玉米幼苗测可溶性糖的蒽酮硫酸法
植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。
（一）苯酚法测定可溶性糖
【实验原理】
植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。
【实验仪器及试剂】
1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。
2．试剂：
（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。
（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。
（3）浓硫酸（比重1.84）。
（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。
【实验步骤】
1．标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。
式中：C一标准方程求得糖量（ug）
α一吸取样品液体积（mL）
V－提取液量（mL）
n一稀释倍数
W一组织重量（g）
（二） 蒽酮法测定可溶性糖
【实验原理】
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应X 所以用愈酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用意酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比色。
【实验仪器及试剂】
1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20ml刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。
2．试剂：
（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数周，如有结晶析出，可微热溶解。
（2）浓硫酸（比重1.84）
【实验步骤】
1．标准曲线的制作：按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1min取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
2．可溶性糖的提取同方法一第二步。
3．显色测定：吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。
4．计算可溶性糖的含量，计算公式同方法一。
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有许多不同的分析技术用于糖的分离和测定,包括化学分析、比色分析、纸色谱、薄层色谱、气相色谱和高效液相色谱等。本文总结了近十年植物组织中糖类化合物的研究进展，为其含量测定提供理论依据。
1 分光光度分析法
分光光度法是基于长链多糖在水溶液中离解后可与染料等阳离子相互结合发生反应，从而引起染料吸收光谱的变化进行测定。这种方法具有较好的选择性，可以用于实际样品的测定，通常有两种常见方法。
1.1 蒽酮 - 硫酸比色法
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为 630 nm，可在此波长下进行比色。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖和己糖而且可以测寡糖和多糖，在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量。蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，但测定结果误差较大，只能测定样品中可溶性糖总量。陈鸿英等人用蒽酮硫酸法测定淫羊藿多糖的含量，得到的结果较稳定。
1.2 苯酚 - 硫酸比色法
植物体内的糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定糖的原理是在浓硫酸作用下，糖脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10mg～100 mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485 nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定 160 min 以上。
2 气相色谱法
气相色谱法是以气体作为流动相的一种色谱分析方法气相色谱法测定糖类，具有选择性好、样品用量少、分辨率高、快速准确、灵敏等优点。曾昭睿采用三 - 端烯丙基 - 不对称二苯并 14- 冠 - 4- 二羟基冠醚做固定相分离了鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的乙酸酯衍生物。吴建元等人利用气相色谱法分析茯苓多糖的单糖组成结果 6 种标准单糖的衍生物实现了良好的分离并具有良好的峰形。胡磊等人用 1 一甲基咪唑为溶剂和催化剂、盐酸羟胺和乙酸酐为肟化和乙酰化试剂，对植物样品中糖与糖醇进行乙酰化衍生化利用气相色谱分离和质谱鉴定的分析方法。
