南宁市西陇化工有限公司怎么样

在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。

一、标本的采集种类和要求

1、推荐采集的呼吸道标本种类

疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）

2、拭子的选择

标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）

3、临床标本储存要求

保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。

4、标本的分装处理

标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。

5、标本的运输

疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。

二、核酸检测

基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。

1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：

4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。

2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：

目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。

三、病毒分离鉴定

可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。

四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全

（一）实验室级别及个人防护

1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。

2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。

（二）健康监测

1、所有人员均应自测发热及其他症状。

2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。

3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。

五、附表和附件

附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单

附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单

附件3： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（中文）

附件4： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（英文）

附件5： RT-PCR方法检测甲型流感病毒

附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法

附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法

附表1

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡。

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

采集人员： 采集单位（盖章）：

附表2

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量*

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。

填表人员： 送样时间： 单位（盖章）：

附件3

real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程

中文翻译版（请同时参考英文原版）

请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。

美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)

本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。

一、概 述

（一）前提

本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。

（二）实验原理

实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan&reg探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。

（三）使用条件

一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。

（四）生物安全要求

样本处理应在相应的生物安全实验室完成。

（五）样本要求

1、呼吸道样本

支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。

2、排除标准

1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本

2）以上未列的其它不当样本

（六）核酸提取

RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp&reg病毒RNA提取试剂盒，RNeasy&reg小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。

（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。

二、实验材料

（一）试剂

1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；

2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；

3、正反向引物 (40μM)；

4、双重标记探针(10μM)；

5、阳性对照。

（二）供给

1、实验室标记笔；

2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；

3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；

4、0.2ml PCR 反应管盘；

5、光学反应盖板；

6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；

7、一次性无粉手套。

（三）仪器设备

1. 微量离心机；

2. 漩涡振荡器；

3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。

三、操作程序

（一）准备工作

1. 避免样品污染

由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：

1）实验准备与核酸提取使用独立区域；

2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；

3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；

4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；

5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。

2、仪器准备

工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzap”或者“RNase AWAY&reg”来减小核酸交叉污染的风险。

3、试剂准备

注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。

1）引物和探针

（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；

（2）涡旋振荡引物和探针；

（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。

2）Real time RT-PCR的试剂

（1）将Master Mix和酶置于冰架上；

（2）融化2×的Reaction Mix；

（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；

（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。

4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测

1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。

2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。

3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。

5、建立反应

反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。

1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；

2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

3）Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：

* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。

5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；

6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；

7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：

实验建立举例：

实验样本举例：

注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。

8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。

9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。

10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。

11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；

12）将提取的核酸样本置于冰架上；

13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操作。

14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；

15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；

16）对剩下的样本，重复步骤13-15；

17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。

18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。

19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。

6、RT-PCR扩增条件

反应体系为25ul，反应条件如下：

注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。

* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

7、解释说明/检验

1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。

2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：

（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；

（2）没有足够的人类细胞以备检测；

（3）方法建立和实施不当；

（4）试剂和仪器原因。

3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：

（1）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。

（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。

（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。

（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。

（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。

8、限制规定

1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。

2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。

3）如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来重复试验。

9、备注

引物和探针参见英文版P7。

附件4

real-time RT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感操作规程

（英文版）

附件5

基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

一、目的

对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。

二、引物 NIC引物 引物名称 碱基组成 目的片段大小 备注 FluA FluA-M-F30 TTCTAACCGAGGTCGAAACG 235bp 甲型流感病毒M基因通用检测引物 FluA-M-R264 ACAAAGCGTCTACGCTGCAG H1HA H1 F1147 AAGAGCACACATAATGCCAT 527bp H1N1亚型检测通用引物 H1 R1673 CCATTRGARCACATCCAG HuH1HA H1HA F768 ACTACTGGACTCTGCTGGAAC 327bp 人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物 H1HA R1094 CAATGAAACCGGCAATGGCTCC SWH1HA-1 SW-H1 F786 AATAACATTAGAAGCAACTGG 153bp 此次甲型H1N1亚型流感病毒引物 SW-H1 R920 AGGCTGGTGTTTATRGCACC RnaseP RnaseP F AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 约80bp 与real-time PCR中RnaseP引物一致 RnaseP R GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 三、材料及仪器

1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）

2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）

3、70%乙醇

4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）

5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）

6、检测引物

7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C

8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C

9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头

10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器

11、可调转速14K离心机：

12、旋涡混合器：

13、生物安全柜：二级生物安全柜

14、PCR仪：

15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685

16、核酸染料：

17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718．电泳槽、电泳仪

四、实验步骤

（一）RNA提取

1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。

2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。

3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。

4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。

5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。

6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。

7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。

8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。

9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。

10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。

注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。

（二）反应体系配制

1、实验设计：

检测标本RNA

质控参数：

阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）

阳性对照：已知病毒RNA

2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）

1）按下表加入试剂：

PCR反应体系 组 分 体 积（μL） RNase Free Water

5×RT-PCR Buffer 11.9×n

5×n 10mM dNTP Mixture 1×n Enzyme Mix 1×n RNase Inhibitor 0.1×n 上游引物 0.5×n 下游引物 0.5×n Total 20×n 对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。

3）加RNA模板（在核酸提取区）

将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。

3、RT-PCR反应

将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR

扩增，反应程序如下： 温度 (C) 时间 循环数 60℃ 1min 1 42℃ 10min 50℃ 30min 95℃ 15min 94℃ 30s 35 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 7min 1 4℃ 保存 4、RT-PCR产物检测

