SO3π键如何形成

一摩尔硫酸四氨合铜还有多少o键首先需要知道一个硫酸四氨合同有多少个o键，西格玛键就是电子云头碰头重叠的共价键，一个硫酸四氨合铜离子有16个o键，一个摩尔硫酸四氨合铜就有20摩尔的西格玛键大约为20×6.02×10 23个

橙皮素(3’，5，7-三羟基-4-甲氧基黄酮，3’，5，7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone)常见于柑橘类果实中。流行病学研究表明，每日增加橙皮素的摄入量能够减少人类心血管疾病的死亡率，肺癌和哮喘。也有研究显示，橙皮素能够有效治疗许多疾病，其能够产生广泛的生物效应，包括血管舒张作用、抗氧化剂作用、神经保护作用、消炎作用、抗病毒效果和降低胆固醇的作用(wangh，wangh，zhangh，etal.inhibitoryeffectsofhesperetinonnav1.5channelsstablyexpressedinhek293cellsandonthevoltage-gatedcardiacsodiumcurrentinhumanatrialmyocytes[j].actapharmacologicasinica，2016，789：98-108.)。橙皮素的结构式如下面的式i所示。

橙皮素的配糖形式是橙皮苷。橙皮苷具有多种生物功能，如清除自由基、抗氧化作用和保护神经，还潜在地预防老年痴呆症、抗抑郁症、抗炎、预防癌症和心血管疾病(a.hirata，y.murakami，m.shoji，y.kadoma，s.fujisawa，kineticsofradical-scavengingactivityofhesperetinandhesperidinandtheirinhibitoryactivityoncox-2expression，anticancerres.25(2005)3367-3374.)。

α-葡萄糖苷酶(ec3.2.1.20)是一种分解代谢酶，能够将淀粉及糖原水解成葡萄糖。在人体中，α-葡萄糖苷酶调节血糖水平，提供维持健康状态的能量。但是，对于患有ii型糖尿病的病人而言，α-葡萄糖苷酶活性高时，水解糖原能力强，提升了血浆中的葡萄糖水平，从而加重了ii型糖尿病，甚至会引起临床上的严重后果。

因此，出于药用目的抑制α-葡萄糖苷酶，已经有多种α-葡萄糖苷酶抑制剂进入临床应用，例如阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。α-葡糖苷酶抑制剂通过维持体内血糖在一个稳定的水平，预防或治疗糖尿病。已有的α-葡糖苷酶抑制剂(包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇)是一类具有糖结构的新型抗糖尿病药物，可以明显降低ii型糖尿病人餐后血糖水平，减少糖尿病并发症的发生(何素婷，陈代杰.具有α-葡糖苷酶抑制作用的抗糖尿病药物[j].工业微生物，2003，33(1)：43-49.)。

此外，也有文献提出α-葡萄糖苷酶是一种附睾标志物(epididymalmarker)，与肿瘤的转移和增长过程相关(j.f.guerin，h.b.ali，j.rollet，c.souchier，j.c.czyba，alpha-glucosidaseasaspecificepididymalenzymemarker.itsvalidityfortheetiologicdiagnosisofazoospermia，j.androl.7(1986)156-162；s.atsumi，c.nosaka，y.ochi，h.iinuma，k.umezawa，inhibitionofexperimentalmetastasisbyanalpha-glucosidaseinhibitor，1，6-epi-cyclophellitol，cancerres.53(1993)4896-4899；r.pili，j.chang，r.a.partis，r.a.mueller，f.j.chrest，a.passaniti，thealpha-glucosidaseiinhibitorcastanosperminealtersendothelialcellglycosylation，preventsangiogenesis，andinhibitstumorgrowth，cancerres.55(1995)2920-2926.)。

目前，尚需要开发新的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

技术实现要素：

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，惊奇地发现，橙皮素能够有效地抑制α-葡糖苷酶，具有制备糖尿病特别是ii型糖尿病的药物的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及橙皮素或其药学上可接受的盐或者橙皮苷或其药学上可接受的盐在制备如下的(1)-(3)中任一项中的用途：

