盐酸胍的分子结构数据

盐酸胍法辛属于抗高血压药物，用于治疗中度至重度高血压。化学名称为N-脒基-2-（2,6-二氯苯基）乙酰胺单盐酸盐，其分子式为：C9H9Cl2N3O·HCl，分子量为282.55，结构式为：

盐酸胍法辛为白色至类白色结晶粉末，难溶于水和乙醇，在甲醇中有相对较高的溶解度（>30mg/mg）。

盐酸胍法辛是选择性α2-肾上腺素受体增效剂，最早用于治疗中度至重度高血压，以口服给药的片剂给药，在美国的商品名为Tenex，规格为1mg或2mg。

由于盐酸胍法辛该药物具有很强的中枢作用，且该药物血浆蛋白结合率高，普通剂型释放速率过快使得血药浓度峰值偏高，诱发其副作用，如倦睡、头晕、入睡困难、恶心、呕吐、健忘等。

目前，盐酸胍法辛的合成报道不多，文献报道的方法主要有以下5种。

方法一：2,6-二氯苯乙腈溶于甲醇，缓慢加入浓硫酸，80℃加热进行醇解，保温12h，反应完毕缓慢加入到含有少量水的甲醇中搅拌30min，蒸馏回收大部分甲醇后，再加入适量水，用乙酸乙酯提取，有机层干燥旋蒸除去乙酸乙酯，得2,6-二氯苯乙酸甲酯；将2,6-二氯苯乙酸甲酯溶于异丙醇，然后将溶液加入到胍的异丙醇溶液中，室温搅拌10h，真空抽滤得胍法辛粗品。向粗品中加入异丙醇调成浆状后，用盐酸乙醇调pH值约1～2,真空抽滤，除去不溶物，滤液浓缩得盐酸胍法辛；

该方法以浓硫酸制备2,6-二氯苯乙酸甲酯，而浓硫酸容易残留。

方法二：2,6-二氯苯乙酸溶于甲苯后加入到胍的甲苯溶液中，120℃加热回流12h，减压蒸馏除去甲苯，得胍法辛粗品，将胍法辛粗品加入到异丙醇中调成浆状，用盐酸乙醇调节pH值约1～2,真空抽滤，除去不溶物，滤液浓缩得盐酸胍法辛；

该方法工艺简单，但使用了毒性较大的甲苯作为反应溶剂。

 由于外界因素作用，使天然蛋白质分子的构象发生异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化，这种现象称为蛋白质的变性。变性可以涉及次级键、二硫键的断裂，但不涉及一级结构上肽键的断裂。

 盐酸胍和尿素变性蛋白质包括两种机制：第一种机制是变性蛋白质与盐酸胍和尿素优先结合，形成复合物，当复合物被除去，反应平衡移动，随着变性剂浓度的增加，天然状态的蛋白质不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；第二种机制是盐酸胍和尿素对疏水氨基酸残基的增溶作用，因为盐酸胍和尿素具有形成氢键的能力，盐酸胍和尿素在高浓度(4～8mol/L)水溶液时能断裂氢键，结果盐酸胍和尿素就成为非极性残基的较好溶剂，使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加，从而使蛋白质发生不同程度的变性。

 二者在蛋白质变性中的差别：

 浓度 ：在室温下，3～4mol/L盐酸胍可使球状蛋白质从天然状态转变至变性状态的中点，通常增加变性剂浓度可提高变性程度，约6mol/L盐酸胍可以使蛋白质完全转变为变性状态。盐酸胍由于具有离子特性，因而比尿素的变性能力强。一些球状蛋白质，甚至在8mol/L尿素溶液中也不能完全变性，然而在8mol/L盐酸胍溶液中，它们一般以无规卷曲(完全变性)构象状态存在。

 溶解度 ：尿素溶解能力较盐酸胍慢而弱，溶解度为70%~90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但其具有不电离，中性，成本低等优点；盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰，但成本较尿素高、在酸性条件下易产生沉淀、可能对后续实验有干扰等缺点。

 总体而言，作为蛋白质变性过程中常用的试剂，盐酸胍和尿素的优缺点分别为：盐酸胍溶解能力和变性能力相对较强，不会造成重组蛋白质的共价修饰，但有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点；尿素溶解能力相对较弱，但具有不电离、呈中性、成本低、蛋白质复性后不会造成大量蛋白质沉淀等优点。在实际实验中，研究人员需要根据条件及目的进行选择，以获得最优的实验结果。