1）2.0%琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。

2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。

3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。

4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。

5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。

5、结果判断

在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下： PCR引物 待检样品1 待检样品2 待检样品3 待检样品4 待检样品5 待检样品6 FluA _ + + + + +/- H1HA _ _ + + + +/- HuH1HA _ _ + _ _ +/- SWH1HA-1 _ _ _ + _ +/- RnaseP + + + + + _ 结果判断 非甲型流感病毒 甲型流感病毒

非H1N1亚型 人季节性H1N1亚型流感病毒 猪H1N1亚型流感病毒

送国家流感中心复核 送国家流感中心检测 标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题

在细胞的研究和利用过程中，最主要的是要为细胞提供最适的生长条件，保持细胞培养开始时的群体状态。这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规，而且细胞培养，试剂昂贵，费时、费力，不是随随便便就可以进行的。

细胞只有在最适生长条件下，才会保持正常的核型及功能。如果培养条件上打折扣，就意味着会出现带有染色体重排或突变变异株细胞。某些营养成分或生长因子用量不足或细胞高密度培养时间过长，都不是最适生长条件。

二、平衡盐溶液

平衡盐溶液具有维持渗透压、调节酸碱平衡的作用，同时可以供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。最常用于洗涤组织或细胞、配制培养用液的基础溶液是Hanks 溶液和磷酸缓冲盐溶液（简称PBS) 。

三、血清

血清中含有丰富的营养成分，包括多种生长因子及许多未知成分。动物细胞的生长都依赖血清。血清的种类很多，包括胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等。

选择一批最适于细胞的血清是很重要的，而且如有可能的话，应要求购买来源公司保留足量，以供应实验使用。这样可避免反复试用以选择最适血清所产生的费用。血清的质量可以通过检测细胞的克隆形成率来衡量。取对数生长期的细胞彻底消化后，以低密度（直径6mm 的平皿中加入约103个细胞）接种5~6 个平皿， 其中一个平皿中加入含30％血清的培养液，以测定高浓度血清的细胞毒作用。7~ 10d 后，出现肉眼可见的克隆时，倒掉培养液， 2％亚甲蓝染色2~5min,观察克隆形态、计算克隆形成率。克隆形成率一般为5%~ 10%。

四、抗生素

一般细胞培养时，抗生素不是必需添加成分。但一些特殊情况下培养液内需加入适量的抗生素，如怀疑有污染、原代培养时、新手操作不够熟练。常用的抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素。青霉素常用剂量为100U/ml ,链霉素常用剂量为100μg/ml。常配制成100 倍或200 倍， 分装为小包装， 于－20℃条件下保存。一次用一个小包装， 避免反复冻融 。

五、特殊的添加因子

特殊的添加因子可以使细胞培养的条件得到优化。原代培养细胞接种密度需适当提高，应尽可能用营养丰富的培养液，如使用胎牛血清。这些都属于一般优化条件。细胞培养条件优化的原则是：根据细胞类型， 模拟体内环境， 添加不同的细胞生长因子及有利于细胞生存、增殖的添加剂。表1 是常用的细胞培养添加成分。

表 1 常用的细胞培养添加成分

一种细胞生长因子常常是多种细胞的丝裂原，如碱性FGF, 不仅是成纤维细胞的丝裂原，还是内皮细胞、角质细胞、黑素瘤细胞的丝裂原。EGF 可促进上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞及平滑肌细胞等多种细胞的增殖。

培养干细胞时，常添加白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF ) ，又称分化抑制因子( DIA )， 是一种分泌型多肽，可抑制小鼠干细胞的自然分化。一般，可用纯化的LIF 直接加到培养液中，或使用用LIF表达载体转染过的饲养层细胞。正常的STO 细胞也可分泌。STO 细胞还分泌其他一些促干细胞生长的因子。目前，多数实验室仍使用饲养层细胞。重组的LIF 来源方便，与STO 细胞一起使用时，常用浓度为1000U/ml 。与小鼠胚胎成纤维细胞一起使用时，常用浓度为500U/ml 。

体外培养正常细胞需要使用不同生长因子的选择性组合。通常在已有的经典培养液配方基础上，添加不同因子而成。现在已有多种特定细胞培养液，且有商品供应，如血管内皮细胞培养液、神经干细胞培养液、骨髓干细胞培养液、间充质干细胞培养液、小鼠心肌细胞培养液(Claycomo Medium) 等。

六、消化液

细胞生长至一定密度时，需进行传代。消化液可使细胞脱离生长表面，离散成单个细胞。常用的消化液是0.25%、0.125％的胰蛋白酶和0.02％的二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 溶液，以无钙镁的PBS 或Hanks溶液配制。它们可单独使用，也可按一定比例混合后使用。大部分细胞的消化可使用终浓度为0.05%胰蛋白／0.02%EDTA混合液。有些上皮细胞贴壁力强，需较高浓度的胰蛋白酶(0.25%）或延长消化时间，甚至需要37°C温育。如果温育较长时间（超过20min)细胞仍不能脱壁，则应采取分步消化的措施，即将已脱壁细胞移出至离心管，加完全培养液中和胰蛋白酶的作用，对未脱壁的细胞再添加新胰蛋白酶再次消化。

