苯酚使蛋白质变性的机理是什么

苯酚系原浆毒，使菌体蛋白变性而起杀菌作用，不同的浓度有不同的作用。O．2％溶液作为抑菌剂；1％溶液有杀菌作用，对革兰阳性菌和革兰阴性菌有效；杀真菌浓度在1．3％溶液以上；5％溶液在24小时可杀灭结核杆菌。在低温和碱性培养基中，作用会大大减弱。该药的效力在水溶液里比在甘油和脂质里大得多。

苯酚通过使蛋白质变性而发挥作用。***************************蛋白质一苯酚复合物是一种疏松结合的复合物，*******************************所以，苯酚可以扩散渗进组织，该化合物具有显著的毒性作用，因其穿透性强，甚至可以影响无损的皮肤，将该药直接用于皮肤时，沉淀的蛋白质会形成一层白色的薄膜，这层薄膜很快变红，最后脱落，留下棕色的皮肤，如果苯酚继续接触皮肤，它会向深部穿透，从而可引起大面积坏死。

2’鉴定生物组织中是否含有蛋白质时,常用双缩脲法,使用的是双缩脲试剂.双缩脲试剂的成分是质量浓度为0．1g/mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0．01

g／mL的硫酸铜溶液.在碱性溶液（NaOH）中,双缩脲（H2NOC-NH-CONH2）能与铜离子作用,形成紫色或紫红色的络

3’丙氨酸——茚三酮反应.氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时,氨基酸被氧化脱氨、脱羧,而茚三酮水合物被还原,其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合,再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物,称为罗曼紫（Ruhemann's

purple）.

另外还有一个更简单的方法：

1912年法国化学家Maillard发现甘氨酸与葡萄糖混合加热时形成褐色的物质,这个反应叫美拉德反应机理

,也就是说你可以用上面的方法先鉴定出苯酚,然后将葡萄糖溶液分别加入到另外两个试管中加热,形成褐色物质的为丙氨酸,反之为蛋白质。

所以有4种方法可以鉴别

即1鉴别出苯酚和蛋白质

2鉴别出苯酚和丙氨酸

3鉴别出丙氨酸和蛋白质

4上述的那个简单的方法

2、原因如下：

苯酚硫酸法测定多糖原理是：多糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg/ml范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收，因而可用比色法在此波长下测定。而上述反应过程不受蛋白质影响。

3、补充：

苯酚-硫酸比色法是Dubois M等在1951年提出并建立的一种用于多糖含量测定的方法，也被称为苯酚-硫酸分光光度法或苯酚-硫酸法，其应用广泛。具体方法是待测定多糖样品液1

mL，加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀后迅速加入浓硫酸5mL，再次迅速摇匀，然后置沸水浴加热30min，冷水迅速冷却至室温，按分光光度法在490nm波长处测定吸光度值。该法操作简便，快捷灵敏，且不需贵重仪器，但准确性和重现性受实验条件影响较大，其原理是利用多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，进而和苯酚缩合成有色化合物，在490nm处进行比色测定。

使用苯酚抽提细胞

DNA

时，苯酚的作用是使蛋白质变性，同时抑制了

DNase

的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与

DNA

联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而

DNA

溶于水相。

氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组

DNA

时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡

产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含

DNA

的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

原理：

1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：

1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。5min

2．溶解DNA：

3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢

4．过滤：取黏稠物

5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3min

6．过滤：取滤液。

7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5min

8．DNA的鉴定：沸水浴5min

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DNA提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。

将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

2.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法②化学试剂法：用SDS处理细胞③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

3.DNA提取的几种方法

(1).浓盐法

A.利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.

B.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA

（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态

（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.