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残基（residue）： 氨基酸连接成肽链后，肽链上的一个氨基酸单位被称为残基，带有游离α-氨基的一端被称为氨基(末)端(或N端)，带有游离α-羧基的一端被称为羧基(末)端(或C端)。

谷胱甘肽（Glutathione，GSH，GSSG）： GSH可被氧化成GSSG，GSH作用在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。例如，它可防止H2O2将红细胞中血色素的二价铁氧化成三价铁形成高铁血红蛋白。

催产素（oxytocin）： 由垂体后叶制造的 9肽，能刺激子宫收缩；

舒缓激肽（bradykinin）： 9肽，能使呼吸道平滑肌收缩，抑制组织炎症。

甲状腺素释放因子（TRH）： 3肽，下丘脑分泌，能刺激垂体前叶促甲状腺素释放，发挥作用浓度极低。

脑啡肽（enkephalin）： 神经递质的一种，能改变神经元对经典神经递质的反应，起到修饰经典神经递质的作用，又称神经调质（neuromodulator），又被称为“脑内吗啡”。

牛催产素（oxytocin）： 引发分娩时的子宫收缩，刺激乳汁分泌。减少肾上腺酮等压力激素水平，降低血压。

牛加压素（vasopressin）： 又名抗利尿激素，可调节细胞的进水量，增加肾中水的重吸收，并刺激血管收缩而增加血压。

鹅膏蕈碱（Amanita phalloides，Α-Amanitin）： 双环8肽毒素，分泌与毒蘑菇，对动物有致死作用，真核生物RNA聚合酶II有抑制转录作用。

多亚基蛋白质： 含有两条或更多条非共价结合的多肽链的蛋白质。

原体： 不同的亚基形成小的寡聚体(oligomer) ，并以此进一步装配。这种小的寡聚体被称为原体。

胰岛素： 胰岛β细胞分泌的，受到内源性或外源性物质如葡萄糖刺激分泌的蛋白质激素，能够降低血糖。胰岛素的两条多肽以二硫共价键连接，不是多亚基结构。

天冬氨酸氨甲酰磷酸转移酶由6个调节亚基（R）和6个催化亚基（C）组成，装配时先由1个C亚基和1个R亚基组成一个原体CR ，再由6个原体装配成一个有活性的酶。

从蛋白质的大小估算氨基酸残基数：

可以从一个不含有其他化学基团的蛋白质分子估算其中的氨基酸残基的大概数目，用蛋白质的分子量除以110，即为组成氨基酸的数目。

【20种氨基酸的平均分子量为138，较小的氨基酸在多数蛋白质中的丰度高，如果考虑不同氨基酸在蛋白质中出现的比例，氨基酸的平均分子量只有128，形成肽键时失去一分子量18的水分子，因此，蛋白质分子中氨基酸残基的平均分子量为128-18=110。】

二面角(Dihedral Angle)： 肽键平面之间的α-碳原子，可以作为一个旋转点形成二面角(dihedral angle)，绕Cα-N键轴旋转的二面角（C-N-Cα-C）称为φ，绕Cα-C键轴旋转的二面角（N-Cα-C-N）称为ψ。

寡聚蛋白质： 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。

蛋白质的酸水解： 常用6 mol/L HCl或4 mol/L H2SO4在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是Trp被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如Ser或Thr有一小部分被分解；Asn和Gln侧链的酰胺基被水解成了羧基。

蛋白质的碱水解： 一般用5 mol/L NaOH煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是Trp在水解中不受破坏。

蛋白质的酶法水解： 用于蛋白质肽链断裂的酶称为蛋白水解酶（proteolytic

enzyme）或称蛋白酶（proteinase）。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。蛋白酶分为内切酶（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶）和外切酶（羧肽酶、氨肽酶）。

胰蛋白酶（Trypsin）： 属于内切酶一类，水解位点为Lys（K）和Arg（R）的C端，但若其C端连接的是Pro则水解会被抑制，该酶专一性强，水解速度快。

胃蛋白酶（Pepsin）： 属于内切酶一类，水解位点为Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其他疏水性氨基酸的N端，如果其N端连接的是Pro则水解会被抑制，该酶水解速度快，胃蛋白酶一般处于pH2的环境。

糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）： 属于内切酶一类，水解位点为芳香族氨基酸的C端，如果其C端连接的是Pro则水解会被抑制，存在于pH8·9的环境。

