请教6M盐酸胍溶液的配置问题

氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取rna时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离.dna提取过程

有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和dna脱离,dna进入水相.但是在rna的提取过程就要避免蛋白和dna脱离,否则dna会释放到水相.不管有酚也好,没有酚也好,氯仿本身也对蛋白有变性作用,剧烈的震荡,很容易使得dna的亲水基团,与水相接触.所以不要剧烈震荡.

异丙醇的作用是通过-oh的疏水作用使得rna

或者dna链中的亲水基团受到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾.

氯仿的作用有多个方面,一是作为有机溶剂变性蛋白,使其沉淀并通过离心除去,同时也通过变性作用抑制rnase活性；二是rna提取试剂中通常含有苯酚（trizol主要成分就是苯酚,很多自己配试剂提的方法也用苯酚,抽提蛋白时也会用到苯酚）,苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去会损伤核酸,需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等）,起到一定除杂作用

通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25）,减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫,影响后续操作,不过个人经验感觉加不加没什么太大区别,也许是我的样品里蛋白不多吧

异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样.只不过用量少一点,0.6v~1v就够了,不像乙醇沉淀需要至少2v,一般需要2.5倍体积.在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀.不过感觉效果不如乙醇,偶尔会有沉淀不出来东西的时候

一、植物组织蛋白质提取方法(summer)

1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。

3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清夜，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml

1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml

2、甘油(Glycerol)75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

二、

植物组织蛋白质提取方法 (summer)

三氯醋酸—丙酮沉淀法

1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1 小时)，然后真空

干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小

时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

药品：

提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮

裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M 的

DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

三、

组织：肠黏膜 (newinbio)

目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达

应用TRIPURE 提取蛋白质步骤：

含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

倒转混匀，置室温10min

离心：12000 g，10min，4度，弃上清

加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE 用量)

振荡，置室温20min

离心： 7500g，5 min，4 度，弃上清

重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次

沉淀中加入100％乙醇 2ml

充分振荡混匀，置室温20 min

离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

1％SDS溶解沉淀

离心：10000g，10min，4度

取上清-20 度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)

存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测

浓度，含量才1mg/ml左右。

解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。

四、

lysis solution:(yog)

Protein extraction buffer (Camiolo buffer):

100 ml= (0.075M Potassium Acetate) 0.736g

(0.3M) NaCl 1.753g

(0.1M) L-arginine basic salt 1.742g

(0.01M) EDTA-HCl 0.292g

(0.25%) Triton X-100 250. ul

up to 100 ml with dH20. pH 7.4. Then 0.2 um filter.

1. Freeze tissue in liquid nitrogen.

2. Rinse in PBS then mince.

3. Add 1 ml Camiolo extraction buffer per 100 mg of tissue.

4. Homogenize for 1 minute at 4\\'C.

5. Spin at 3,000. rpm/15 minutes/4\\'C.

6. Remove supernatant and save in another tube.

7. If necessary, dialize the supernatant against PBS with

50mM/L Tris-HCl pH 7.4.

五、

植物材料：水稻苗，叶鞘，根(ynibcas)

1、200 毫克样品置于冰上磨碎

2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min 取上清

3、重复离心5min

lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

六、

蛋白质样品制备(sigma)

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等(1986)的方法进行。

100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三

氯乙酸(丙酮配制，含10mM 即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min离心15

min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1 小时，同上离心弃上清，

(有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，

2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅

动几次，28度 (温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点

越好！上清即可上样电泳。或者-70 度保存

七、

植物根中蛋白质的抽取(phenol)

(1) sample, 液氮研磨

(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube

(3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul

(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite

(5) 取上层液，蛋白质就在里面

八、

SDS extraction followed by acetone precipitation – simple extraction protocol that does not require phenol.

Recommended start protocol for whole tissue extractions.(hgp)

1. Grind 1 g of fresh tissue to a powder with liquid nitrogen in a mortar and pestle.

2. Add 5 mL of extraction media (0.175 M Tris-HCl, pH 8.8, 5% SDS, 15% glycerol, 0.3 M DTT) directly to

mortar and continue grinding for an additional 30 sec.

3. Filter homogenate through two layers of miracloth into a 50 mL Falcon tube at room temperature.

4. Immediately add 4 volumes of ice cold 100% acetone to filtered homogenate, mix by vortexing and place at -20

C for at least one hour to precipitate proteins.

5. Centrifuge at 5000 g for 15 min to collect precipitated protein, decant supernatant.

6. Gently blot residual acetone from container with Kimwipe and then wash pellet in 15-20 mL of cold 80%

acetone. Be sure to thoroughly break-up pellet by pipetting, vortexing or sonication.

7. Repeat steps 5 and 6.

8. Collect final protein precipitate by centrifugation at 5000 g for 15 min and dry pellet by inverting on Kimwipe

for 15 min at 37 C.

9. Resuspend final pellet in 0.5-1 mL of IEF extraction solution (8 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 2% Triton

X-100, 50 mM DTT, 0.2% pH 3-10 ampholytes) by pipetting and vortexing at 25-30 C. Incubate sample for 1 h at

room temperature with agitation. Do not heat sample under any circumstances as this will lead to carbamylation of

proteins.

10. Centrifuge for 10 min at 12000 g and use supernatant to rehydrate IPG strips.

11. If protein quantitation is necessary, precipitate protein sample with TCA or acetone prior to performing

Bradford or Lowry assay as detergents and reducing agents interfere with these assays.