(1)α-葡糖苷酶抑制剂，

(2)治疗和/或预防糖尿病的药物，

(3)治疗和/或预防肿瘤的药物例如抑制肿瘤转移和/或增长的药物。

在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述糖尿病为ii型糖尿病。

在发明中，通过抑制动力学和分子动力学模拟积分法评价橙皮素对α-葡萄糖苷酶的影响。本发明人发现，橙皮素能够可逆地抑制α-葡萄糖苷酶，且抑制类型为斜率-抛物线混合类型(ic50＝0.38±0.05mm；kislope＝0.23±0.01mm)；另外，这种抑制是伴随蛋白质三级结构变化的。基于橙皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，其能够用于制备防治糖尿病特别是ii型糖尿病(例如与α-葡萄糖苷酶相关的ii型糖尿病)的药物。

肿瘤细胞中具有α-葡萄糖苷酶，α-葡萄糖苷酶参与到肿瘤细胞相互作用的转移过程以及肿瘤细胞表面某些寡糖的合成。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤转移和/或增长为α-葡萄糖苷酶参与的肿瘤转移和/或增长。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的橙皮素或其药学上可接受的盐，和/或橙皮苷或其药学上可接受的盐；可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料(例如载体或赋形剂)。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，其还包含选自如下的一种或多种：

阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇、二甲双胍、促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、gpl-1受体激动剂、ddp-4酶抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，其为口服制剂或注射剂。

通常本发明药物组合物含有0.1重量％-90重量％的橙皮素或橙皮苷和/或其药学上可接受的盐。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将橙皮素或橙皮苷和/或其药学上可接受的盐与一种或多种固体或液体药物赋形剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的橙皮素或橙皮苷或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片、双层片或多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分橙皮素或橙皮苷或其药学上可接受的盐与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分橙皮素或橙皮苷或其药学上可接受的盐制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明橙皮素或橙皮苷，或其药学上可接受的盐的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明在再一方面涉及一种药物产品，其包含独立包装的药物制剂1和药物制剂2，其中：

所述药物制剂1包含有效量的橙皮素或其药学上可接受的盐，和/或橙皮苷或其药学上可接受的盐；

所述药物制剂2包含选自如下的一种或多种：

阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇、二甲双胍、促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、gpl-1受体激动剂、ddp-4酶抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物产品，其中，所述药物制剂1或药物制剂2独立地为口服制剂或注射剂。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制α-葡糖苷酶的方法，包括施加于对象有效量的橙皮素或其药学上可接受的盐，和/或橙皮苷或其药学上可接受的盐的步骤；优选地，所述对象为细胞；更优选地，所述细胞为哺乳动物细胞或者微生物细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述的抑制方法，是非治疗目的的。

在本发明的一个实施方案中，所述的抑制方法，其中，所述哺乳动物细胞为人的体细胞例如人胰岛细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述的抑制方法，其中，所述微生物细胞为细菌细胞、霉菌细胞或酵母菌细胞；优选地，为酿酒酵母细胞。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗糖尿病的方法，包括给予受试者有效量的橙皮素或其药学上可接受的盐和/或橙皮苷或其药学上可接受的盐、本发明的药物组合物或者本发明的药物产品的步骤。

当用于上述治疗和/或预防和/或辅助治疗时，治疗和/或预防有效量的橙皮素或橙皮苷或其药学上可接受的盐可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，以含有该活性成分与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。并且应认识到，本发明活性成分和药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体药物组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，橙皮素或橙皮苷或其药学上可接受的盐用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001-1000mg/kg体重/天，例如介于0.01-100mg/kg体重/天，例如介于0.01-10mg/kg体重/天。