嗜热菌蛋白酶（Thermolysin)： 属于内切酶一类，水解位点为水解位点为除了Pro和Gly的疏水性氨基酸的N端，若其N端连接的是Pro则水解会被抑制，水解速度和氨基酸疏水性大致成正比。

专一性水解：

1. BrCN水解Met的C端

2. NH2OH（羟胺）较为专一的断裂Asn-Gly，对Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂。

3. NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）专一裂解-Cys-，产率高于90%。

N末端氨基酸测定方法：

1. Sanger法

2. Edman法

3. DNS-Cl

4. 酶降解法

C末端氨基酸测定方法：

1. 肼解法

2. 酶降解法

3. 硼氢化锂法

二硫键的断裂： 在8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

二硫键的切割与保护：

1. 过甲酸（performic acid）氧化，巯基被氧化为-CH2SO3H；

2. 还原+氧化；

3. 亚硫酸（Sulfitolysis）分解。

Cys 的不稳定性：

1. Cys受空气氧化而形成Cys-Cys。

2. Cys和Cys-Cys会发生交换反应。

3. 分析氨基酸组成时，Cys容易受修饰而不利于定量。

4. S-S键使蛋白酶难于作用。Edman反应中不能形成稳定的PTH-AA。

5. 多条肽链以S-S键相连，拥有两个以上N末端，无法用Edman法测序。

N端的测定方法：

1. Sanger法

2. Edman法

3. Dansyl chloride/Edman法

4. 酶降解法-氨肽酶法

酶解法末端测序： 外切蛋白水解酶（exo-peptidase）将肽链的氨基酸从N端（氨肽酶，aminopeptidase）或C端（羧肽酶，carboxypeptidase）一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。

氨肽酶（aminopeptidase）法： 优点是可连续测定N-端多个AA；条件温和；缺点是酶反应通常是可逆的，水解不彻底，易因酶对末端AA的反应性不同而导致判断失误。

C端的测定方法：

1. 肼法（Hydrazine）

2. 3H标记法

3. 酶降解法-羧肽酶法

4. PFPA和PFPAA法

二硫键位置测定： 一般采用胃蛋白酶水解+对角线电泳方法。胃蛋白酶的作用pH有利于防止二硫键发生交换。

 DTT中文名称为二硫代苏糖醇，是苏糖醇的C-1及C-4位羟基置换成巯基的化合物，常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。

 DTT有两个巯基基团，其作用能维持3~7天，挥发性不强，使用时可以直接加入到悬滴中去，或通过微透析的方法加入。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如盐酸胍、尿素或SDS）。反之，根据DTT存在情况下，二硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。另外，DTT可以使Ni被还原，因此在用Ni柱纯化带有His标签的蛋白时要避免使用DTT，而应该考虑TECP。

二硫键的断裂通常需要有大量的自由巯基和二硫键交换，三价膦系衍生物由于其较强的还原能力和对二硫键的选择还原性得到很多研究者的青睐。这类还原剂的还原是一个定量反应的过程，其原理是其中心原子“P”所带的孤电子对能与氧原子形成配位共价结合而具有还原性。如下式所示:

 TCEP，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，是三价磷系衍生物中作用最优的。它是一种无色、无味、易溶于水的弱还原性物质，在水中溶解度能达到310mg/mL。其在空气和水溶液中具有较高的稳定性，受温度和浓度的影响小。TCEP是一种极为合适的部分还原试剂，对还原二硫键选择性极强，除半胱氨酸外，几乎没有与其它氨基酸的副反应，并且能在更宽的pH值范围包括酸性条件(pH值3)下使用，从而有效减少酰胺键的水解。TCEP的反应活性温和、易溶、毒性小，且更容易操作，在酸性、碱性溶液中的稳定性都很好。而且还原能力比DTT强，它的作用可以维持2~3周，是公认的DTT(二硫代苏糖醇)的一种良好替代物。

 DTT(二硫代苏糖醇)和TCEP（三(2-羰基乙基)磷盐酸盐）可以相互代替，只是效果不同而已。与DTT相比，TECP还原能力更强，更具有选择性；无论在酸性还是碱性条件下都更加稳定；本身不带有电荷，不影响后续的实验。TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉，因而在蛋白质化学及蛋白质组学研究常常优先选择TCEP。