Phenol extraction followed by methanolic ammonium acetate precipitation – an effective protocol for sample

preparation from protein-poor, recalcitrant tissues such as plants (see Hurkman and Tanaka, 1986, Plant

Physiology 81:802-80

九、

材料：细菌蛋白(puc18)

用甲醇提取的，冻干后用缓冲液溶解的。样品缓冲液是一般的。其中含又2%的SDS，20mmol 的2-巯基乙

醇。

十、

线粒体蛋白的提取 (bioon)

Isolation for Mitochondria

Modification by Bioon

Materials and reagents:

homogenizing buffer:

100 mM mannitol

10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)

5 mM MgCl2

关 于 蛋 白 质

1 mM EGTA

1 mM DTT

leupeptin (0.1 ug/ml)

0.1M Na2CO3

Methods:

- 10*6 Cells were washed with ice-cold PBS and lysed by homogenizing in 1 ml buffer (ice-cold) containing 100

mM mannitol, 10 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, leupeptin (0.1 ug/ml)

- Subjected to Polytron homogenization for three-four bursts of 3-10 s each at a setting of 6.5.

- Intact cells and nuclei were separated by centrifugation at 120 g for 5 min at 4℃

- Supernatants were centrifuged at 10,000 g for 10 min to collect the heavy (mitochondrial) membrane pellet.

- Cytoplasmic fractions were obtained by centrifuging supernatants at 100,000 g for 30 min.

- Resuspended pellet to 0.25mg/ml in fresh preparation of 0.1M Na2CO3 (pH 11.5)

- Incubated on ice for 30 min.

- Ultracentrifugation at 100000g for 1h at 4℃ to precipitate the mitochondria membrane protein. And the

supernatants are mitochondrial matrix. 0.5mg of proteins in mitochondria can get 100ug of proteins (the

alkali-resistant fractions)

Ref.: PNAS, 2002，99：12825–12830

本方法只适用于提大鼠细胞线粒体蛋白，而不适用于线粒体功能检测

巨细胞病毒（Cytomegalovirus）是一种疱疹病毒组DNA病毒。亦称细胞包涵体病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体。

巨细胞病毒分布广泛，其他动物皆可遭受感染，引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。

扩展资料：

一、防治原则

丙氧鸟苷(ganciclovir DHPG）有防止CMV扩散作用。如与高滴度抗CMV免疫球蛋白合用，可降低骨髓移植的CMV肺炎并发症死亡率，如果耐丙氧鸟苷的CMV感染可选用磷甲酸钠，虽能持久地减少CMV扩散，但效果比前者差。

国外研制CMV病毒活疫苗，能诱导产生抗体，但排除疫苗的致癌潜能，有待解决

二、预防保健

1、进行有意识的身体素质的锻炼。提高机体免疫机能及抗病能力，特别是育龄期妇女，以减少巨细胞病毒对胎儿的严重危害。

2、对于孕妇或有慢性消耗性疾病、免疫力低下等患者要注意保护，使她们远离传染源。

3、注意环境卫生、饮食卫生。

4、乳汁中巨细胞病毒阳性者，不应哺乳。

5、免疫防治，尚在研究和探索中。CMV引起细胞内感染后，灭活疫苗无明显预防的作用。怀孕早期发现有CMV原发感染及/或羊水细胞中有CMV抗原时，应中止妊娠。减毒活疫苗可使被接种者产生抗体。并产生对CMV的细胞免疫，减少症状性CMV感染的发生。

CMV高价免疫球蛋白对血清CMV阴性的骨髓移植受者的症状性CMV感染，有一定的保护作用，但不能预防再感染。在接触患儿尿液或唾液后应仔细洗手，以预防后天性CMV感染。

参考资料来源：百度百科－巨细胞病毒

1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？

2)RNAgents®总RNA提取系统的工作原理怎样？

3)RNAgents®总RNA提取系统的一般得率是多少？

4)RNAgents®总RNA提取系统的各组分的功能是什么？

5)RNAgents®总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？

6)对初始材料的用量有什么限制？

7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？

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1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？

Promega用于提取总RNA及poly(A)+RNA的系统包括：

：用RNAgents®总RNA提取系统从组织及培养的细胞中提取总RNA。

：用SV总RNA提取系统从组织，血液及培养的细胞中提取总RNA。

：用PolyATtract®mRNA提取系统从总RNA中提取poly(A)+RNA。

：用PolyTtract®ystem1000从组织及培养的细胞中提取poly(A)+RNA。

：用PolyTtract®Series

9600TMmRNA从少量样品中快速提取mRNA（cDNA第一条链的纯化）。

2)RNAgents®提取总RNA提取系统的工作原理怎样？

RNAgents®总RNA提取系统用溶剂法为基础，从多种材料中快速，有效地提取总RNA。

简单而言，有亚硫氢胍及巯基乙醇时，制组织匀浆，可使内源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性。用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇抽提后，RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相。抽提后，用异丙醇将RNA沉淀浓缩。用RNAgents®总RNA提取系统所得RNA纯度好，用途广，适用于PolyATtract®mRNA提取系统。如RNA中必须完全去除染色体DNA，需用1-2个单位的无RNA酶污染的DNA酶处理。然后用65oC加热10分钟，或用苯酚及氯仿抽提使DNA酶失活。

3)RNAgents®总RNA提取系统的一般得率是多少？

得率受多个因素的影响，包括组织来源及培养的细胞数。如提取的RNA量多，可通过光吸收测定（A260读数）来定量RNA，

1OD=40ugRNA。

RNAgents®总RNA提取系统的一般得率

组织

总RNA得率

Hela细胞

1.6mgRNA/10的8次方个细胞

鼠内脏

2.3mgRNA/g组织

鼠脾

8.3mgRNA/g组织

鼠肺

1.9mgRNA/g组织

鼠肾

3.1mgRNA/g组织

鼠肝

8.1mgRNA/g组织

4)RNAgents®总RNA提取系统的各组分的功能是什么？

(1)

变性剂:

柠檬酸钠溶液中含亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸

。可变性细胞内及核蛋白复合物，释放RNA。这些试剂还可有效抑制核酸酶。

(2)