七、细胞培养用的其他液体

细胞培养时，还会用到其他一些液体，如谷氨酰胺、HEPES 、丙酮酸钠、各种细胞生长因子、各种组织或细胞条件培养液，以及调整pH 使用的5.6%NaHCO3等。

谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，会导致细胞因生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故要适时添加。可配制200倍液体－20℃ 冰箱中保存，在使用前加入培养液内，终浓度为2mmoVL 。

HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH 7.2~7.4 范围内具有较好的缓冲能力，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠( 0.34g/L)共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。安全浓度范围10~25mmol/L。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。一些生长缓慢的细胞加入，可明显改善细胞状态。通常配制200倍液，-20℃ 冰箱保存，在使用前加入培养液内终浓度为1mmol/L。

另外， 2－巯基乙醇(2-Mercaptoethanol, 2-Me) 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清， 有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA) 对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术。也开始用于一些难以培养的细胞。常用终浓度为5×10-5mol/L。常配制成0.1mol/L 的储存液，用时每升培养液加0.5ml 。

战智湛一认定这个什么“安世元安参谋”是敌非友，就立马想把这个胆敢冒充“总部南宁工作站的副连职参谋”的什么“安世元安参谋”一把掐死。可是，战智湛的好奇心忽然大盛，他想知道这个名为“战友”，实为越南“猴子”的什么“安世元安参谋”所说的“红箭除恶”计划究竟葫芦里卖的什么药。

“鵟鹰”和“蛇雕”其实早就怀疑战智湛是总部南宁工作站姜站长的人，只不过战智湛自己不提，他们也就乐得装糊涂。这点组织性纪律性侦察兵们还是有的。

战智湛急忙震慑心神，勉强抑制住怒火，拼命地把嘴角往上翘，强装出一副谦恭的笑容，“咔吧”了“咔吧”小眼睛，信誓旦旦的说道：“安参谋，请你转告姜站长放心！……‘共产党员时刻听从党召唤，专拣重担挑在肩。’……完成你们总部南宁工作站的任务是俺们‘利剑部队’这几个人义不容辞的责任！呵呵……请你说一说任务的具体内容吧。……”

“唉……”阮氏安中尉叹了口气之后说道：“奉总部南宁工作站姜站长的命令，我和我的三位战友所执行的‘红箭除恶’计划主要内容就是除掉……除掉现在在‘涂台机场’的越军陆军总司令部的副总参谋长黎英贤中将！……”

“黎英贤中将？……为啥呀？……”战智湛吓了一跳，不由得脱口说道。

“这个什么‘大妖山魈’怎么傻乎乎的？……”阮氏安中尉见战智湛呆头呆脑，傻乎乎的望着自己，忍不住笑了笑，说道：“我们有纪律，执行任务从来不问为什么！……”

战智湛脱口问出“为啥呀？”是“没想到”的意思。是惊讶自己杀黎英贤中是为了给战友们和梅笑然报仇，可没想到越南“猴子”自己也要杀黎英贤中将。战智湛难免心中犯嘀咕：“越南‘猴子’为啥也要杀黎英贤中将？‘乖乖隆嘚咚，猪油炒大葱！’……这不是‘狗咬狗，一嘴毛’嘛。嘿嘿……也不知道这个啥‘安世元安参谋’是他娘的‘哪路溜子’？……”

战智湛憨厚的笑了笑，说道：“对不起，安参谋！俺的问题忒多了！……还是那句话，帮你们总部南宁工作站的同志完成任务，就是帮俺们自己。何况又是你们总部南宁工作站的同志救了俺们几个人。……一句话，完成‘红箭除恶’计划没二话。你就在这旮沓安心休息、养伤，俺们四个这就闯到越南‘猴子’的‘涂台机场’，把黎英贤中将这个老‘猴子’的脑袋瓜子割下来，带给你看。……然后，俺们四个保护你回国！……”

战智湛说到这里，阮氏安中尉不由得浑身哆嗦了一下，他猛然想起了情报总局的高参“三姓家奴”朴英植少将，不就是被这个“大妖山魈”割了脑袋吗？看起来这个“大妖山魈”穷凶极恶，“恶”是“恶”到了极点，可是脑子似乎不大好使。“大妖山魈”打了这么多的仗，杀了这么多人，他居然能没死，佛祖真是忒慈悲了！阮氏安中尉心中一宽，知道情报总局三部部长黎成龙少将精心策划的“借刀杀人”计划起码成功了80%。他的眼前似乎出现了情报总局专门为自己举行的授奖仪式，情报总局局长武德胜上将亲自把军功章佩戴在自己胸前。

阮氏安中尉平静地说道：“谢谢战分队长！ ‘红箭除恶’计划不用搞得惊天动地的。……”

说到这里，阮氏安中尉示意一下环抱着他的“蛇雕”。“蛇雕”立刻从挎包中拿出一个染满鲜血的“1951年式”7.62mm手枪弹绿色铁皮子弹盒，交给战智湛，说道：“这是在安参谋的提示下，我从牺牲的烈士身上找到的。……安参谋嘱咐我交给你。……”

战智湛边接过绿色铁皮子弹盒，边问道：“安参谋，这是啥家伙？……”

阮氏安中尉狼一样的目光，阴森森的盯着战智湛的脸色，面无表情地说道：“哦……这铁盒子里面装的是咱们国家的专家新研制出来的‘二甲基汞’……”