3 高效毛细管电泳法
除了少数带有羧基和磺酸基的糖类化合物，绝大多数糖类化合物不带电荷，极性很大且没有发色基团。所以用一般的高效毛细管电泳系统无法得到分离和检测。为了使糖类化合物能产生电迁移而得以相互分离，可采用的方法有：（1）衍生化使之带上发色、荧光基团或电荷；（2）与硼酸盐等络合；（3）与缓冲液中的添加剂形成包合配合物；（4）高 pH缓冲条件下使之电离；（5）加入表面活性剂使形成胶束。20世纪 90 年代以来毛细管电泳因具备分离快速，所需样品量少和自动化程度高的特点，已广泛应用于糖化合物的分析。
4 高效液相色谱法
HPLC 用于糖的定性和定量分析具有快速、灵敏、样品处理简单等优点。从大量的文献报道和综述中可以看出，由于糖的特殊结构及它本身不含强紫外和荧光吸收的官能团，到目前为止还没有建立一个统一的方法来分析所有的单糖和低聚糖。分析糖的色谱柱有化合键合烷基柱、阴阳离子交换柱、氨基键合硅胶柱和硅胶柱等。
文献来源：孙艳涛，由欣. 植物组织中糖化合物测定方法的研究进展.科教文汇(上旬刊). 2011,10(上旬刊) ：134-135.网页链接
依据：
还原糖在碱性条件下，自由的醛基酮基会变成非常活泼的希二同类不具有醇，后者具有极强还原性可以使 3, 5二硝基水杨酸还原。酮糖具有还原性，而普通的同类不具有，故无还原 3, 5二硝基水杨酸的能力。
二、蒽酮-硫酸法
依据：
糖类遇浓硫酸脱水生产酮醛或其他衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液颜色为蓝绿，在620nm处有最大光吸收波长，显色与多糖含量呈线性关系。
糠醛与蒽酮作用行测一种蓝绿色的络合物，在620nm处有最大吸收。
糠醛与苯酚作用形成橙黄色化合物，在490nm处有最大吸收。
二者的颜色深浅与糖含量呈正相关。
DNS：在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。
蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。因此可用此方法测定多糖含量。它的精确度不如DNS法高。
那不是的 明白它的反应原理就知道不是多糖，蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应。
苯酚-硫酸法是用得较多的方法，苯酚-硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490 nm处有最大吸收值，吸收值与糖含量呈线性关系。此法是先用标准糖制作标准曲线后，再通过多糖的显色反应测定吸光度，然后根据其在曲线上的位置推算出多糖的浓度从而推算其含量。此法操作简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅需制作一条标准曲线。蒽酮-硫酸法是另一种常用的方法，其原理是利用糖类遇浓硫酸脱水后生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合，反应后溶液呈蓝绿色，于620 nm处有最大吸收，显色深度与多糖的含量呈线性关系。
目前，在制作标准曲线的标准品的选用上普遍存在争议。葡萄糖因为其低廉的价格和方便的来源，一直是研究人员的首选。但当我们深究比色法的原理，发现其本身不能区分单糖和寡糖，所以它的测定结果很大程度上依赖于标准品的选择。此外，比色法通常用浓硫酸短时间水解粗多糖，对于分子量较小的粗多糖，高浓度的硫酸可以在较短时间内将其水解成寡糖和单糖，但当粗多糖的分子量较大时，水解是很难控制的。比如对香菇粗多糖（分子量500,000~1,000,000）的完全水解就需要4M HCl或2M H2SO4于100℃作用3-6小时。因此如果用葡萄糖做标准曲线，势必对粗多糖样品中大分子部分的测量带来很大的误差。所以，国内外的学者的研究数据表明：1）对于比色法测定当标准品与被测样品的结构类似时，得到的结果要准确得多[1]；2）用葡萄糖做标准品和用葡聚糖做标准品测粗多糖含量时，前者测的结果不同程度的偏高[2, 3]。这样看来，用葡萄糖作为测定多糖含量的标准品是不合适的。
认识到这一事实，人们开始逐渐改用葡聚糖作为测定粗多糖含量的标准品，最为广泛使用的是分子量为500,000的葡聚糖(经中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所验证)。百特纯大分子科技有限公司(Putus Macromolecular Sci.&Tech..Ltd)是主要从事碳水化合物大分子领域的新品研发及应用的国际公司，制造并提供高质量、高纯度、高均一性的具有特定分子量和支化度的碳水化合物大分子标准品及其相关产品。我公司采用β-葡聚糖含量最高的燕麦作为原料，提取的燕麦葡聚糖是一种β-(1, 3)和β-(1, 4)糖苷键连接而成的线性多糖，我们使用先进的工艺和技术对粗多糖进行分级，得到分散度极窄(1.01-1.05)的，分子量范围从10, 000到1, 800, 000的单分子量燕麦β-葡聚糖标准品，不含淀粉、蛋白质等杂质，水溶性好，稳定性高。更宽泛的分子量，更窄的分散度，更有竞争力的价格，这无疑缓解了目前国内在粗多糖含量测定中多糖标准品一品难求的局面，为获得更准确的实验结果和更稳定的实验数据提供了有力保证