苯酚：氯仿：异戊醇（125：24：1）（pH4.7）:酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。

(3)

乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA所需。

(4)

异丙醇：沉淀浓缩RNA。

5)RNAgents®总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？

苯酚：氯仿：异戊醇的配比是125：24：1，用42mM柠檬酸钠溶液平衡(pH4.3-4.7)。这一配比可有效去除染色体DNA。残留染色体DNA会干扰RT-PCR。

6)对初始材料的用量有什么限制？

最初的设计方案是用作提取比较大量的RNA，RNAgents®总RNA提取系统可从5mg

组织，或5倍10的5次方的细胞中提取RNA。少量RNA提取的步骤可见RNAgents®总RNA提取系统技术手册TB087。初始材料用量的上限是每次用1g组织。

7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？

快速提取RNA用作RT-PCR，可省去在变性溶液中液化和沉淀的步骤。简化的步骤可在90分钟内完成。

http://www.promega.com.cn/files/changjian/rnagents.htm

简称：GITC

外观：白色晶体

熔点：115-120℃。

PH（4％水溶液）:4.5-7.0

紫外线吸收（300nm，6M）:≤0.1 abs单位

紫外线吸收（410nm，6M）:≤0.05abs

干燥失重：≤0.5％＃nsp。

使用异硫氰酸胍溶液需要现配吗？

答：提取试剂基于4M硫氰酸胍的终浓度：4mM柠檬酸钠，0.83％N-月桂基肌氨酸（十二烷基，N-甲基甘氨酸钠），0.2mMβ-CSB缓冲溶液由巯基乙醇制得；混合25 g异硫氰酸胍和33 mL CSB缓冲溶液直至完全溶解，并将溶液在65°C加热以制备变性溶液，将其在4°C下储存直至使用。

因此，不必立即使用异硫氰酸胍溶液，目前市场上有不同浓度的溶液，但长时间放置并不容易，否则会沉淀并需要仔细检查。使用此外，如果一次准备太多，建议分装。

异硫氰酸胍溶液准需要菌了吗？

答：异硫氰酸胍溶液无需灭菌。该溶液不是很稳定，通常将0.1％DEPC水用作裂解液。水已经消毒了。另外，在制备试剂时，所有用于RNA提取的试剂都需要用DEPC水制备，并且优选重新打开试剂并将其专用于RNA。

尽管无需对制备的裂解物进行灭菌，但应注意的是，实验中使用的塑料产品已标记为无Rnase。如果未在未打开的程序包中使用过它们，则可以直接使用它们，而所有其他则必须通过。处理：将DEPC加到双蒸馏水中至终浓度为0.1％，将塑料产品浸泡，然后将厨房通风过夜，然后用铝箔密封，在高温下高压灭菌至少30分钟，然后高压干燥，然后再干燥用。

异硫氰酸胍的毒性？

答：异硫氰酸胍的吸入，食入和皮肤接触可能会造成损害，因此在操作过程中需要穿戴实验室衣服，手套和护目镜。与酸接触时会释放出剧毒的气体，对水生生物有害。有害，可能对水环境产生长期不利影响，因此应避免释放到环境中。

如何处理废液？

答：实验室污染主要包括生物污染和化学污染，按形式可分为废水，废气和固体污染物。其中，生物污染包括生物废物污染和生物细菌毒素污染，化学污染包括有机污染和无机污染。通常，需要对各种废液进行分类。原则上，原始瓶子被回收。如果需要混合，则必须确保混合后试剂不会产生热量，有毒气体，爆炸等。药品的名称和浓度也必须在回收瓶上标出，并且必须统一回收。不得随意丢弃，以免造成环境污染和中毒。

异硫氰酸胍，CAS号：593-84-0，是一种白色结晶性粉末，有刺激性，对光敏感，溶于乙醇和水，熔点118℃。它和尿素、盐酸胍一样，都是强力的蛋白质变性剂，关于他们之间的介绍请查看之前的文章。异硫氰酸胍在变性裂解细胞和核酸提取中，能够迅速溶解蛋白质，导致其细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离，同时它能抑制细胞释放出的核酸酶，抑制RNA酶、防止RNA的降解，使核酸与蛋白质分离，保证核酸一级结构的完整性。然而，在实际的实验操作过程当中，涉及到异硫氰酸胍溶液的配制和使用中，经常会遇到一些问题，本文将对这些问题进行一一解答。

异硫氰酸胍溶液是否需要现用现配？

提取试剂以异硫氰酸胍的终浓度为4M为例：先以42mM柠檬酸钠、0.83%N-lauryl sarcosine(十二烷基，N-甲基甘氨酸钠)、0.2mM β-巯基乙醇制得CSB缓冲液；异硫氰酸胍25g、CSB缓冲液33mL，混合直至完全溶解，可加热在65℃助溶，制得变性液，4℃保存备用。

所以，异硫氰酸胍溶液可以不必非要现用现配，而且目前市场上也有不同浓度的溶液销售，但放置时间不易过长，否则会有沉淀析出，在使用前需要仔细检查；另外，如果一次性配制过多，建议进行分装。

异硫氰酸胍溶液配制好之后是否需要灭菌？

异硫氰酸胍溶液并没有必要灭菌，该溶液并不是非常稳定，而且配裂解液一般要用0.1%的DEPC水，水已经进行过灭菌。另外提取RNA的所有试剂在配制时都需要用DEPC水配制，而且试剂最好为新开启并作为RNA专用。

虽然配制好的裂解液不需要灭菌，但要注意的是，实验中所用到的塑料制品，已经标明Rnase-Free的，如果没有开封使用过，可以直接使用，其他的都必须经过处理：在双蒸水中加入DEPC，使其终浓度为0.1%，将塑料制品浸泡其中，通风厨过夜，之后再用铝箔封住，高温高压灭菌至少30min，干燥备用。