“‘二甲基汞’？……”战智湛这一下差点惊掉了下巴。他猛然想起了在哈尔滨“特种培训班”受训时，教官在讲到“老毛子”的“克格勃”暗杀所使用的毒药时，曾经讲过“克格勃”暗杀所使用过的“二甲基汞”。可惜的是，只有照片和资料，没有实物。战智湛暗骂道：“他娘的！……明明是‘老毛子’的‘克格勃’暗杀专用的毒药，还‘咱们国家的专家新研制出来的’，把老子当‘傻B’‘忽悠’咋的？……”

教官曾讲过：“‘二甲基汞’的英文名称是‘Dimethyl mecury’，简称‘DMM’，是剧毒物品。‘二甲基汞’也就是‘DMM’这个东西很恐怖，因为‘DMM’在常温常压下是无色的液体，有极强的渗透性。……别说衣物什么的，就连很多试验用手套都能渗透。……更霸道的是，只需要0.1ml的‘DMM’就可以致人于死地，‘DMM’是一种脑神经毒素。……”

教官还讲过：“如果中了‘DMM’这种毒之后，是没有办法解毒的。因为汞离子本身无论与什么元素结合，生成的最终形态是有机还是无机，元素形态链里的汞离子依然会保持它的可沉降性，这个毒是无法解的。……‘DMM’挥发时，有一股淡淡的类似呋喃酮或者甲壬酮的那种水果味道，也就是中华牙膏那种复合果香的味道。但是，你如果十分好奇的想嗅一嗅‘DMM’这鬼玩意儿的味道，你必须首先连续服用一周的重金属排除药物，还得连续打半个月左右的巯基乙醇。嘿嘿……你要是连续几天嗅了累计超过0.1ml，你又什么也不做，就等着抖得和隔壁老王的帕金森一样吧。……我说的这些，都是大难不死的极少数幸存者们留下的珍贵信息。就像芥子的大蒜硫醇味也是饱受痛苦的受害者留下的回忆一样。……所以，同志们一旦遇到‘DMM’，千万倍加小心。‘DMM’的毒性不是闹着玩儿的。……”

当有求知若渴的学员虚心若愚的问起“二甲基汞”的毒理时，教官十分愉快的回答道：“‘DMM’的毒理并不是它本身分子具有猛毒，而是能穿透人体和动物血脑屏障后，进入脂肪含量高的大脑，然后通过生物作用再次还原为金属汞造成的伤害。……同志们都知道，汞离子可以使脑内蛋白和神经递质发生永久性坏死和变性并阻断神经传导，是很稀少的几种直接对中枢神经系统定点攻击的神经毒素之一。……”

又有“拔犟眼子”的学员问道：“如果在试验时出现意外，比如像爆炸、地震、设备故障等，导致‘DMM’溶液接触性、或吸入性中毒，难道就没救了吗？……”

教官挠了挠脑袋，无可奈何的说道：“这个……只能说补救的办法就是将‘DMM’的毒性在发挥到最大之前排除体外，具体的办法就是推荐喝生豆浆，因为生豆浆内的有机物可以减缓汞离子的沉降速度。我要强调一点，这不是解毒只能说是延缓中和而已。这是针对吸入性的‘DMM’中毒，如果是接触性的就需要用大量的碱性溶液冲洗皮肤。与其说冲洗不如说是直接冲，因为如果大量的揉搓反而会加速‘DMM’的渗透。也就是说，针对重金属元素和诸如硅、硒这样的元素一般是没有‘解毒’这一说的，只能说延缓。……”

教官讲过“二甲基汞”之后，战智湛当时是直皱眉头。他心中暗想：“这‘DMM’过于邪恶，这帮‘不是人揍儿’的‘克格勃’比‘DMM’更邪恶！……江湖之上谁人不知，哪个不晓？没有解药的毒药是不能用的。在金庸金大爷的系列武侠小说中，差不多每一部小说都有一个下毒的高手。而这些下毒的高手中，尤以《飞狐外传》中‘毒手药王’无嗔大师的关门弟子程灵素是‘用毒圣手’了。嘿嘿……中了‘DMM’，不知道用嘴吸好不好使。就算好使，也不知道有没有个‘程家妹子’肯舍了自己的性命去为别人吸毒。……”

战智湛当年在哈尔滨读大学时，结义的二哥“铁血刑警”“武二郎”武友义曾送了战智湛一套香港明河出版社出版的《金庸全册》。战智湛如获至宝，熬了一个多月的“灯油”把这套《金庸全册》看完。《飞狐外传》中有这样一段情节，程灵素为了救暗恋的大侠胡斐，不惜舍命用嘴吸出了大侠胡斐所中的“七心海棠”。

“我师父说中了这三种剧毒，无药可治，因为他知道世上没有一个医生，肯不要自己的性命来救活病人。……”这是《飞狐外传》中程灵素弥留之际对尚未苏醒的大侠胡斐说的一段话。战智湛看到这里，不由得哭的“稀里哗啦”的。

程灵素的名字由《灵枢》、《素问》两本医学经典而来。她在金庸金老先生笔下，是真正担得起“冰雪聪明”四个字的人。相比之下，金庸金老先生笔下赵敏之类的聪明女子，只能算得是小聪明。程灵素继承了“毒手药王”的遗作《药王神篇》，成功培育出了至毒“七心海棠”。程灵素机智聪敏，料事如神。她身段瘦小如幼女，面有菜色，只有一双眼睛又大又亮。程灵素培育出了无药可解的万毒之首“七心海棠”，可是她却说：“我师父他老人家谆谆告诫我们，除非万不得已，决计不可轻易伤人。晚辈一生，就从未危害过一条性命。……”

