助溶剂、分析试剂等。

包装：

采用200立升铁桶包装。

by Escherichia coli transformant cells coexpressing

the carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes

由共表达碳酰还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌转化细胞合成

纯光学（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

Abstract The asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-

oxobutanoate (COBE) to ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate

((S)-CHBE) was investigated. Escherichia coli cells expressing both the carbonyl reductase (S1) gene from Candida magnoliae and the glucose dehydrogenase (GDH) gene from Bacillus megaterium were used as the

catalyst. In an organic-solvent-water two-phase system,(S)-CHBE formed in the organic phase amounted to 2.58 M (430 g/l), the molar yield being 85%. E. coli transformant cells coproducing S1 and GDH accumulated 1.25 M (208 g/l) (S)-CHBE in an aqueous monophase system by continuously feeding on COBE, which is unstable in an aqueous solution. In this case, the calculated turnover of NADP+ (the oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) to CHBE was 21,600 mol/mol. The optical purity of the (S)-CHBE formed was 100% enantiomeric excess in both systems. The aqueous system used for the reduction reaction involving E. coli HB101 cells carrying a plasmid containing the S1 and GDH genes as a catalyst is simple. Furthermore, the system does not require the addition of commercially available GDH or an organic solvent. Therefore this system is highly advantageous for the practical synthesis of optically pure (S)-CHBE.

本本篇文献研究了利用COBE不对称合成（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE）。大肠杆菌细胞作为催化剂同时表达了来自念珠菌属magnoliae的碳酰还原酶和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因。在水/有机溶剂两相体系中，(S)-CHBE在有机相中的浓度可以达到2.58M（430g/l），摩尔产率达到85%。大肠杆菌的副产物S1和GDH也达到了1.25M（208g/l），COBE在水相中不稳定，所以(S)-CHBE可以在水单相中不停的生成。在这种情况下，适当的从NADP+到CHBE的转变达到了21,600 mol/mol。所形成的CHBE的旋光度在这种体系中100%对映体过量。在水相中用携带含有S1和GDH基因质粒的E. coli HB101作为催化剂不对称还原是比较简单的。并且，这种体系并不额外需要商业GDH或者有机溶剂。因此，这种体系对于实际合成纯光学活性的(S)-CHBE是非常方便的。

Optically active 4-chloro-3-hydroxybutanoic acid esters are useful chiral building blocks for the synthesis of pharmaceuticals. The (R)-enantiomer is a precursor of L-carnitine (Zhou et al. 1983), and (S)-enantiomer is an important starting material for hydroxymethylglutaryl- CoA (HMG-CoA) reductase inhibitors (Karanewsky et

al. 1990). Many studies have described the microbial or enzymatic asymmetric reduction of 4-chloro-3-oxobutanoic acid esters (Aragozzini and Valenti 1992Bare et al.1991Hallinan et al. 1995Patel et al. 1992Shimizu et al. 1990Wong et al. 1985) based on the reduction by baker’s yeast (Zhou et al. 1983).We have previously showed that Candida magnoliae AKU4643 cells reduced ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE) to (S)-CHBE with an optical purity of 96% enantiomeric excess (e.e.) (Yasohara et al. 1999). As this yeast has at least three different stereoselective reductases (Wada et al. 1998, 1999a, b), the (S)-CHBE produced by this yeast was not optically pure. From among these three enzymes, an NADPH-dependent carbonyl reductase, designated as S1, was purified and characterized in some detail (Wada et al. 1998). We cloned and sequenced the gene encoding S1 and overexpressed it in Escherichia coli cells. This E. coli transformant reduced COBE to optically pure (S)-CHBE in the presence of glucose, NADP+, and commercially available glucose dehydrogenase (GDH) as a cofactor generator (Yasohara

et al. 2000).