异硫氰酸胍的毒性如何？

吸入，摄入，皮肤接触异硫氰酸胍均可造成损伤，所以操作时需穿好实验服，戴好手套和护目镜；其与酸、碱（氢氧化钠）接触可释放极高毒性气体，建议在通风橱中操作。

使用过后的废液如何处理？

实验室的污染主要有生物性污染和化学污染，按形态大致可分为废水、废气和固体污染物。其中，生物污染包括生物废弃物污染和生物细菌毒素污染，而化学污染包括有机物污染和无机物污染。总体来说，各类废液需进行分类，原则上原瓶回收，如需混装，则需确定试剂混合后不产生热量、有毒气体、爆炸等。回收瓶上也需注明药品名称、浓度，进行统一回收处理，不可随意丢弃，造成环境污染和毒害。

异硫氰酸胍的作用？

除了在生化领域，异硫氰酸胍在新能源领域也有着不容忽视的作用。

根据已公开报道，在新能源领域，异硫氰酸胍主要作为电解质组分用于制备染料敏化太阳能电池和钙钛矿太阳能电池等新型太阳能电池，对于改善电池稳定性能具有重要价值。

程萍[1]等人以离子液体、无机层状材料、异硫氰酸胍等为主要组分，设计了一种准固态电解质，具有组分分布均匀、稳定性好的特点，能显著提高染料敏化太阳能电池的长期稳定性和光电转换效率。

熊娟等人[2]通过掺杂异硫氰酸胍制备了一种高效的钙钛矿太阳能电池，他们通过引入胍盐与硫氰根离子有效提高了钙钛矿电池的光电效率。通过实验证明，在同样放置624小时的前提下，未添加异硫氰酸胍的电池电池效率下降到初始值的约50％，而添加异硫氰酸胍的电池仍可保持初始效率的80％。异硫氰酸胍的加入，大幅度提升了电池的稳定性。另外，异硫氰酸胍的加入能够明显改善电池的回滞现象。

1. 一种准固态电解质及其制备方法与应用 CN101013766A

2. 钙钛矿太阳能电池及其制备方法 CN108987584A

异硫氰酸胍在此次YQ中的作用？

近日，发表在《国际检验医学杂志》上题为《XXGZ病毒核酸和抗体检测临床应用专家共识》的论文中提到，在XXGZ病毒采集过程中，推荐使用带有异硫氰酸胍等病毒灭活剂的采样管，灭活病毒同时提高检出率。那么异硫氰酸胍在XXGZ病毒核酸检测中有哪些作用，又是如何做到灭活病毒并提高检出率呢？

XXGZ病毒是一种RNA病毒，各种RNA病毒的核酸由于自体降解和生物酶介导的降解，是较难稳定保存的生物分子。而异硫氰酸胍是一类强有力的蛋白质变性剂，且具有无RNA酶和DNA酶活性的特点。采样管中加入异硫氰酸胍能够破坏RNA酶的分子结构，使样本中可能存在的核酸酶失活，起到稳定保存病毒样本的作用。

XXGZ病毒核酸检测流程包括采样→保存送样→病毒灭活→裂解核酸提取→检测等流程，异硫氰酸胍在核酸提取环节也发挥至关重要的作用。作为核酸裂解液的主要成分，异硫氰酸胍能迅速破碎病毒，使核蛋白与核酸迅速分离，同时抑制释放出的核酸酶活性，保证核酸一级结构的完整性，提高核酸提取效率。

可见，异硫氰酸胍在XXGZ病毒核酸检测中具有重要价值。

大家有其他关于异硫氰酸胍的问题，也可以在下方评论中留言，我看到后会更新解答。

RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

1．1 分离高质量RNA

成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果。另外，分离poly(A)+RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+RNA会增加检测的灵敏度。

1．2 RNA提取的最大影响因素-RNA酶

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

1．3 常用的RNA酶抑制剂

*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

*其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作

*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。

*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内或污染用具。尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处，扩大污染。

*尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H、T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。

*关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染，买来后可直接用于RNA操作。用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNase，从而导致实验失败。

*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNase的活性。

*配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。

*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

*有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。

*配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

1．5 RNA提取的一般步骤

RNA提取的一般步骤是：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA

破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。

洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

融解RNA一般使用TE。

保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。

1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法

TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

TRIZOL是有毒物，接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤，一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，建议保存在2-8°C的环境下。

巨细胞病毒感染在人群中较广泛，能引起全身各器官组织病变，胎儿、婴儿的严重损害，甚至死亡，并可能与宫颈癌等恶性肿瘤的发生有关。所以了解巨细胞病毒，积极预防巨细胞病毒感染很重要。

[病理学]

[病原体]

CMV又称为涎病毒，属于疱疹病毒亚科，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。由分子量约为150x106的线状双股DNA所组成。其形最大由162个壳粒（capsomer），正20面体构成。有典型的疱疹病毒结构。形态与单纯疱疹病毒及水痘-带状疱疹病毒非常相似，不易区别。

CMV只能在人纤维母细胞的组织培养中增殖，而不能在其他动物细胞中生长，增殖非常缓慢，其复制周期为36-48小时，比单纯疱疹病毒复制周期8小时要长得多。初次分离需一个多月才能出现特殊的细胞；细胞变园，膨胀，细胞及核巨大化，核周围出现一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。在活体中的靶细胞主要是上皮细胞。人类CMV各株之间有广泛交叉反应。

CMV在20%乙醚中最多存活2小时。pH<5时，或置于56℃30分钟，或紫外线照射5分钟可被充分灭活。CMV的感染性对冻融或存于-20℃或-50℃均不稳定，10%的家用漂白粉可使其感染性明显降低。