一棵苹果，掉在牛顿头上，就产生了万有引力，和现代力学；

正是因为牛顿发现并精准定义了这种模式：重物向“下”落，而不向上飞；

才导致这种模式背后规律，万有引力的发现。

科学发展史上也有很多这种“苹果”，

孟德尔看到了红花，白花，粉花的开花的统计规律，开创了遗传统计学，并导致了后来DNA的发现；

门捷列夫把元素和化学性质排成表格，发现了元素周期律；

路易斯发现了稳定化合物中元素成键的8电子配对律，并发展出了价键理论；

此外，把一些复杂的现象总结成为简单的模式或者概念，可以大大帮助我们理解一些规律，

比如，化学基团的亲电性和亲核性，物质的亲水性和疏水性。

所以，发现一种模式，就像发现了科学的矿井一样，可能挖掘出重大的理论或概念。

不过，还有很多模式或者现象还尚未被理解或解释，

比如，最近科学网上讨论的热水比冷水先结冰的现象，还有，这里要谈的物理化学发展史上的霍夫梅斯特序列。

100多年前，葡萄牙科学家Hofmeister发现了一个与蛋白质变性剂有关的规律。

我们知道，煎鸡蛋时，蛋清会成为蛋白，就是因为煎锅热使蛋白质失去它的天然结构，转变成为了不透明的肽链聚合物。这种转变就称为蛋白质变性。此时蛋白质失去特有的结构和功能。不仅加热可以使蛋白质变性，加某些盐、糖、或者有机小分子比如尿素，也能使蛋白质变性，称为化学变性。你说通常往鸡蛋清里加食盐(NaCl)并没有看到蛋清变浑浊啊？是的，不同的盐有不同的变性效果。有的盐，加一点就可以使蛋白质变性，比如硫氰化钠(NaSCN)，盐酸胍(GdmCl)， 有的盐，则需要加很多才能起效，或者在达到最大溶解度时也不能使蛋白质变性，比如NaCl， Na2SO4。

我们也知道，盐溶解于水会成为离子，因此，加盐使蛋白变性的过程必然是离子起的作用，那么，把这些离子按照它们变性能力，或者说起变性作用时的浓度，按照大小排个序，这就是Hofmeister Series，霍夫梅斯特序列。

霍夫梅斯特发现的序列是这样的，SO42- >Cl- >NO3- >Br- >I- >ClO4- >SCN-

为什么只有阴离子呢？阳离子序列也是存在的，只不过，Hofmeister发现起变性作用的，主要是阴离子的功劳。

随后发现，Hofmeister发现的这个序列，对涉及离子的很多现象适用，比如，盐离子不仅影响蛋白质胶体的稳定性，而且影响其溶解度，即稀的盐溶液可以增加或减小蛋白质的溶解度。那么在同等浓度下，按照对蛋白质的溶解度大小的改变排列，可以发现相同的离子序列。

除了蛋白质溶液，离子对其它大分子胶体溶液的稳定性和溶解度，也有类似的序列；

除了胶体溶液，盐离子对纯的盐溶液的性质，也有相同序列。比如，加盐可以改变水的粘度和表面张力，对离子的这种能力列表，可以发现类似的Hofmeister序列。

在过去的100年中发现的数十种序列中，虽然有小部分反例，但大多数序列中离子的位置是一致的。这说明在此序列背后，存在类似的规律决定了离子对液体水的性质的改变，和对蛋白质，多肽和DNA等对胶体溶液的性质的改变。当然，正如有的人反驳的那样，这些序列存在不能说明这些性质都是有相同的规律支配的。但是，至少可以肯定，在与离子有关的一些热力学和动力学规律中，离子某种性质起了主要或大部分作用。毕竟，静电作用（指离子-离子，离子-偶极）是离子溶液中所有分子间作用中最强的作用，其它作用包括溶剂水分子之间的偶极-偶极作用，所有种类之间的短程排斥，和色散、诱导作用。在水溶液中，后面这些作用相比静电作用要弱的多。

那么，有没有理论能解释这个某个现象的Hofmeister序列呢？还没有。比如，预测经典稀溶液活度系数的德拜-休克而离子强度理论，描述胶体稳定性的DLVO理论，均认为溶液性质只与离子的电荷和浓度有关，却并不包括“同种电荷离子具有不同Hofmeister效应”的参数项。把离子的大小考虑进来，能够显著改进现有理论，这就是所谓的“电荷密度解释”。但是，只考虑“电荷密度”也不能完全解释Hofmeister序列，毕竟，水在其中的作用不可忽视。