本发明中，

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

发明的有益效果

橙皮素或其药学上可接受的盐能够有效地抑制α-葡糖苷酶，具有制备糖尿病特别是ii型糖尿病的药物的潜力。

附图说明

图1a：底物体系含橙皮素的条件下，对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线。n＝4。其中，横坐标表示橙皮素的浓度(mm)，纵坐标表示α-葡萄糖苷酶的相对活性。

图1b：底物体系不含橙皮素的条件下，对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线。n＝4。其中，横坐标表示橙皮素的浓度(mm)，纵坐标表示α-葡萄糖苷酶的相对活性。

图2：橙皮素对α-葡萄糖苷酶的可逆抑制曲线。其中，横坐标表示酶浓度[e]，纵坐标是吸光度的值。橙皮素浓度分别为0mm、0.2mm、0.5mm、1.0mm和2.0mm，在图中依次用：■、●、▲、和◆代表。■所标记的曲线作为对照曲线。

图3：橙皮素对α-葡萄糖苷酶抑制作用的时间进程动力学曲线。其中，橙皮素浓度分别为0.05mm、0.2mm、0.3mm、0.5mm和0.8mm，在图中依次用：■、●、▲、和◆代表。其中，横坐标表示时间(min)，纵坐标表示α-葡萄糖苷酶的相对活性。

图4a：橙皮素抑制α-葡萄糖苷酶的双倒数曲线图。其中，横坐标是底物浓度的倒数，单位是mm-1，纵坐标是吸光度的值的倒数。橙皮素浓度分别为0mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm和0.4mm，在图中依次用：■、●、▲、和◆代表。

图4b：斜率对橙皮素浓度的二次做图，数据来自图4a。其中，横坐标表示橙皮素的浓度(mm)，纵坐标表示不同浓度的橙皮素的双倒数曲线的斜率。

图5a：橙皮素影响下的α-葡萄糖苷酶的荧光分光光度测量图。横坐标是荧光分光光度计的发射波长，单位是nm，纵坐标是α-葡萄糖苷酶吸收的荧光强度。其中1-7分别依次代表橙皮素浓度0mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.1mm和0.15mm。

图5b：α-葡萄糖苷酶吸收的荧光强度最高峰值对应波长与橙皮素浓度二次做图。横坐标是橙皮素浓度，单位是mm，纵坐标是α-葡萄糖苷酶吸收的荧光强度最高峰值对应的荧光分光光度计的发射波长，单位是nm。数据来自图5a。

图5c：最大荧光强度与橙皮素浓度的曲线图。横坐标是橙皮素浓度，单位是mm，纵坐标是橙皮素影响下的α-葡萄糖苷酶最大荧光吸收强度。

图5d：最大荧光强度差与橙皮素浓度的二次做图。横坐标是橙皮素浓度的倒数，单位是mm-1，纵坐标是消去最大自然荧光强度影响的α-葡萄糖苷酶荧光吸收强度。

图6：ans荧光强度与橙皮素浓度的柱形图。横坐标是橙皮素浓度，单位是mm，纵坐标是ans荧光吸收强度。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1.实施例所用试剂

本发明中，橙皮素、α-葡萄糖苷酶、pnpg、ans均购自sigma-aldrich(usa)公司。其余试剂为国产分析纯。

α-葡萄糖苷酶(来自酿酒酵母)酵母菌的α-葡萄糖苷酶和人体中的是类似的。其底物是糖原，产物是葡萄糖，已被证实(岳振峰，陈小霞，彭志英.α-葡萄糖苷酶研究现状及进展[j].食品与发酵工业，2000，26(3)：63-67.)。

pnpg，4-硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷，其结构式如下面的式ii所示。

有研究证实，α-葡萄糖苷酶是属于键专一性酶，主要是作用于化学键，对底物配对的要求相对宽松(岳振峰，陈小霞，彭志英等.α-葡萄糖苷酶研究现状及进展[j].食品与发酵工业，2000，26(3)：63-67，98.)。pnpg是本领域人员熟知的研究α-葡萄糖苷酶应该使用的底物。

ans，即8-苯氨基-1-萘磺酸，其结构式如下面的式iii所示。

2.部分溶液的配制

(1)α-葡萄糖苷酶溶液：α-葡萄糖苷酶溶于50mm的磷酸缓冲液，ph7.0。α-葡萄糖苷酶配制时浓度为10μm。用于下面的实施例。如果没有特别说明，反应体系中α-葡萄糖苷酶的反应初始浓度均为0.1μm。