CMV感染的特征时出现有典型的胞浆及核内包涵体的巨大细胞，故又名巨细胞病毒。它在人体组织中可形成肥大的细胞，引起巨细胞包涵体病。

发病机理

初次感染后，CMV将在宿主细胞中无限期存在成潜伏状态。可能累及多种组织器官，尸检提示肺、肝、胰、唾液腺、中枢神经系统及肠也可能是病毒潜伏场所。先天性感染的严重程度，与缺乏产生沉淀抗体的能力和T细胞对CMV的应答有关。儿童和成年人感染CMV后，在外周血中出现具有抑制细胞毒表型的活化T淋巴细胞，如果宿主的T细胞功能受损，潜伏的病毒就可能复活并引起多种症候群。组织移植后发生的慢性刺激，为CMV活化，诱发疾病提供了条件。某些针对T细胞的强烈免疫抑制剂如抗胸腺细胞球蛋白，与临床CMV症候群高发率有关。此外，CMV在功能上可作为辅助因子，使潜伏感染的HIV活化。

传染源

传染源是病人及其急性带毒者。已发现在血液、唾液、眼泪、尿液、精液、粪便、子宫颈和阴道分泌物、乳汁等中存在CMV。病毒可由乳汁、唾液及尿排出，可持续数周到几年。

易感人群

CMV遍布世界各地，人对其有广泛的易感性。人是CMV的唯一宿主。

血清学调查表明：40-100%成人有CMV抗体，其流行无季节性倾向。

不同国家及不同经济状况感染率不同。在亚洲和非洲90%的人口受感染，其中大多数人在青少年时期即有抗体，说明感染年龄较早，而西方国家其感染发生较晚。调查还表明，低经济收入人群较高经济收入人群感染率高。70岁左右人群比20岁左右人群抗体阳性率高。女性易感年龄在20-30岁，男性则在35岁以后，到50-60岁，男女之间抗体阳性率基本相同。虽然体内已经产生循环抗体，但病毒仍能够持续或间断排除，因此是致慢性或隐性感染。

多数人一生中都感染过CMV，但主要为无症状的亚临床感染。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。病毒往往以潜伏感染的形式持续终生，只有当宿主免疫状态失去平衡，如器官和骨髓移植、癌症、数学、妊娠以及应用免疫抑制剂等时，潜伏的病毒才复活。潜伏病毒的复活和无症状的携带者都能引起病毒的传播。如因器官移植而接受免疫抑制剂治疗者，常因所供器官和输入血液中有潜伏病毒，或免疫抑制使潜伏的病毒活化而发病，艾滋病患者的CMV感染发病率高。

传播途径

巨细胞病毒的传播途径有：

(1)先天性感染（宫内感染）：妊娠期，巨细胞病毒可通过胎盘传播给胎儿。

(2)获得性感染（围产期感染）：分娩时，如宫颈分泌物中有病毒，可经产道传播给新生儿。

(3)在产后，乳汁中可分泌病毒，所以在母乳喂养时可直接传播给婴儿。

(4)与排毒者长期接触，可经唾液、尿、眼泪等传播。

(5)同源性CMV感染：可经输血、器官移植等传播。同源性CMV感染是输血和器官移植的一种严重危害，多次输血或一次大量输血使原发和再发感染的危险性增高，输入含白细胞血液的危险性更高，器官或骨髓移植术后CMV感染率也高。

(6)性交传播：因为病毒常常存在于泌尿生殖道的分泌物、精液或宫颈分泌物中，所以通过性交可直接传播。

多从精液，宫颈分泌物，泪液及粪便（口腔性欲，吻肛）感染所致。 CMV感染途径（环）表 表1

母亲 胎儿 新生儿 婴幼儿 小儿，成人

阴道感染，接触感染

（唾液、尿等）

输血

肝 炎

呼吸道感染 隐性感染

肝炎

呼吸道感染

→成熟不良儿 体重增长慢 (免疫抑制剂等诱发) 肺炎

胃肠道粘膜

肝 炎 病毒血症

┌→无侵袭

│

└→感染 —— →病毒尿阳性的健康新生儿 传染性单核细胞增多症 传染性单核细胞增多症

传染性单核细胞

增多症样疾患 →病毒尿、肝功障碍

一过性血小板减少

隐性感染 输血

不明热

无症状感染

→全身性巨细胞包涵体病

↓

即或成活也出现智能障碍等体征

[免疫学]

CMV感染可引起机体的免疫功能降低，特别是细胞免疫功能下降。CMV感染对胸腺发育及脾细胞、单核吞噬细胞、NK细胞及CTL细胞的功能有着显著的影响。

一、对胸腺、脾脏的影响

实验室急性CMV感染的新生豚鼠，胸腺发育受抑，T细胞数减少，成年鼠感染CMV后，88%胸腺可检出CMV。

CMV感染致脾功能受影响，脾脏淋巴细胞对conA刺激的增殖下降，脾细胞产生的IL-2显著降低。

二、对免疫细胞的影响

CMV感染引起的免疫抑制与病毒在细胞内的复制有关。CMV可以在单核吞噬细胞、T细胞、B细胞及一些尚未确定的单核细胞中复制，其中单核吞噬细胞最易感染CMV，淋巴细胞在免疫反应中具有重要的调节功能和效应功能。CMV感染后，可引起淋巴细胞的多种免疫功能受损。

CMV感染多表现为急性单核细胞增多症。外周血淋巴细胞对有丝分裂原、CMV抗原和HSV抗原增殖反应减弱，诱导干扰素水平下降，CD4/CD8比值从1.7±0.7下降为0.2+0.2,T细胞活性降低.这种变化有的可持续相当长时间,病后10个月，大多数患者T细胞亚群比例仍未完全恢复正常。

