辛酸硫酸铵纯话抗体时为什么加辛酸搅拌至乳白色

单克隆抗体的纯化现在有很多种方法，主要还是要根据你后面实验的需要选择合适的纯化方法！目前用的比较多的是辛酸-硫酸铵沉淀法！该方法较硫酸铵沉淀法来讲，纯化的效果更好并且单抗纯化后的效价不会受很大的影响，操作也相当简便！如果你不需要很纯的单抗的话，建议考虑用此纯化方法！另外亲和层析法也叫常用，一般通过过亲和层析柱，其优点是该方法操作更简便快速，但其需要购买柱子，且价格比较昂贵，同时现在的柱子一般一般只能纯化IgG，对IgG的吸附率为90%～98%，IgM为2%～30%，IgA为1.5%～20%。故只有当你的单克隆抗体亚类为IgG时才能通过过柱层析。此方法纯化后的单抗纯度很高，基本没有杂蛋白，但其目的蛋白损失也较大。其中还有其它的纯化方法，可去查文献了解！！

分别采用辛酸硫酸铵法(CAAS)、硫酸铵沉淀法(AS)和DEAE离子交换层析法对小鼠IgG腹水进行了纯化效果的比较.结果表明: CAAS法提取IgG的纯度为67-5﹪,高于AS法(43-2﹪),低于DEAE法(100﹪)CAAS法提取IgG的回收率为51-2﹪,远高于DEAE(8-9﹪),略低于AS法(63-8﹪).将不同纯化方法获得的IgG定容至相同浓度.ELISA试验结果表明EAE法的OD值明显降低,表明DEAE纯化方法降低了IgG的免疫学活性.说明CAAS法是一种操作简单、成本低、纯化效果和回收效果较佳的提取小鼠腹水IgG的首选方法.

阴离子交换层析法纯化gp130单克隆抗体B-S12

Purification of monoclonal antibody B-S12 from mouse ascites by strong anion exchange liquid chromatography

<<中国免疫学杂志 >>2006年08期

马泓冰 , 徐颖 , 夏瑜 , 朱一蓓 , 庄羽美 , 郁健峰 , 张学光

目的:建立一种从小鼠腹水中获得高纯度、活性好、纯化过程易于放大的抗gp130单克隆抗体B-S12的纯化方法.方法:经硫酸铵沉淀等预处理后的腹水样品,在阴离子交换层析柱上进行分离纯化,用MTT法检测纯化后抗体的生物学活性.结果:腹水样品经硫酸铵沉淀、PBS复溶,用pH 7.0、20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液稀释10倍后上强阴离子交换层析柱,NaCl梯度洗脱,可获得纯度大于95﹪的B-S12抗体,回收率达73﹪,在体外对XG-2细胞有明显的促增殖作用.结论:建立了快速高效从小鼠腹水中纯化B-S12的方法,为该抗体的进一步应用提供了必要的实验基础.

2006年 10期《黑龙江畜牧兽医》

Heilongjiang Animal Science And veterinary Medicine

起止页码：14-16

国际标准刊号：ISSN 1004-7034

国内统一刊号：CN 23-1205

小鼠腹水IgG类单克隆抗体纯化方法的研究

周玉[1] 李岩松[2] 潘风光[2] 谭建华[3] 柳增善[1] 王哲[4]

摘　要:分别采用辛酸-硫酸铵法（CA—AS）、硫酸铵沉淀法（AS）和DEAE离子交换层析法对小鼠IgG腹水进行了纯化效果的比较。结果表明：CA—AS法提取IgG的纯度为67．5％，高于AS法（43．2％），低于DEAE法（100％）；CA—AS法提取IgG的回收率为51．2％，远高于DEAE（8．9％），略低于As法（63．8％）。将不同纯化方法获得的IgG定容至相同浓度。ELISA试验结果表明：DEAE法的OD值明显降低，表明DEAE纯化方法降低了IgG的免疫学活性。说明CA—AS法是一种操作简单、成本低、纯化效果和回收效果较佳的提取小鼠腹水IgG的首选方法。[著者文摘]

关键词:小鼠腹水IgG 辛酸 硫酸铵 离子交换层析

小鼠腹水抗体的制备

1．抗原的处理与小鼠腹水粗抗体的收集

现在以B亚基的抗体制备为例说明：

取2mg的蛋白，溶于100µl的10％SDS中，加入等体积的上样缓冲液，沸水浴3min，进行SDS－PAGE。

将胶的两边缘切带染色，脱色后在相应的位置从分离胶上切下未染色目的蛋白带，无菌水洗涤，用匀浆器匀浆后，再在2～5mM的PBS中透析5h以上，冷干。

将冷干的样品用500～800µl 的2mM～5mM的PBS溶解（得到体积约600～1000µl）,加入等体积的弗氏完全佐剂，大约乳化2h～3h。确保乳化完的蛋白浓度为0.5~1.0mg/ml。将乳化好的混合液用1ml的一次性注射器注射小鼠，每只50～100µl，即50～100µg的抗原蛋白。

第一次加强注射：10～14天后将制备的样品用弗氏不完全佐剂乳化，同样注射小鼠。

第一次加强注射后10天左右，用小鼠的血清，通过酶联免疫的方法（ELISA）测定腹水抗体效价来检测抗体的存在。

第二次加强注射：如果ELISA得到阳性的结果，用弗氏不完全佐剂乳化抗原，再次注射小鼠，并在注射后的2～3天后注射H22腹水瘤细胞，每次注射量再1.5×106~2.0×106个细胞，7天后产生腹水。如果两周后小鼠仍无腹水，再次注射抗原以及瘤细胞。