战智湛闻听“二甲基汞”虽惊，但这次却装出了一副十分困惑的样子，边打开铁皮子弹盒，边犹如自言自语般说道：“‘二甲基汞’？……‘乖乖隆嘚咚，猪油炒大葱！’……‘二甲基汞’是啥家伙？……‘二甲基汞’干啥用的？……和‘红箭除恶’计划又有啥关系呀？……”

阮氏安中尉长出了一口气，说道：“‘二甲基汞’接触到皮肤之后就会渗透进皮肤进入人的血液。所以，‘红箭除恶’计划的实施并不复杂，战分队长只需要潜入黎英贤中将的房间，趁着黎英贤中将不在，把‘二甲基汞’洒到黎英贤中将的衣服或床上就行了。……”

战智湛这才端详了一番眼前的这位“安世元安参谋”的长相，只见他猪腰子脸上长着一副绿豆眼睛，还是蒜头鼻子蛤蟆嘴，尖嘴儿猴腮的别提多“磕碜”了。

“这么容易？……”战智湛摇了摇头，皱着眉头似乎在说：“这也忒不过瘾了！……”

阮氏安中尉会错了意，他看了战智湛一眼，说道：“战分队长，姜站长曾经说过，你是一个光明磊落的人。就像……就像金庸《飞狐外传》中的大侠胡斐。但是，使用‘二甲基汞’除掉越酋黎英贤中将实在是不得已而为之，并非是卑鄙无耻的行为。而且，这是代价最低的维护国家利益的行动。希望你能……”

“安参谋，你也喜欢金庸金大爷的武侠系列小说？……”战智湛这次没有作假，他仿佛他乡遇故知，真的是喜出望外。他哪里知道，在越南，金庸金老先生的武侠小说是被翻译得最多的外文作品。金庸所有的书都有越南文译本，而且是畅销书。据说七十年代（上个世纪）初，南越伪政权的国会议员们吵架，一个骂对方“是搞阴谋诡计的左冷禅”，对方就回骂说：“你才是虚伪阴狠的岳不群”。虽然这个故事的真实性无法证实，但是不可否认的是“金庸热”早已超出了华人世界的范围。

“是很喜欢！……战分队长也喜欢金庸武侠系列小说吗？……”阮氏安中尉开始只是想提一下金庸老先生的武侠系列小说，增进“大妖山魈”对自己的亲近感。没想到，歪打正着，这个杀人不眨眼、穷凶极恶的“大妖山魈”居然是个“金庸迷”，而且称金庸为“金大爷”。

“嗯呐！……嗯呐！……安参谋喜欢金庸金大爷的哪部小说？……喜欢哪个人物？……”战智湛满怀期望，忙不迭的问道。

“哦……我喜欢金庸所著《飞狐外传》中的程灵素。……程灵素自然不及《射雕英雄传》中的女主角黄蓉俏丽，不过是一个‘面黄肌瘦’的小丫头。可是程灵素处处以德化怨，有着菩萨一般的善良心肠。她宽恕作恶的师兄师姐，救治作乱的小铁，替弱者王铁匠出气，援手替姬晓峰疗伤。……她身为号称‘毒手药王’‘无嗔大师’的关门弟子，有着天底下最厉害的下毒解毒功夫，却从来没乱下一次药，生前也不曾杀死一个人。程灵素直至生命将休，才出手布局，假手于一段蜡烛，在她死后替师父清理了门户。金庸对程灵素的描写，使得热血仗义的胡斐、飞扬洒脱的袁紫衣、顶天立地的苗人凤都相形失色。……”

“鵟鹰”和“蛇雕”耳闻越南“猴子”的枪声越来越近，战智湛这个死“骆驼”却没心没肺、旁若无人的和“安世元安参谋”聊起了金庸金大侠的武侠小说。二人对视了一眼，本想阻拦二人，可是碍于人家“安世元安参谋”为了救自己身负重伤，又牺牲了三位战友，这话都到了嘴边上，却怎么也说不出来。二人在那里搓手着急，却毫无办法。

战智湛十分赞同的连连点头，说道：“嗯……从程灵素这一份磊落宽容的气度，在俺看来，是大侠胡斐所不及的。如果说苗人凤是个光明磊落的汉子，那么，从替苗人凤治眼睛这样事情上，俺觉得只有程灵素的磊落才可与之匹敌，就像俗语中的‘英雄识英雄’一样，她问也不问就相信他会信任自己，问也不问就知道他忍受得住‘七心海棠’叶带来的剧痛。整件事情当中，大侠胡斐反而成了一个第三者。安参谋，你说大侠胡斐为啥不喜欢程灵素？……”

阮氏安中尉为了增强“大妖山魈”对他的信任，只得耐着性子说道：“程灵素第一缺乏美貌，第二太过聪明，连犯两条一般男性择偶的天条，没有好结果那是肯定的了。……”

听到这里，战智湛不由得痴了，他仿佛看到月黑风高，孤灯如豆，大侠胡斐对剑自酌，窗外月华如水，寒意稍浓，不知从何处，飘来《飞狐外传》中王铁匠唱过的小调：“小妹子对情郎，恩情深；你莫负了妹子，一段情；你见了她面时，要待她好；你不见她面时，天天要十七八遍挂在心！……”