CMV感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大单核细胞和CD8细胞的功能异常所致。单核吞噬细胞在抗CMV免疫中起着枢纽作用，不但可以直接吞噬、杀伤病毒，更重要的是可以处理、提呈抗原，分泌细胞因子，调控和扩大免疫反应。当CMV感染后，单核吞噬细胞功能受到影响，CMV感染巨噬细胞引起其吞噬功能降低，细胞内氧自由基产生减少，FC受体、补体受体的表达发生改变，且其抗原提呈功能降低，产生IL-1降低，对IL-1及IL-2的反应亦降低。Moses等用胸腺细胞增殖试验检测，IL-1活性降低，IL-1产生降低可引起TH/TS细胞比例失衡。

NK细胞有拮抗CMV扩散的作用。NK细胞积极参与了抗CMV感染的全过程，但存在高的NK活力不一定是保护性应答，而是活动性感染的证明。NK细胞虽不能阻止原发性CMV感染的出现，但一旦存在感染后，NK细胞能在CMV感染早期出现，有限制扩散、使感染局限的作用。NK细胞、CTL细胞是抗CMV的重要效应细胞。在CMV复制早期，感染性病毒体产生前，它们能裂解感染细胞，使病毒在细胞间扩散流产。在小鼠模型中，病毒作用了3-5天时，抗病毒效应由NK细胞介导，NK细胞活性可由IFN增强。6-21天，脾、外周血存在CTL细胞的杀伤活性。NK细胞、CTL细胞活性的高低决定了机体对CMV感染的敏感性及感染恢复的难易性。但CMV感染时，NK细胞及CTL细胞活性亦受到严重影响。此外，特异性细胞免疫有阻止CMV感染再发作用。有人检测了20个发生CMV感染肾移植受者T细胞应答，发现有14个有CMV细胞毒应答，而6个不出现细胞毒应答者有严重的临床后果。因此，特异性T细胞存在，有阻止CMV感染再发的作用。

三、抗体有降低CMV感染的毒力作用

机体受CMV的感染后，可出现多种抗体。乳汁、宫颈分泌物、唾液中尽管有特异性抗体出现，包括中和抗体。但仍能检出CMV，说明抗体并不能阻止病毒扩散。胎儿从母体被动获得的抗体不能阻断经宫内、产道或乳汁传播的感染。研究证明，致死性CMV攻击前，在小鼠腹腔或静脉注入0.2ml高效价抗CMV球蛋白，可完全保护动物免于死亡。1个月后再用CMV等二次攻击，动物仍全部存活，表明抗体有降低CMV的毒力作用。

孕妇感染了巨细胞病毒会有何后果?

孕妇感染了巨细胞病毒后，病毒可通过胎盘感染胎儿，造成胎儿先天性感染，流产和死胎。

先天性感染的婴儿出生时可无症状，但也有严重者可累及多脏器，甚至死亡。有症状者可见肝脾肿大，黄疸，瘀斑或紫癜，脉络膜视网膜炎，小头畸形等。所有活着的患儿都会出现不同程度的听力、视力减退，意识、运动障碍，智力迟钝等。婴儿出生后经产道或哺乳感染的，为后天获得性感染，一般症状轻，预后良好，个别有肝功异常。

[临床表现]

巨细胞病毒感染有何症状?

健康的成年人发生巨细胞病毒感染时多无明显的临床症状，部分患者可有与传染性单核细胞增多症相似的表现，症状为低热，乏力，咽痛，淋巴结肿大，关节肌肉酸痛，多发性神经炎，周围血中有不典型淋巴细胞，脾大等。

妊娠期宫内感染可对胎儿造成损害，容易发生自然流产和死胎或是早产。新生儿症状可见肝脾肿大，黄疸，肝炎，血小板减少性紫癜，溶血性贫血，神经系统的退行性变化，小头畸形，智力低下，及视力、听力障碍等。

新生儿感染可无全身症状，有的仅表现为呼吸障碍症状，也有的可出现肝功能异常。不会出现神经损伤。

CMV感染的自然史很复杂，在原发性感染以后排毒，往往持续数周、数月甚至数年，然后感染转为潜伏。常有复发感染伴重新排毒。甚至在原发感染后很多年，潜伏病毒再激活，也可能有不同抗原性病毒株的再感染。CMV感染的临床表现与个体免疫功能和年龄有关。从表2所示，不论从垂直感染、平行传播或医源性感染所出现的症状与体征都是多种多样的。

表2CMV感染症临床经过与病型（Baerlocher等）

1.新生儿感染（先天性）

a.重症型：黄疸、贫血、肝脾肿大、血小板减少性紫癜，侵犯中枢神经，肺炎，心肌炎）

b.轻症型：假死，心脏肥大，高胆红素血症

2．出生后无症状期，乳儿期再感染CMV（先天性/后天性？）

a.全身型

b.呼吸系型（百日咳样）c.肝脾肿大

d.胃肠型

e.肾型？

3．后天型

a.流感型

b.单核细胞增多症型

c.呼吸系型

d.胃肠型

e.肝炎

f.因特殊医疗防御能力低下

g.无症型？

4．1、2、3项的后果即精神、运动发育迟缓

关于后天性CMV感染症，在临床中常见于输血后的单核细胞增多症，由于免疫功能缺陷而发生血管、网膜炎、肺炎以及消化道感染。并且大多数患者合并格-巴氏综合征。

[诊断]

仅靠临床表现，不能诊断CMV感染，必须依靠实验室手段，从临床标本中分离出病毒或其特异性抗体（呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高）才能确诊。

一、病毒分离

最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞，接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离，细胞病变效应（CPE）在1天或数周后出现，经固定和HE染色后可观察到巨细胞，核内有内包涵体，核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体，很象“猫头鹰眼”（owl′s eye）亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。