Here, we describe the construction of three E. coli transformants coexpressing the S1 from C. magnoliae and GDH from Bacillus megaterium genes and analyze the reduction of COBE catalyzed by these strains. Previous reports on the enzymatic reduction of COBE to (R)-CHBE with an optical purity of 92% e.e. (Kataoka et al. 1999Shimizu et al. 1990) recommended an organic- solvent two-phase system reaction for an enzymatic or microbial reduction, because the substrate (COBE) is unstable in an aqueous solvent and inactivates enzymes. We examined the reduction of COBE to optically pure (S)-CHBE by E. coli transformants in a water monophase system reaction and discuss the possible use of this type of reaction system in industrial applications。

具有旋光性的（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在药物制剂的合成中是重要的手性化合物。其右旋体是L-卡尼汀的前体，其左旋体是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂的起始材料。许多研究描述了以面包酵母为基础微生物或者酶的COBE的不对称还原。我们先前已经知道利用来自念珠菌属magnoliae AKU4643 细胞催化COBE生成光学纯度96%的CHBE。这种酵母至少有三种立体选择性的还原酶，这种酵母产生的CHBE并非纯光学的，在这三种酶之中，NADPH-依赖碳酰还原酶，我们克隆并测序编码S1的基因，并在大肠杆菌中过表达。大肠杆菌转化细胞在葡萄糖，NADP+和商业化的葡萄糖脱氢酶作为辅酶因子的启动子催化COBE生成纯光学的CHBE。

我们构建这三种大肠杆菌转化细胞共表达来自的S1和来自巨大芽孢杆菌的GDH，并分析COBE被这几种菌株催化还原的反应机理。先前的报道表明，利用酶催化还原COBE生成CHBE光学纯度可达92%，也提到了因为底物（COBE）在水相中不稳定，并且酶容易钝化，所以利用酶或者微生物在有机溶剂/水两相体系中催化反应。我们研究了在水单相体系中由COBE还原生成纯光学的CHBE，还讨论了这种反应体系在工业应用中可能的用途。

Materials and methods

Bacterial strain and plasmids

The E. coli strains used in this study were JM109 and HB101.Plasmid pGDA2, in which the GDH gene from B. megaterium is inserted into pKK223-3, was kindly provided by Professor I. Urabe, Osaka University (Makino et al. 1989). Plasmids pSL301 and pTrc99A were purchased from Invitrogen (USA), and Amersham Pharmacia Biotech (UK), respectively. Plasmids pUC19 and pSTV28 (Homma et al. 1995Takahashi et al. 1995) were purchased from Takara Shuzo (Japan).

材料和方法

菌株和质粒

本次实验中使用的大肠杆菌是JM109 and HB101。来自B. megaterium的GDH基因插入到Pkk233-3质粒中，而带有GDH基因片段的pGDA2质粒由到由大阪大学的urabe教授提供。质粒pSL301和 pTrc99A是由美国的Invitrogen公司和英国的公司分别购买的。质粒pUC19和pST28是由日本takara公司购买的。

The recombinant plasmid used in this study was constructed as follows (Fig. 1): Plasmid pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about 0.9 kilobase pairs (kb) including the GDH gene. This fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSL301 to construct plasmid pSLG. Plasmid pSLG was double-digested with EcoRI and XhoI to isolate a DNA fragment of about 0.9 kb including the GDH gene.

这次实验使用的重组质粒构建如下：质粒pGDA2 被EcoRI 和 PstI双酶切从而分离出一个大小约为0.9kb的包含有GDH基因的DNA片段。这个片段被插入到质粒Psl301的EcoRI-PstI酶切位点从而构建出质粒pSLG。质粒pSLG被EcoRI和XhoI

To construct plasmid pNTS1G, this 0.9-kb fragment was inserted into the EcoRI-SalI site of pNTS1, which was constructed to overproduce S1 as described previously (Yasohara et al. 2000). To construct plasmid pNTGS1, plasmid pNTG was first generated. Two synthetic primers (primer 1, TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG,and primer 2 TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT) were prepared for polymerase chain reaction (PCR) using pGDA2 as the template. The PCR-generated fragment was double- digested with NdeI and EcoRI and then inserted into the NdeI EcoRI site of plasmid pUCNT, which was constructed from pUC19 and pTrc99A, as reported (Nanba et al. 1999), to obtain pNTG. To construct plasmid pNTGS1, two synthetic primers (primer 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and primer 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC) were prepared using pUCHE, which contains the S1 gene as the template. The PCR-generated fragment was double-digested with EcoRI and SalI and then inserted into the EcoRI-SalI site of pNTG to obtain pNTGS1. Plasmid pNTS1G, pNTGS1 or pNTG was transformed into E. coli HB101.