这歌声声音喑哑，如泣如诉。人间自是有情痴，此恨不关风与月。战智湛似乎看到大侠胡斐握刀的手许久未动，映射出五彩光环的锋刃上，不知何时，留下两滴四散的水珠。战智湛抬头遥看漆黑的天际，灿若流星的一双大眼睛，分明是程灵素在望着大侠胡斐黯然不语。渐渐的，程灵素似被这人间月色所感，眼中升腾起蒙蒙的雾气，长长的睫毛慢慢合上，而两行清泪潸然而下。唉，南国有佳人，容华若桃李。朝游江北岸，夕宿潇湘沚。

“草庐闺中称药王，洞庭湖畔遇情郎。玉凤双飞托春梦，芳华散尽化海棠。……”战智湛失魂落魄的吟到这里，猛然醒悟，“眼目前儿”的这个什么“安世元安参谋”是敌非友，越南“猴子”的增援部队已经从四面八方围了过来，再不走就要被包围了。他心中暗骂道：“‘乖乖隆嘚咚，猪油炒大葱！’……老子还没闻‘二甲基汞’呢，咋就中毒了？……”

恰在这时，负责警械的“苍鹰”打扫了一下战场，急匆匆的跑了回来。对战智湛说道：“分队长，越南‘猴子’围上来了，离这里不足三百米了！……我收集了一下越南‘猴子’的武器弹药。有四支‘AK74’，满装‘AK74’弹匣十五个，手雷九枚，‘67式’手榴弹十一颗，‘托卡列夫’7.62mm手枪弹一百多发。弟兄们的弹药都消耗的差不多了，分分？……”

“蛇雕”也说道：“我和‘鵟鹰’也收集了烈士的两支‘79式微冲’和五个弹匣。……”

“鵟鹰”说道：“我说‘骆驼’，依我看咱们还是赶紧向越南‘猴子’的‘涂台机场’方向运动吧！……冲出了越南‘猴子’的包围圈，咱们再瓜分这些武器弹药也不迟！另外……咱们是不是先得把安参谋找个地方隐蔽起来？……”

“俺同意‘鵟鹰’的意见！……”战智湛和 “蛇雕”对视了一眼，点了点头说道。接着，他又将手中的“1951年式”7.62mm手枪弹绿色铁皮子弹盒的盖子盖上，举起子弹盒对阮氏安中尉说道：“安参谋你放心，只要俺们有一个人活着，保证完成任务！……另外，你……”

“我的安全请战分队长放心！……”阮氏安中尉打断了战智湛的话，说到这里，指了一下他的左前方十余米处树丛中，一个直径大约两米，深一米五杂草丛生的坑说道：“请同志们把我抬到那个坑中，给我留两颗手榴弹，再盖上一些树枝什么的就可以了。……另外，我建议同志们在向‘涂台机场’运动时先向西，突出敌人的包围后，再折向‘涂台机场’方向。我观察了一下，这个方向山险林密，枪声稀疏，是出乎敌人意料之外的方向。……”

“瞅这架势，这个啥‘安世元安参谋’是想借刀杀人呀！嘿嘿……在借老子的手把‘二甲基汞’洒到黎英贤中将这个老‘猴子’的衣服上之前，这个‘瘪犊子’指定得保证老子的安全。……”战智湛脑子中快速地盘算了一下之后，和“鵟鹰”、“蛇雕”对视了一眼，见二位战友对他点了点头，笑眯眯的对阮氏安中尉说道：“中！中！中！……俺们就按安参谋说的路线向越南‘猴子’的‘涂台机场’迂回运动！……”

“苍鹰”拿出两枚“67式”手榴弹，插到阮氏安中尉的皮带上，和战智湛、“鵟鹰”、“蛇雕”一起七手八脚的把阮氏安中尉抬到了那个坑中，又用树枝把他隐藏好。

隐藏好了阮氏安中尉，战智湛背着“雕鸮”烈士的遗体，“鵟鹰”背着“白尾鹞”烈士的遗体，“蛇雕”背着“斑尾鹰”烈士的遗体开始向西突围。一路上，果然像阮氏安中尉说的那样山险林密。虽然也遇到了几伙搜索的越南“猴子”，但侦察兵们都有惊无险的避开了。

在一处山崖下，侦察兵们把“雕鸮”杨巴鲁和“白尾鹞”汤正清、“斑尾鹰”万志新烈士的遗体安葬在距地面十余米高的一个悬空山洞中。战智湛想了想，从背包中拿出阮氏安中尉郑重的交给他的那个“1951年式”7.62mm手枪弹绿色铁皮子弹盒，也放到了山洞中，然后用石头严严实实的封住了洞口。

在山崖下的“鵟鹰”和“蛇雕”看了十分不解，待战智湛沿着绳索下到地面上，“鵟鹰”实在憋不住了，问道：“我说‘骆驼’，你不是答应了安参谋去替他完成‘红箭除恶’计划的嘛？咱们可不能只为了自己打小算盘，做对不起安参谋的事，食言而肥呀。……另外，你不是也想杀黎英贤中将这个越南老‘猴子’吗？……”

战智湛掸了掸身上的土，把“78式”背囊背到背上，瞪着小眼睛，就像看外星人一样上下打量了一番“鵟鹰”，说道：“‘鵟鹰’，你是真没看出来，还是和俺俩‘装犊子’呀？……”

“蛇雕”没敢插话，可“鵟鹰”有点不高兴了，对战智湛说道：“我说‘骆驼’，咱们商量事儿能不能好好商量？……你张口就骂我是几个意思呀？……”