(2)pnpg溶液：溶于50mm磷酸缓冲液，ph7.0，pnpg浓度为5mm。pnpg在反应体系中的浓度是2mm。

(3)橙皮素溶液：用100％dmso完全溶解橙皮素，再用50mm磷酸缓冲液，稀释至橙皮素浓度为100mm，此时dmso为5％。此橙皮素溶液为母液，使用时按照需求浓度进行稀释，稀释液使用5％dmso。这里5％dmso由5体积的dmso与95体积的去离子水配制得到。

实施例1：橙皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

下面在底物体系含橙皮素和不含橙皮素两种条件下，分别进行实验操作。

一、底物体系含橙皮素

1.实验方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分别与不同浓度的橙皮素溶液以20∶1的体积比混合，混合后橙皮素的浓度依次为0mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm，在25℃下水浴10min，得到11份混合物。

(2)上述混合物每份分别取10μl，加入到1ml底物体系中，其中底物体系由pnpg溶液与相应浓度的橙皮素溶液以95∶5的体积比配制得到。这里加入橙皮素的目的是为了确保加入到底物体系之后，橙皮素的浓度与加入之前保持一致。底物pnpg的反应初始浓度均为2.0mm，α-葡萄糖苷酶的反应初始浓度均为0.1μm。

(3)使用紫外分光光度计，在发射波长400nm/min条件下，测量α-葡萄糖苷酶的活性变化，测定温度为25℃。

反应的整个过程从酶促反应动力学角度看包括3个阶段：一级反应、混合级反应和零级反应。需要在一级反应反应阶段进行测量，故操作时要迅速，滴加混合物后即开始测量，经过约1分钟后，从仪器显示的酶活性曲线上可看出过渡为混合及级应，则停止测量。

上述操作，对于每个橙皮素浓度，平行进行4次实验(n＝4)，取平均值。

2.实验结果

结果如图1a所示。

结果表明，橙皮素在酶活性剩余一半时的浓度(ic50)为0.38±0.05mm(n＝4)。

二、底物体系不含橙皮素(稀释效应实验)

1.实验方法

按照前面“底物体系含橙皮素”的实验方法进行，不同之处在于底物体系含pnpg，不含橙皮素。

每个橙皮素浓度，平行进行4次实验(n＝4)。

2.实验结果

结果见图1b。

由于底物体系没有橙皮素，酶体系加入到底物体系中测活时，橙皮素就被稀释了。图1b显示，通过稀释，酶活性能够恢复一部分，没有完全失活。说明橙皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。

图1b还显示，甚至在完全灭活的情况下，即橙皮素浓度为2.5mm时(如图1a，纵坐标都降到约0了)，酶的活性能够恢复至70％。这表明橙皮素与酶是可逆结合的，酶的活性可通过简单的稀释效应恢复。

实施例2：抑制可逆性的验证实验

为了检测和验证橙皮素作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的可逆性，进一步证明实施例1的实验结果，在改变橙皮素浓度的条件下，做出酶残余活性与酶浓度的关系。

1.实验方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分别与不同浓度的橙皮素溶液(橙皮素浓度：0mm、0.2mm、0.5mm、1.0mm和2.0mm)以20∶1的体积比混合，25℃下水浴10min，得到5份混合物。

(2)将上述混合物分别取10μl加入到1ml底物体系中，其中底物体系由pnpg溶液与相应浓度的橙皮素溶液以95∶5的体积比配制得到。底物pnpg的反应初始浓度为2.0mm，[e]表示α-葡萄糖苷酶的反应初始浓度，依次为0.02μm、0.05μm、0.1μm、0.15μm、0.20μm。