构建pNTS1是为了过表达前文所提到的S1，这个0.9kb大小的片段被插入到pNTS1的EcoRI-SalI酶切位点从而构建pNTS1G。为了构建质粒pNTGS1，首先需要构建pNTG。两个合成引物（引物1，TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG和引物2，TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT）和作为模板的pGDA2是PCR反应需要的。PCR得到的片段是由NdeI 和EcoRI双酶切和并插入到质粒pUCNT的NdeI EcoRI酶切位点来得到pNTG。根据报道，pUCNT是由pUC19和 pTrc99A构建而来。为了构建质粒pNTGS1，两个合成引物(引物 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and 引物 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC)，包括了S1基因作为模板。Pcr产物片段被EcoRI和SalI双酶切然后被插入到pntg的EcoRI-SalI酶切位点得到pntg1.质粒pNTS1G, pNTGS1或者 pNTG都是导入大肠杆菌HB101.

Plasmid pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about 0.9 kb including the GDH gene. To construct plasmid pSTVG, this fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSTV28. Plasmid pSTVG was transformed into E. coli HB101.

质粒pGDA2被EcoRI 和 PstI双酶切得到包含GDH基因的0.9kb大小的DNA片段。为了构建pSTVG质粒，这个片段被插入到pSTV28质粒的EcoRI-PstI的酶切位点。pSTVG质粒被导入到E. coli HB101。

Medium and cultivation

The 2×YT medium comprised 1.6% Bacto-tryptone, 1.0% yeast

extract, and 0.5% NaCl, pH 7.0. E. coli HB 101 carrying pNTS1,

pNTG, pNTS1G, or pNTGS1 was inoculated into a test tube containing

2 ml 2×YT medium supplemented with 0.1 mg/ml ampicillin,

followed by incubation at 37 °C for 15 h with reciprocal shaking.

This preculture (0.5 ml) was transferred to a 500-ml shaking

flask containing 100 ml 2×YT medium. The cells were cultivated

at 37 °C for 13 h with reciprocal shaking. E. coli HB101 carrying

pNTS1 and pSTVG was similarly cultivated in 2×YT medium

supplemented with 0.1 mg/ml ampicillin and 0.1 mg/ml chloramphenicol.

培养基和培菌

2*YT培养基 包含有1.6%细菌用胰蛋白胨，1.0%酵母提取物，0.5% NaCl，pH7.0.

携带有pNTS1,pNTG, pNTS1G, 或 pNTGS1的大肠杆菌HB101被接种到有0.1mg/ml氨苄青霉素的2ml的2*YT培养基，37°C摇床15小时。将0.5ml菌液接种到100ml2*YT培养基的500ml烧瓶中。在37°C摇床培养13小时。携带有pNTS1 和 pSTVG质粒的大肠杆菌HB101在2*YT培养基中培养方法相似，只是培养基中要加入0.1 mg/ml的氨苄青霉素和 0.1 mg/ml的氯霉素。

Preparation of cell-free extracts and the enzyme assay

Cells were harvested from 100 ml of culture broth by centrifugation, suspended in 50 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), and then disrupted by ultrasonication. The cell debris was removed by centrifugationthe supernatant was recovered as the cell-free extract. Carbonyl reductase S1 activity (COBE-reducing activity) was determined spectrophotometically as follows: The assay mixture consisted of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.1 mM NADPH, and 1 mM COBE. The reactions were incubated at 30 °C and monitored for the decrease in absorbance at 340 nm. The assay mixture for GDH activity consisted of 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), 100 mM glucose, and 2 mM NADP+. The reactions were incubated at 25 °C and monitored for the increase in absorbance at 340 nm. One unit of S1 or GDH was defined as the amount catalyzing the reduction of 1 μmol NADP+ or oxidation of 1 μmol NADPH per minute, respectively. Protein concentrations were measured with a protein

assay kit containing Coomassie brilliant blue (Nacalai Tesque, Japan),

using bovine serum albumin as the standard (Bradford 1976).

