苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理,以及这三者的作用是什么?
苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.
使用苯酚抽提细胞 DNA 时,苯酚的作用是使蛋白质变性,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而 DNA 溶于水相.
氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）
用酚-氯仿抽提细胞基因组 DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡 产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.
苯酚提取核酸，上清液少是为什么
利用苯酚法可以直接从动物组织中提取RNA,组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被酚饱和的水层中,DNA和蛋白质则留在酚层中,向水层加入乙醇后RNA即呈白色絮状沉淀析出.操作步骤
1 称取3克肝组织,剪成小块,置于研钵中,加3-4滴90%的苯酚溶液后研磨,匀浆中加入15mL水,转移至三角烧瓶中,加10mL酚至三角烧瓶中.2 室温下剧烈振荡45分钟,于3000rpm离心20分钟.3 用吸管将上层液吸出,并加入1/2体积的氯仿-异戊醇,于低温下振荡20分钟,以除去提取液中的蛋白质,以2000rpm离心10分钟,吸出上层清液,向上清液中加入醋酸钾粉末,使最后浓度大约为2%,装入小烧杯后,一边搅拌,一边缓慢加入两倍于上清液体积的95%乙醇以沉淀RNA.4 于冰浴中放置半小时后,以1000rpm离心5分钟,沉淀再用少量75%乙醇洗涤1-2次,收集沉淀,置于干燥器内干燥,称重.5 测定A260/A280的值,应大于1.85,若小于1.85,则说明含杂蛋白和DNA高了.
异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾.
氯仿的作用有多个方面,一是作为有机溶剂变性蛋白,使其沉淀并通过离心除去,同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚,很多自己配试剂提的方法也用苯酚,抽提蛋白时也会用到苯酚）,苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去会损伤核酸,需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等）,起到一定除杂作用
通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25）,减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫,影响后续操作,不过个人经验感觉加不加没什么太大区别,也许是我的样品里蛋白不多吧
异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样.只不过用量少一点,0.6V~1V就够了,不像乙醇沉淀需要至少2V,一般需要2.5倍体积.在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀.不过感觉效果不如乙醇,偶尔会有沉淀不出来东西的时候
本实验采用的0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。