(3)用紫外分光光度计测量在发射波长400nm/min条件下，α-葡萄糖苷酶的活性变化，测定温度为25℃。具体操作参照实施例1。

上述操作，对于每个橙皮素浓度，平行进行4次实验(n＝4)。

2.实验结果

结果如图2所示。

结果表明，随着抑制剂橙皮素浓度的升高，直线穿过原点，直线的斜率逐渐降低，说明橙皮素诱导抑制的作用是可逆的。如果是不可逆的情况，抑制剂浓度增加的曲线会与对照曲线(即图2中■所标记的曲线)斜率相同，并会与x轴相交于相对应酶浓度的位置。

图2的结果明确地证明，橙皮素与α-葡萄糖苷酶是可逆结合的。

实施例3：橙皮素对α-葡萄糖苷酶抑制作用的时间进程动力学

1.实验方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分别与不同浓度的橙皮素溶液(0mm、1mm、4mm、6mm、10mm、16mm)以20∶1的体积比混合，得到6份混合物，在25℃下水浴，指定的时间间隔：1、2、3、4、5、10、15、20、25、30min，将上述混合物分别取10μl，加入到相对应橙皮素浓度的底物体系(1ml)中，其中底物体系由pnpg溶液与相应浓度的橙皮素溶液以95∶5的体积比配制得到。底物pnpg的反应初始浓度为2.0mm，α-葡萄糖苷酶的反应初始浓度为0.1μm。

(2)用紫外分光光度计在发射波长400nm/min条件下，测量α-葡萄糖苷酶的活性变化，测定温度为25℃。具体操作参照实施例1。

2.实验结果

如图3所示。

图3显示，在橙皮素(浓度在0.05-0.8mm)与酶混合水浴的时间间隔内，酶没有显著的动力学进程。酶失活的反应在很短的时间内就到达了平衡，这证明了橙皮素能够非常迅速地与酶结合，并没有经过特殊的过程就使催化活动失活，同时说明了α-葡萄糖苷酶上有橙皮素特定的结合位点。换言之，快速失活而没有任何明显的渐进的动态过程表明的具体对接橙皮素的位置可能位于酶活性部位的口袋里。

O

↑ 

H-O-S-O-H

↓

O

【说明】

1、↑是配位键.

2、硫和氧之间有一个sigma键，两个dpπ反馈键，箭头表示配位键，但是配位键能相当于平常的双键，所以可以用双键表示。

[原理]

果胶物质主要存在于植物初生壁和细胞中间，果胶物质是细胞壁的基质多糖。果胶包括两种酸性多糖（聚半乳糖醛酸、聚鼠李半乳糖醛酸）和三种中性多糖（阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖）。果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶，果胶酶水解果胶主要生成β-半乳糖醛酸,可用次碘酸钠法进行半乳醛酸的定量,从而测定果胶酶活力。

果胶酶活力单位定义]

1g(或1ml液体酶)酶粉,于50.0℃、pH3.5条件下,每分钟催化果胶水解生成1微克半乳糖醛酸的酶量为一个活力单位。

1. 试剂和仪器

*本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯

1.1 醋酸

1.2 碘

1.3 碘花钾

1.4 浓硫酸

1.5 果胶（sigma公司）

1.6 硫代硫酸钠

1.7 碳酸钠

1.8 可溶性淀粉

1.9 水浴锅

1.10 碘量瓶

2. 试剂的制备

2.1 pH3.5的酸水

用醋酸将蒸馏水调至3.5

2.2 1%果胶溶液：

准确称取分析纯果胶1g，用酸水溶解煮沸，冷却后过滤，定至100ml。

2.20.1N碘液：

准确称取碘化钾5g，用蒸馏水溶解后，加入2.54g碘，溶解后定容至100ml。

2.30.025mol/L硫代硫酸钠：

准确称取6.2g硫代硫酸钠，加蒸馏水后定容至1L

2.40.5%可溶性淀粉指示剂：

准确称取可溶性淀粉0.5g放入沸水中消煮至透明。

2.51M碳酸钠溶液：

准确称取10.6g碳酸钠，定容于100ml的水中

2.62N硫酸：

吸10ml的浓硫酸倒入170ml的水中

2.7酶样的制备

准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，定容至100ml，于50℃水浴浸取1小时，过滤，滤液为供试酶液。则该酶已经稀释100倍。