无细胞抽提液和酶鉴定

将100ml培养液离心收获菌体，用50ml0.1mol/LpH为6.5的磷酸缓冲液悬浮，然后超声粉碎。细胞碎片通过离心可以去除，收集上层清液就是无细胞抽提物。碳酰还原酶S1的活性由分光光度计测量如下：测定的混合物包括：0.1mol/LpH6.5的磷酸二氢钾缓冲液，0.1mMNADPH和1mMCOBE。反应在30°C条件下反应，并且随时监测其在340nm处的吸光值。测GDH混合物包括：1M pH 8.0的Tris-HCl的缓冲液，100mM的葡萄糖，2mM的NADP+。反应在25°C下进行，监测其在340nm处的吸光值。一个单位S1或GDH被定义为每分钟催化还原1μmol NADP+或氧化1 μmol NADPH的量。蛋白质的测定通过含有考马斯亮蓝的蛋白质测定试剂利用牛血清白蛋白作为标准进行测定。

Study of enzyme stability

One milliliter of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing the cell-free extracts of E. coli HB101 carrying pNTS1 (S1: 20 U/ml) was mixed with an equal volume of each test organic solvent in a closed vessel. After the mixture was shaken at 30 °C for 48 h, the remaining enzyme activities in an aqueous phase were assayed as described above. The mixture, containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), S1 (20 U/ml), and various concentrations of CHBE, was incubated at 30 °C for 24 h in order to study the enzyme’s stability in the presence of CHBE.The remaining enzyme activities were assayed as described above.

酶稳定性的研究

一毫升含有含有pNTS1质粒的E. coli HB101的无细胞抽提液的100mM磷酸氢二钾缓冲液（pH6.5）与等体积的有机溶剂混合。混合物在30 °C震摇48小时后，水相中残留的酶活力即是上述的酶活力。

COBE reduction with E. coli cells expressing the S1 gene and E. coli cells expressing GDH genes in a two-phase system reaction

The reaction mixture comprised 15 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG, 17 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTS1, 1.6 mg NADP+, 4 g glucose, 2.5 g COBE, 25 ml n-butyl acetate, and about 25 mg Triton X-100. The pH of the reaction mixture was controlled at 6.5 with 5 M sodium hydroxide. At 2 h, 1.25 g COBE and 2.5 g glucose were added to the reaction mixture. To compare the reaction by E. coli transformant coexpressing the GDH and S1 genes, 30 ml culture broth of E. coli

HB101 carrying pNTS1G was used instead of culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG and E. coli HB101 carrying pNTS1. Other components and the procedure were the same as described above.

表达S1基因和GDH基因的大肠杆菌细胞在两相反应体系中的还原反应

混合物包含有带有pNTG质粒的大肠杆菌HB101的菌液15ml，pNTS1质粒的大肠杆菌HB101的菌液17ml，1.6 mg NADP+，4 g葡萄糖，2.5g的COBE，25ml的n-butyl acetate丁酰醋酸盐和大约25mg的聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。用5M的NaOH溶液将pH控制在6.5。在反应两小时后，加入1.25gCOBE和2.5g葡萄糖到该混合物中。比较大肠杆菌转化细胞共表达GDH和S1基因，携带有pNTS1G质粒的大肠杆菌HB10130ml菌液取代了携带有pNTG和pNTS1质粒的大肠杆菌HB101菌液。其他的成分和步骤和上述的方法相似。

COBE reduction to (S)-CHBE in a two-phase system reaction

The reaction mixture contained 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, 3.2 mg NADP+, 11 g glucose, 10 g COBE, 50 ml n-butyl acetate, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C, and the pH was controlled at 6.5 with 5 M sodium hydroxide. Five grams of COBE/5.5 g glucose and 10 g COBE/11 g glucose were added to the reaction mixture at 3 h and 7 h, respectively3.2 mg NADP+ was added at 26 h.

COBE在两相系统中还原生成（S）-CHBE

反应混合物包含50ml E. coli HB101转化细胞的培养液，3.2mgNADP+,11g

葡萄糖，10gCOBE，50ml丁酰醋酸，和大概50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100.

在30°C温度下将其混合均匀，并用5M的NaOH溶液将pH控制在6.5。在第3小时加入5gCOBE和5.5g葡萄糖或者在第7小时加入10gCOBE和11g葡萄糖，分别在第26小时加入3.2gNADP+。

COBE reduction to (S)-CHBE in an aqueous system reaction

The reaction mixture was made up of 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, 3.1 mg NADP+, 11 g glucose, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C. Fifteen grams of COBE was fed continuously by means of a micro-feeding machine at a rate of about 0.02 g/min for about 12 h. The pH of the reaction mixture was controlled at 6.5 with 5 M sodium hydroxide. The reaction mixture was extracted with 100 ml ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then evaporated in vacuo.