目前，理论界关注的焦点是离子的溶剂化效应，即关注离子-水之间的作用。当前的一些现有理论，不管是离子强度理论，还是电荷密度理论，都把溶剂水看成连续的，均匀的，不变的。但是，我们早就知道，离子溶于水以后，会和水分子结合形成溶剂壳层(Hydration shell)。这种壳层结合会减少自由活动的水分子，或者减少可供大分子表面结合的溶剂分子数量。此外，离子在水中运动，会带着自己的溶剂壳层一起运动。当然，溶剂壳层中的水分子，并不是固定不变的，它们以一定的频率与外界的自由水分子进行交换。溶剂化效应至少从密度和扩散两个方面影响着整个液体水的性质，即含离子的水不再是均匀的，连续的。要想构造一个理论，来考虑这种不均匀性，至少要搞明白离子对溶剂壳层的水分子有什么影响，对壳层之外的水分子有什么影响，这种影响能够持续多远。

目前，对于离子-蛋白质稳定性/溶解度序列的解释，主要有两种粗糙的观点，一种观点认为，离子对溶剂水的影响局限在壳层内，对壳层外的水分子没有任何影响，因此离子对蛋白质等胶体大分子稳定性的影响，通过与胶体分子直接接触起作用；这种观点称为“直接作用模型”；另外一种观点认为，离子不仅影响壳层内的水分子，而且影响壳层外的水分子，所以无需直接接触大分子，即可影响胶体大分子的溶解度或者稳定性。这种观点称为“间接作用模型”。支持直接作用模型的，主要是Bakker等发展的介电响应光谱发现壳层外的水分子的重取向运动（转动周期）与离子的存在没有任何关系。支持“间接作用模型”的实验主要是一些红外光谱，发现了水的氢键网络模型受到离子的影响，尽管这种影响的幅度有争议。

在这个领域，要想提出一个合理解释和一个理论模型，就要尽可能搜集所有实验事实，然后进一步设计实验验证。但是，在分子尺度上研究其结构和动力学很难，因为水分子太小了，氢原子的量子效应也比较强；此外，要想解释已有的实验现象也很难，因为很多实验现象本身也很有争议。比如，绝大多数实验都是在阴阳离子共存的溶液中做的，在分解贡献时都难免采用含混不清的近似理论。最近几年，UC Berkeley的Evan R. Williams课题组用质谱打出只包含一个离子的水分子簇并结合红外光谱(IRPD)进行研究，能够排除这个问题，但是红外光谱能够获取的信息还是很有限的。

按说，使用分子模拟方法应该很容易研究溶剂化效应，在实际中的确如此，比如用中子散射确定溶剂壳层中的水分子个数，一般要和模拟得到的结果做对比，因为实验本身的分辨率很低。不过，能够用来模拟水溶液的适用理论的准确度都不高：用经典力场吧，它们的参数都是拟合宏观实验值的，不保证微观结构的准确性；用密度泛函理论(DFT)吧，色散成很大问题，导致熔点、沸点跟实验值差100K以上，还不如经典力场。

毫无疑问，Hofmeister series背后，隐藏着离子-溶剂二元体系，和离子-水-胶体大分子三元体系热力学的一些秘密。这些秘密能够帮助我们建立一个可预测性质的理论。然而，鉴于其中的物理和数学的复杂性，这个领域仍然在期待着天才的降临。

（1）100kD蛋白的纯化可以分为两步：离子交换和分子筛。因为48kD和75kD的蛋白等电点与目的蛋白相差很大，所以在相同的buffer条件下，前两者带点性质与目的蛋白相差很大，通过离子交换的方法可以将三者分开。具体来说可以选用pH5.5左右的buffer，用Q柱纯化。54kD的蛋白和100kD的蛋白电荷性质类似，通过离子交换层析可能分不开，但二者分子量有近两倍的差距，适用于分子筛，所以第二步选用合适的分子筛利用二者分子量的大小分开即可。

（2）6M盐酸胍处理之后除了肽键和二硫键无法打开之外，蛋白完全变性。这种条件下测得的分子量是25kD，加入beta-ME之后二硫键被还原打开，测得分子量为10kD和15kD，说明这二者是通过二硫键相连的，所以结构为一个10kD和一个15kD的亚基通过分子间二硫键的作用连成二聚体。也有可能是异源四聚体，异源六聚体，异源八聚体等等。因为第一步测定的分子量是在盐酸胍条件下，多聚体之间如果没有二硫键连接也会被解聚。如下图：