3. 程序

3.1 取1%果胶酶10ml加入5ml酶液和5ml蒸馏水（PH3.5），在50℃水浴中保温反应1小时。

3.2 取出后加热煮沸2~3min，冷却后，补水至20ml。

3.3 取5ml反应液于100ml碘量瓶中，加1M碳酸钠溶液1ml，0.1N碘液5ml，摇匀，具塞，于室温暗处下放置20min。

3.4 取出后加2N硫酸2ml，立即用0.05N硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色，加1ml0.5%可溶性淀粉溶液，继续滴定至蓝色消失为止。

3.5 空白试验以煮沸失活的酶液或蒸馏水代替酶液进行滴定。

3.6 每个酶样最少做两个平行样。

4. 计算

4.1 将测得的各平行样求OD值的均值。

4.2 计算酶的活性单位依据以下公式

酶的活力= [(B-A)*N*0.5*175*20*n*1000]/[51*52*W*60 ]

单位： U/g(ml)

式中： A：样品滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。

B：空白滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。

N：硫代硫酸钠摩尔浓度。

0.5：1当量硫代硫酸钠相当于0.5当量半乳糖醛酸。

20：反应液总体积

51：酶液体积以1ml计

52：吸取反应液

n：稀释倍数

W：酶粉重量g或酶液体积ml

TUNEL方法（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-地高辛配基切口标记）源自完整固定的细胞核DNA 裂解部位标记（如Gavrieli et

al. 1992)。 该法可用于组织切片、玻片上细胞生长、流式细胞计量术分析，用于组织切片的改进程序由Naik 及其合作者提出(Naik et

al. 1996) ，叙述如下

1、组织切片的TUNEL 染色

1）取下组织，立即用新制备的4％甲醛固定，室温过夜。用多聚甲醛(EM 级）制备4％的甲醛溶液，在100 ml 水中加8g 多聚甲醛，在通风橱中加热至50 ~ 60℃．加几滴1 moL/L NaOH 使固体全部溶解。 多聚甲醛全部溶解后，将溶液放冰上，迅速冷却至室温。加100 ml 2 的2 x PBS, 过滤固定液。甲醛储存液应在每次实验前新配。

2) 通过50% 、70%、80% 、95% 、100％乙醇和100% 二甲苯系列孵育（每步5 分钟）使组织脱水

3) 用石蜡包埋组织，制备5μm厚的切片，固定于玻片上，将石蜡切片70℃加热10分钟或58 ~ 60℃加热30 分钟去除石蜡

4) 通过以下溶液进行系列转移水合切片：二甲苯5 分钟2 次， 96％乙醇3 分钟2 次，然后90% 、80% 、70% 、50 ％，双蒸水各3 分钟

5) 在冷的4％甲醛中后续固定切片5 分钟，用pH7.2 的PBS 清洗3 次，每次5 分钟

6) 室温下用1 ~ 2 μg/ml 蛋白酶K 的10mmol/L Tris-HCI 溶液(pH8.0) 处理玻片10 分钟，用PBS 清洗3 次

7) 用0.5%H2O2的PBS 溶液室温处理20 分钟，封闭内源过氧化物酶活性。

8) 用补充有150 mmol/L NaCl 和0.05% BSA 的TdT 反应缓冲液(GIBCO/BRL）预孵育切片。每个切片上加27 μl 溶液，用已裁成合适大小的Parafilm 膜覆盖。