战智湛不由得哑然失笑。可是“鵟鹰”和“蛇雕”、“苍鹰”尽管是他生死与共的战友，是一起从死人堆里爬出来的比亲兄弟还亲的弟兄，战智湛还是不能把他主动用暗语和那个什么“安世元安参谋”确认身份，那个什么“安世元安参谋”却如同鸭子听雷一般无动于衷的事儿告诉几个战友。这是“隐蔽战线”铁的纪律。

战智湛严肃的对几个战友说道：“‘鵟鹰’，俺对才刚和你俩顺嘴‘胡咧咧’向你道歉！……但是请弟兄们相信俺，那个啥‘安世元安参谋’指定不是总部南宁工作站的人。嘿嘿……非友即敌！那个啥‘安世元安参谋’是个越南‘猴子’的狗特务是板上钉钉的事儿了！……”

“鵟鹰”和“蛇雕”、“苍鹰”闻言，不由得面面相觑。三个侦察兵虽然不是“隐蔽战线”的战士，但是“纪律”还是懂的。“鵟鹰”说道：“我说‘骆驼’，我们几个都100%的相信你！……照你说的，咱们就不去越南‘猴子’的‘涂台机场’，去杀黎英贤中将那个越南老‘猴子’了？……你不是也要杀他吗？越南‘猴子’为啥也要杀他呀？……”

战智湛的脑袋摇得就像一个“拨浪鼓”似的，说道：“俺想了一道儿了，也没想明白！‘乖乖隆嘚咚，猪油炒大葱！’……越南‘猴子’‘狗咬狗，一嘴毛’的事儿咱们就是想破脑瓜子也想不明白，不去浪费那个脑细胞也罢！……”

见三个战友还没明白，战智湛猛然想起了伟大领袖毛主席在一九三九年九月十六日《和中央社、扫荡报、新民报三记者的谈话》中的一段话，说道：“毛主席他老人家教导咱们说‘凡是敌人反对的，咱们就要拥护；凡是敌人拥护的，咱们就要反对。’……” 

1。非无菌状态的药品是不适合添加到细胞培养基中的。你最好的解决办法是购买一瓶细胞培养适用，经过厂商无菌处理的2-巯基乙醇，在保持无菌条件下分装和使用。

2。自行过滤来除菌的办法适用于很多水溶液，但是2-巯基乙醇有可能与你的滤膜存在兼容性的问题，必须仔细查看清楚相关资料。我的真实经历是使用PES(聚醚砜，一种常见的滤膜）过滤冻存细胞要用的DMSO二甲亚砜，结果二甲亚砜把滤膜都溶掉了。最后我不得不买了细胞专用的无菌二甲亚砜。

PCR基本原理示意图（如右图）：

在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2 和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA试剂盒提供的典型反应条件供参考。 用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2 优于Mn2 ，而Ca2 无任何作用。

1．Mg2 浓度Mg2 的最佳浓度为1.5mmol/L（当各种dNTP浓度为200mmol/L时），但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2 浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。Mg2 过量易生成非特异性扩增产物，Mg2 不足易使产量降低。

样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与Mg2 结合而降低Mg2 有效浓度。因此，用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

dNTP含有磷酸根，其浓度变化将影响Mg2 的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2 浓度。因此，在高浓度DNA及dNTP条件时，必须相应调整Mg2 的浓度。

2．Tris -HCl缓冲液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，pKa为8.3(20℃),△pKa为0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时，在典型的热循环条件下，真正的pH值在7.8～6.8之间。

3．KCl浓度K 浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但研究表明，NaCl浓度在50mmol/L时，KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。

4．明胶明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR结果，影响不大。

5．二甲基亚砜（DMSO）在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于减少DNA的二级结构，使（G C）%含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多数并不使用DMSO。 在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。

决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成，例如，在100μl反应体系中，4×dNTPs浓度若用20μmol/L，基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μgDNA，而200μmol/L足以合成25μg/DNA。

购自厂商的dNTP溶液一般均未调pH，应用1mol/l NaOH将dNTP贮存液pH调至7.0，以保证反应的pH值不低于7.1。市购的游离核苷酸冻干粉，溶解后要用NaOH中和，再用紫外分光光度计定量。 典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为2.5U/μl，常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。

由于生产厂家所用兵配方、制造条件以及活性定义不同，不同厂商供应的TaqDNA聚合酶性能也有所不同。

Cetus公司酶定义是：1个酶单位是指在以下分析条件下，于74℃，30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分所需的酶。测定时间为10min，折算成30min掺入量。

分析条件为25nmol/L TAPS（三羟基-甲基-氨基丙烷磺酸钠pH9.3.25℃），50mmol/l KCl，2mmol/L MgCl2.1mmol/L β-ME（巯基乙醇），dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP为100mmol/L(由不标记及α-32P标记混合)，12.μg变性鲱鱼精子DNA，最终体积50μl。 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆DNA，μg水平的单拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。

DNA的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的DNA（如基因组的DNA时），如用超声处理或用切点罕见的限制酶（如Sal1和Not1）先行消化，则扩增效果更好。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此，用质粒作反应模板时最好先将其线状化。

模板靶序列的浓度因情况而异，往往非实验人员所控制，实验可按已知靶序列量逆减的方式（1ng，0.1ng，0.001ng等），设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。 在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情况下先在电泳缓冲液或凝胶中加1%溴化乙锭（EB）（每100ml加100μl），然后将已经制备好的1%～2%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电泳槽内，加入待测样品10μl，同时用分子量标准品作标记。琼脂糖浓度应按分离DNA片段的大小进行选择，一般用1.5%～2%，电泳电压75V，待样品进行凝胶内距胶末端1cm时，切断电源，取出凝胶在紫外灯下直接观察结果。