收集腹水，每只小鼠可以收集几次，每次3～10ml不等，收集腹水至小鼠死亡。腹水中加入0.01%的叠氮化钠以防止长菌，再在12000rpm离心2次，保留上清。测定效价后，进行抗体的纯化，分装，－70°C保存。

[注]：（1）在SDS-PAGE时，分离胶中加入300µl SDS，浓缩胶中加入200µl SDS，以确保SDS足量。

（2）在制备蛋白样品过程中会损失一部分抗原大约25％～50％

（3）收集的小鼠腹水要分装到小指管中，不同的小鼠产生的腹水效价不同，做好标记。

2．抗体纯化

用1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)调节粗制抗体的pH值。

用0.1mol/L Tris(pH8.0)平衡柱子。

将抗体溶液用蛋白G微珠层析柱过滤，每次上2ml的样品。

用10倍体积的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。

用10倍体积的0.01mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。

用2ml的50mmol/L 甘氨酸(pH3.0)洗脱滤柱。收集洗脱峰于装有1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)的试管内，轻轻摇匀。

用10倍体积的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。重复以上过程。

测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE检测抗体的纯度。

[注]：配Tris与甘氨酸溶液用盐酸来调pH值

3．酶联免疫检测抗体的效价（ELISA）

用包被液稀释抗原至50～100µg/ml，加入酶标板中，每孔100µl ，4°C过夜

用洗涤液清洗酶标板3次，每次在摇床上摇5min～8min，37°C下用封闭液封闭酶标板4h以上。

待测的腹水抗体按1：1000～1：128000稀释，分别加入孔中，每孔100µl，37°C孵育2h ，再用洗涤液清洗3次。

将辣根过氧化物酶标记的二抗按照1：1000稀释，每孔加入每孔100µl，37°C孵育1h ，再洗涤3次。

加入辣根过氧化物酶显色液100µl，显色5min后，加入终止液100µl，终止显色。

以不注射抗原的小鼠腹水为阴性对照（也要相应于含抗体的腹水稀释），以只加显色液与终止液的孔为空白对照，用酶标仪测定492nm波长下的吸收值，确定抗体的效价。

所用试剂：

包被液：0 .50g Na2CO3，0.4g NaHCO3 ，200ml，pH9.6

PBS ：10mmol/LNaH2PO4, 10mmol/LNa2HPO4,150mmol/LNaCl，pH7.4

封闭液：3％BSA溶于PBS中

洗涤液：0.05~0.1％Tween-20溶于PBS中

底物缓冲液：0.1mol/L柠檬酸，0.2mol/LNa2HPO4，pH5.0，用时每10ml的缓冲液加入4mgOPD(邻苯二胺)以及20µl 30％H2O2

终止液：2mol/L H2SO4

[注]：（1）在洗涤时应当确保充分，否则会出现阴性对照的值偏大。

（2）空白对照最好做一排孔（8个或12个）。

（3）底物缓冲液要现用现配。

目的研究制备抗玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）单克隆抗体免疫亲和柱（IAC）。方法用辛酸硫酸铵法纯化抗ZEN单克隆抗体，将纯化好的单抗与溴化氰活化的4FF葡聚糖偶联制备抗ZEN单克隆抗体免疫亲合柱。采用紫外扫描鉴定偶联反应，间接竞争酶联免疫吸附法及高效液相色谱法（HPLC）对制备好的免疫亲合柱进行评价。结果每根抗ZEN单克隆抗体免疫亲和柱，使用0．5ml溴化氰活化的4FF葡聚糖，350ugZEN单克隆抗体，柱容量为0．40ug。小麦样品添加ZEN标品60—300ug／kg，回收率76．33％-90．10％，相对标准偏差6．68％-10．93％。使用本实验室制备的抗ZEN单克隆抗体免疫亲合柱建立了IAC．HPLC方法，并检测小麦、玉米、饲料样品30份，结果有17份样品为阳性，阳性率56．67％，样品中ZEN含量为31．33～377．84ug／kg；信噪比为3：1时，检测下限为10．00ug／kg。结论抗ZEN单克隆抗体免疫亲和柱能快速特异地将ZEN从样品中分离出来，并同时完成净化和浓缩步骤，是一种简便的净化方法。

从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。如果用于免疫标记测定，须分离和纯化。可用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，进行初步浓缩和纯化；可用亲和层析法进一步纯化。

一、腹水型单抗的纯化

在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。

1、二氧化硅吸附法

新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

2、过滤离心法

用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。

3、混合法

即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。

二、单抗的粗提

1、硫酸铵沉淀法

（1）饱和硫酸铵溶液的配制

500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。

（2）盐析

吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。

（3）脱盐

常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% NaOH 50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

（4）蛋白质含量的测定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数；或（Pr）=OD280×稀释倍数/1.3

（5）分装冻存备用

2、辛酸-硫酸铵沉淀法

该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125um），加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。

3、优球蛋白沉淀法

该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃ 8-15小时（若是IgG3单抗，也可室温2小时），其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml，分装冻存备用。

三、单抗纯化的方法

单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。

1、离子交换层析：

分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素) 和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来

2、凝胶过滤法：

一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时，大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小，小分子则在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。

缺点：从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。

3、免疫亲和层析法：

是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低。

用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析法则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。