5x TdT 反应缓冲液

500 mmol/L 二甲胂酸钾， pH7.2

l0 mmol/L CoCl2

l mmol/L DTT

9) 室温孵育10 分钟后，取下Parafilm 膜，用纸巾吸去水。

I0) 在用TdT 反应缓冲液制备的200 U/ml TdT 酶(GIBCO/BRL15 U/ml), 2 – 4

μmol／L地高辛配基偶联的dUTP 中孵育切片，再用Parafilm 膜覆盖切片， 37℃ 湿室中30 分钟～ 1 小时。用pH7.2

的PBS 将切片洗3 次。

11) 用5 U/ml 辣根过氧化物酶偶联的抗地高辛孵育玻片，用Parafilm 膜覆盖。37℃ 温室中孵育30 分钟

l2) 应用快速DAB 底物(Sigma) ，用DAB 和H2O2处理检测标记细胞。用过量水清洗切片。可用甲基绿复染切片30 秒。用过量水清洗。

13) 通过用二甲苯终洗2 次的系列乙醇使切片脱水。 用Permount 或Entallan介质固定，用光学显微镜分析

注意事项

TUNEL 阳性核被染成深棕色。如需要，在DAB 反应中可加人硫酸镍(3 mg/ml) 。可以增强染色，阳性核将呈现紫／黑色。

TUNEL 染色的流式细胞计量术分析

1) 凋亡诱导之后， 200 g 离心5 分钟收集1×106 悬浮细胞，用冷的PBS 洗2次，重复离心

2) 用2 ml 2 ％的甲醛PBS 溶液(pH7.2，用多聚甲醛新配）固定细胞沉淀，室温下在水平摇床上孵育30 分钟。

3) 200 g 离心5 分钟沉淀细胞，用PBS 洗1 次。重复离心。

4) 用500 μl 0.1 % Triton X-100, 0.1 ％柠檬酸钠溶液4℃ 孵育2 分钟透化细胞，用PBS 洗2次。

5) 在温室中于TdT 缓冲液(30 mmol/L Tris-HCl, pH7.2 ,140 mmol/L 二钾胂酸钠）中用0. 3 nmol/LFITC-12-dUTP (Boehringer Mannheim) 、3 nmol/L dATP, 25 mmol/L CoCl2、25 U TdT (Boehringer Mannheim) 37℃孵育1 小时，进行TUNEL 反应，终体积50 μl

6) 37℃孵育1 小时后，加人2μl 0.5 mol/L EDTA 终止反应，用pH7.2 的PBS 将细胞洗2次。用带有氩激光(488

run) 的流式细胞计量仪(FACScan, Becton Dickinson) 分析数据。或者，可将细胞重悬于50μl

液体固定介质如FluoroGuard (Bio-Rad) 中，移到载玻片上，盖上盖玻片、用荧光显微镜分析。

注意事项

FACSsean 对TUNEL 标记的定量分析最好用于淋巴细胞，对贴壁细胞如成纤维细胞效果不够好

贴壁细胞的TUNEL 染色

1) 用无菌镊子将一无菌盖玻片放入35 mm 培养皿中

2) 将大约1×104细胞接种于无菌盖玻片上，培养24 ~ 48 小时。凋亡诱导时，细胞铺满不超过80% ，如细胞贴壁不太好，可以用纤连蛋自、聚赖氨酸或血清预处理盖玻片，以使细胞更好地贴壁生长

3) 诱导凋亡后，用pH7.2 的PBS 轻轻洗细胞1 次，不要除去垂死细胞，用冰冷的甲醇（- 20℃） 固定10 分钟

4) 室温空气干燥玻片5 分钟，在pH7.2 的PBS 中温育10 分钟重新水合

5) 按上述方法进行TUNEL 反应。将合适的Parafilm 膜放入温室，膜上加50μl TdT反应混合液，放盖玻片，细胞朝下在反应液上。37℃ 孵育1 小时

6) 从温室中取出盖玻片，放回35 mm 培养皿中。用PBS 洗细胞3 次，用固定液(Bio-Rad) 固定到载玻片上