二、血清抗体检测

最常用的有补体结合试验（CF）、间接免疫荧光试验（IIF）、免疫酶试验（EIA）、间接血凝试验（IHA）和放射免疫试验（RIA）等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时，应当立即留血清标本，以及间隔2周、4周、8周再留血清标本，结合病毒分离可作原发感染诊断。

三、DNA探针

已广泛应用于检测CMV，其中以32P标记的探针敏感性最高，对某些标本来说，杂交方法可能比病毒分离更敏感。

四、聚合酶链式反应（PCR）

（一）标本的采集及处理

采集的标本包括患者的血液、尿，以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层（buffy coats）可保存于-80℃；尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。

尿液标本经2500r/min离心10min，以除去细胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂，因此需用聚乙二醇（PEG6000）进行预处理：50?l尿上清与50?l 20%PEG6000和25?l 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min；尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增；扩增时应于100℃加热10min，迅速置冰浴中冷却。

（二）模板DNA的制备

1．由血液标本制备模板DNA

方法A：向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L；取10?l 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。

方法B：由血沉棕黄层（BCP）制备：① 用PBS洗涤BCP两次，收取沉淀。② 加入500?l 6mol/L盐酸胍，匀浆。③ 加入30?l 10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，30?l20% Sarcosyl和5?l 蛋白酶K（10mg/ml），混合均匀，60℃反应1h。④ 加入1130?l 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥ 用70%乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA中。置4℃备用。

2.由冰冻组织标本制备模板DNA：① 用恒冷切片机切取一块5～10?m冰冻组织块，置于1.5ml塑料管中。② 加入10%用缓冲液配制的福马林。③ 10min后离心1～2min轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④ 于室温干燥10～60min。⑤ 加入抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/L EDTA、pH8.0,400?g/ml蛋白酶K），使刚好浸没沉淀物（约50～100?l ）；将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥ 37℃放置过液。⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧ 离心收集上清，取1～10?l 即可进行PCR扩增。

3.由尿液标本制备模板DNA：①100?l 尿上清液与100?l 6mol/L异硫氰酸胍，7?l 2mol/L NaCl和20?l 玻璃粉悬液（DNA PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。② 室温放置10min后，6400r/min离心2min，收集沉淀。③ 沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min离心1min。④ 同样洗涤沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50?l 蒸馏水，于55℃作用15min。⑥ 15000r/min离心2min，收集上清（含HCMV DNA），进行PCR扩增，将此悬液于100℃加热10min，并迅速于冰浴中冷却。

（三）引物及探针

引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。

（四）PCR扩增步骤

1．10×反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明胶。

Taq DNA 聚合酶：5U/?l 。

10×dNTP：4种dNTP各2.0mmol/L。

引物：100pmol/L。

2．常规PCR扩增

10×反应混合物（50?l）反应缓冲液 5?l

10×dNTP 5?l

模板DNA 5?l

Taq DNA聚合酶 0.2?l (IU)

引物 各0.5?l

蒸馏水 3.8?l

加1～2滴矿物油。

将反应混合物于94℃加热5min；然后于95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，扩增35～40循环。

表3 CMV PCR扩增所用的引物及探针

引物及

探针

序列（5′→3′）

位置

片段

大小

IE1

CCACCCGTGGTGCCAGCTCC

早期基因

159（bp）

IE2

CCCGCTCCTCCTGAGCACCC

IE3（探针）

CTGGTGTCACCCCCAGAGTCCCCTGTACCCGCGACTATCC

LA1

CCGCAACCTGGTGCCCATGG

晚期gp64

139

LA2

CGTTTGGGTTGCGCAGCGGG

LA3（探针）

TTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGCATCTTCGCCG

IE1a

AGATCGCCTGGAGACGCCAT

早期外显子1

139

IE1b

GGAATCCGCGTTCCAATGCA

IE2a

ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG

早期外显子2

72

IE2b

CCGTGGCACCTTGGAGGAAG

IE3a

GTGACCAAGGCCACGACGTT

早期外显子3

167

IE3b

TCTGCCAGGACATCTTTCTC

IE4a

ACAGATTAAGGTTCGAGTGC

早期外显子4

179

IE4b

CAATACACTTCATCTCCTCG

IE4c

TTACCAAGAACTCAGCCTTC

早期外显子4

158

IE4d

GTGCGTGAGCACCTTGTCTC

IE4e

TATACCCAGACGGAAGAGAAATTCA

早期外显子4

426

IE4f

ATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAG

Pp1a

TAGCGCGCATACATCCCGAGTACAT

Pp71基因

316

Pp1b

ATGACGTTGCTCCGTGGAAAGAGACC

Pp71

3．套式（nested）PCR扩增：①反应混合物的组成同（2），仅引物为IE2a和IE4b（包括了整个外显子3，共721b），各100pmol。于94℃ 60s，52℃150s，72℃ 480s，扩增20循环。② 取2?l 上述扩增产物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后，于94℃ 60s，52℃150s，72℃180s，扩增20循环。

（五）产物鉴定

扩增产物的分析可采用固相（滤膜）杂交和液相杂交试验。

1． 固相杂交：

① 预杂交液为3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30～60min。② 加入标记探针（10cpm/?g，2ng/ml），杂交30～60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次于60℃洗一次,10min/次再于室温洗一次以上,5min/次。④ 自显影。

2． 液相杂交及电泳分析：

① 取1/10体积的扩增产物与0.5～1.0pmol末端记的探针混合。② 加入最终浓度为150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液，使总体积为20?l 。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 离心10s加入样品缓冲液，于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。⑤ 电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对X线片曝光，自显影。

HCMV DNA分子很大，其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性，但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增，可鉴定90%的HCMV野型分离株；而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的病毒株。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。

在HCMV模板DNA制备过程中，有时会产生一些小片段DNA，在PCR反应时常导致一定水平的本底产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步：首先利用一对引物，扩增包括靶DNA在内的长片段DNA；然后取少量的扩增产物，利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。

PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物，可从尿液标本中检测到1pgHCMV DNA序列的水平；利用该系统，在4×104个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出，较斑点印迹杂交提高2×103倍。

PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现，可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的新生儿死亡率较高，因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对优生优育也有重要意义。利用这种方法，还可鉴定器官或组织移植手术中供体是否为HCMV与许多严重病症的关系。再者，PCR检测指标稳定，还可进行半定量分析，因此可作为评价各种抗病毒药物疗效的手段。

[治疗]

如果在妊娠早期发现有原发巨细胞病毒感染时，应尽快终止妊娠。妊娠中、晚期感染者应进一步检查胎儿有无畸形而采取相应的治疗措施。对于有临床症状或者是先天巨细胞病毒病者可用抗病毒药物治疗。如阿糖胞苷、磺苷、干扰素等，但疗效尚待进一步观察。

巨细胞病毒感染的治疗，可应用各种抗病毒制剂如GCV、抗巨细胞病毒的免疫球蛋白制剂、干扰素及转移因子等。但这些药物并不能解决根本问题，往往停药后病毒又潜伏地回升，鉴于此种病毒可能作为艾滋病的病因之一，各国学者均在致力于控制其感染的研究。最近，美国学者研制出两种活疫苗，初试后颇见效。一种是由AD169菌株研制成的；另一种是从TOWn菌株制成的，经非肠道给药后，已明显表现出有抗巨细胞病毒的效能，CMV抗体升高，导致免疫功能增强。

[预防]

巨细胞病毒对人类的危害性很大，所以我们应积极预防其发生。

(1)进行有意识的身体素质的锻炼。提高机体免疫机能及抗病能力，特别是育龄期妇女，以减少巨细胞病毒对胎儿的严重危害。

(2)对于孕妇或有慢性消耗性疾病、免疫力低下等患者要注意保护，使她们远离传染源。

(3)注意环境卫生、饮食卫生。

(4)乳汁中巨细胞病毒阳性者，不应哺乳。

(5)免疫防治。尚在研究和探索中。

临床症状变化很大，可随年龄、病人机体状况、感染途径不同而异。

待续……

目前对CMV感染尚无特效疗法。

由于巨细胞病毒的先天性感染和致癌作用，一些学者考虑用疫苗以阻断CMV感染。由于受技术的限制，还无法培养出经济实用的、可做死疫苗的高价效CMV，目前应用的是命名为Towne的减毒活疫苗。

参考资料：

你知道巨细胞病毒感染是致畸的潜伏元凶吗?

人巨细胞病毒是一种双链DNA病毒，是最大的动物病毒之一。人是人巨细胞病毒唯一可感染的对象。同其他病毒相比，由于人巨细胞病毒的毒力较弱，侵入机体后一般不会使器官和组织受到严重损伤，但是该病毒基因整合在受精卵细胞的相关基因后，则可阻止或影响后者的复制和表达，最后导致不可逆的形态和结构的异常。巨细胞病毒主要在早孕3个月内感染致胎儿畸形，脑是巨细胞病毒最易侵袭的器官，胎儿脑组织中的神经元细胞、神经胶质细胞均可受侵犯。颅内钙盐沉着、脑软化、脑积水是人巨细胞病毒感染最常见的临床表现，其后遗症也以神经系统最为严重。最常见的是智力低下，其他如粗大运动异常，精神运动异常，感觉神经性耳聋，脉络膜视网膜炎等。虽然在听力和神经方面明显存在着高风险，甚至可能有后遗症，只有5%的被感染婴儿会在新生儿期就表现巨细胞病毒感染征象。而90%的先天性感染的胎儿出生时无任何临床症状。因此，加强监测，尽早诊断是预防巨细胞病毒感染致畸的重要措施。怀孕时初次感染巨细胞病毒的孕妇，其胎儿的感染率是30%，而被感染的孕妇在分娩时有40%可传染给胎儿。妊娠期，巨细胞病毒感染至今尚无特殊疗法，所以关键在预防。对早孕妇女，不仅可监测其抗体，还可用特殊方法监测其抗原，如果发现孕妇体内有巨细胞病毒活跃复制，应采取果断措施，终止妊娠，以避免畸形儿出生。此外，要提高人们的文化素质，讲究卫生，杜绝病毒感染的各种机会，并注意保持和增强人体免疫功能，这样就有可能防止或减少育龄妇女巨细胞病毒感染。

巨细胞包涵体病对小儿智力有影响吗?

巨细胞包涵体病是由于巨细胞病毒感染后，引起的全身多个器官损害并出现临床症状的疾病。若在出生时就有临床症状，则为宫内感染(先天感染)，出生后数天或数周发病多为出生后感染。巨细胞病毒感染很广泛，是先天病毒感染的重要病原之一。巨细胞病毒感染可引起胎儿脑组织广泛损伤，是小儿智力低下的最主要原因。

巨细胞病毒感染较广泛，大多数人一生中不同时期均可获得感染。居住拥挤、经济条件差、卫生条件差的人易感染。女性较同龄男性感染率高。晚期孕妇宫颈排出巨细胞病毒者达28% ，是先天性巨细胞病毒感染的重要原因。母乳排毒者约13%～27%，且排毒时间长，易引起后天感染。

巨细胞病毒感染后，临床表现有多种类型。如为先天感染，出生后即有低体重，呼吸不规则，黄疸重，肝脏、脾脏肿大，抽搐，视力受损，肌肉瘫痪，智力低下等。如为后天感染，一般症状较轻，多表现为肝炎症状。

因此，育龄妇女怀孕前应做体检，如果发现有巨细胞病毒感染应抗病毒治疗，使血中巨细胞病毒抗体转阴，子宫颈分泌物检查巨细胞病毒为阴性方可受孕。