COBE在水相中还原成(S)-CHBE的反应

反应的体系是由50ml大肠杆菌HB101转化细胞的菌液，3.1mgNADP+，11g葡萄糖和大约50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。反应混合物在30°C15mg的COBE通过微量添加机器以0.02 g/min的速率连续12小时恒定的加入到体系中。用5M的NaOH溶液将pH控制在6.5。反应混合物用100ml乙酸乙酯萃取。有机层用无水硫酸钠吸干，并在真空中脱水。

Analysis

The organic layer was obtained on centrifugation of the reaction mixture and was assayed for CHBE and COBE by gas chromatography. Optical purity of CHBE was analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC), as described previously (Yasohara et al. 1999).

Enzymes and chemicals

Restriction enzymes and DNA polymerase were purchased from

Takara Shuzo (Japan). COBE (molecular weight: 164.59) was purchased

from Tokyo Kasei Kogyo (Japan). Racemic CHBE (molecular

weight: 166.60) was synthesized by reduction of COBE with

NaBH4. All other chemicals used were of analytical grade and

commercially available.

分析

离心反应混合物得到的有机层通过气相色谱法测定其CHBE和COBE。COBE的光学纯度如前所述通过高效液相色谱法进行分析。

酶和化学试剂

限制性内切酶和DNA聚合酶由takara公司购得，COBE（分子量：164.59）由东京Tokyo Kasei Kogyo公司购得，消旋体CHBE（分子量166.6）通过COBE及NaBH4合成。所有其他化学试剂都是分析等级和商业化的试剂。

Construction of E. coli transformants overproducing S1 and GDH

To express the carbonyl reductase S1 and GDH genes in the same E. coli cells, four expression vectors were constructed (Fig. 1). Plasmids pNTS1G and pNTGS1 contain the S1 gene from C. magnoliae, the GDH gene from B. megaterium, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. Plasmid pNTS1 contains the S1 gene, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. The enzyme activities in cell-free extracts of the E. coli transformants are shown in Table 1. E. coli HB101 cells carrying the vector plasmid pUCNT had no detectable S1 or GDH activity. E. coli HB101 carrying either pNTS1G or pNTGS1 showed S1 and GDH activity without isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. The S1 activities of these two transformants were lower than the GDH activities. To obtain a transformant whose S1 activity was equal to or greater than the level of GDH activity, we used a lower copy vector, pSTV28 (Homma et al. 1995Takahashi et al. 1995), to express the GDH gene. It may be possible to raise the S1 activity by lowering the GDH activity. Plasmid pSTVG contains the GDH gene, the lac promoter, the chloramphenicol resistance gene, and the replicative origin derived from pACYC184 for compatibility with the plasmid pNTS1. In E. coli HB101 carrying pNTS1 and pSTVG, the S1 activity was higher than the GDH activity, but this GDH

level may be too low to regenerate in a COBE reduction reaction as described below.

过产生S1和GDH的大肠杆菌转化细胞的构建

为了在同一大肠杆菌细胞中表达碳酰还原酶S1和GDH基因，要构建四个表达型载体。质粒pNTS1G 和 pNTGS1包含有来自C. magnoliae的S1基因，来自B. megaterium的GDH基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子，质粒pNTS1包含有S1基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子。在大肠杆菌转化细胞的无细胞抽提物的酶活力如表一所示。携带有运输质粒pUCNT的大肠杆菌细胞无法检测到其S1和GDH活性。携带有pNTS1G 或 pNTGS1质粒在没有IPTG的诱导下有S1和GDH的活性。在这两个转化菌种中，S1的活力小于GDH的活力。为了得到S1活性等于或者大于GDH的大肠杆菌转化菌株，我们使用低拷贝的载体pSTV28，来表达GDH基因。它可能可以通过降低GDH的活性从而提高S1的活性。质粒pSTVG包含有GDH基因，lac启动子，和氯霉素抗性基因，以及与pNTS1具有相容性的从pACYC184得来的复制起始位点。在携带有pNTS1和pSTVG的大肠杆菌转化细胞中，S1的活性要高于GDH的活性，但是GDH的活性可能会太低而在COBE还原反应中不能再生。

太长了，字数有限制，所以不能发完。分数我无所谓啦，我很少登录的。这应该算是基因工程的吧，是我以前自己翻的，不是很好。如果你要的话可以联系我的邮箱。iamecho23@163.com