由于溴化乙锭可与双链DNA形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使EB的荧光强度增强80～100倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。一般肉眼观察DNA量可达10ng，其荧光强度与DNA含量成正比。

DNA分子在凝胶中泳动速度决定于电荷效应及分子效应。前者由所带净电荷量决定，而后者与分子大小及构型有关。按照DNA分子大小，其凝胶浓度可做不同的调整。有条件的实验室也可用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析扩增的DNA片段。 PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。

一、温度循环参数

在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。

关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。

1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。

2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（G C）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度比扩增引物的融解温度TTm低5℃，可按公式进行计算：

Ta = Tm -5℃= 4(G C) 2(A T)-5℃

其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（G C）%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。

3．引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min，与此同时，在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。

4．循环次数常规PCR一般为25～40个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。

扩增结束后，样品冷却并置4℃保存。

二、引物引物设计

要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。

引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为15～20个碱基，可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此之外，引物设计一般遵循的原则包括：

1．引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72℃）下不会形成稳定的杂合体。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。

2．（G C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G C）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（G C）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳。

3．引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。例如：

4．引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。

另外，两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。

5．引物3’端配对DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以，引物3’端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。

引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行计算机检索来核定。

人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱（层析）纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的引物应保存在-20℃冰箱中，在液体中引物能保存6个月，冻干后可保存1～2年。

三、DNA聚合酶

在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶Ⅰ纯品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量为109000的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一个片段分子量为34000，具有5’→’3’外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有几种功能：一是聚合作用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端。二是有’3’→5’外切酶活力，能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。三是5’→3’外切酶活力，它能从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。1985年Mullis 等发明了PCR方法，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR后，世界上许多实验室就考虑用耐热DNA聚合酶代替Klenow片段进行PCR，使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生活于60℃（B.Stearothermophilus）到87℃（S.Solfatavicus）的许多菌中分离纯化出耐热DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA变性所需温度，所以无法应用于PCR。

1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及应用的关键。Klenow片段不能耐受95℃的双链DNA变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR的干扰，增进了PCR特异性、产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：①Klenow酶的最适温度为37℃，扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为74～75℃。因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。②循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow酶为20个（均用1μg基因组DNA开始）而Taq酶为30个。③延伸片段长度Taq酶为10kb以内，而Klenow酶为400bp以内。

Taq酶由水栖高温菌（Thermusaquatics）YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为70～75℃。最初从中分离到分子量60～68KDa，比活性为2000～8000U/mg的DNA聚合酶。后来Cetus公司的Kary Mullis等又分离到比活为20万U/mg的纯酶，分子量为93910。此种9.4KDa酶的最适温度为75～80℃，与单纯核苷酸的结合率（Kcat）可达150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G C的30bp引物延伸，70℃时Kact>60nt/s；55℃可达24nt/s；37℃时为1.5nt/s，而22℃时低至0.25nt/s。高于90℃时DNA合成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。

在PCR反应混合液中，Taq酶于92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的时间分别为130、40及5～6min，在50次循环的PCR中当管内最高温度为95℃。每循环为20s时尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半寿期为40min，故在PCR循环中选用的变性温度，不宜高于95℃。

Taq酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为Ampli Taq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因长2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括对dNTP结合，引物与模板作用区均存在于Taq酶中。

Taq酶具有依赖DNA合成的5’→’3’外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3’-磷酸化的“阻断物”，会被逐个切除而不会阻止来自上游引物链的延伸，而对于5’-32P标记的合成寡核苷酸引物，则无论是单链或是与模板复性，都未发现降解，所以该种活性不会影响PCR结果。Taq酶没有3’→’5’外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产物中点突变较多，对克隆等不太有利。一般错掺率为1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs浓度分别为200μmol/L，Mg2 为1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3’→5’外切酶活性对测序有利。

2．影响酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2 离子的影响。用鲱精DNA为模板，总dNTP浓度0.7～0.8mmol/L,Mg2 为2.0mmol/L时激活能力最高。浓度超过此值产生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力达40%～50%。dNTP能与Mg2 结合，故游离Mg2 只是结合后剩余的量。若总dNTP浓度高至4～6mmol/L时，Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl　PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）。

用鲱精DNA，70℃，10min内dNTP的掺入量计算，标准条件为100%。

纯9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸外切酶活力。误掺入率取决于dNTP浓度。但Taq酶具有DNA依赖的链移位5’→3’核酸外切酶活力。对5’→3’32P标记寡核苷酸单链，或与MB模板杂交时均只有极少的降解力。

中等浓度KCl能刺激Taq酶合成活力达50%～60%，最佳KCl浓度为50mmol/L，浓度更高有抑制作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。

加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可产生中度抑制或无作用。

低浓度尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影响不大，吐温20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%）的抑制作用。

3．第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel将TaqDNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289个氨基酸）去除，称为stoffel片段。其97.5℃的半衰期从Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合PCR（Multiplex PCR）更为有利。

VentTMDNA多聚酶：是美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌-能生长于98℃中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。它的一些酶学性质较Taq DNA聚合酶更为优越，它能耐100℃高温且2h以上仍有活力，并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比Taq酶降低一倍。后来该公司又从深水潜艇（2010m）排气孔分离的能在104℃生长的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表达的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半寿期达23h（Vent酶为6.7h,Taq酶为1h）。

4．RTth逆转录酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆转录-PCR（RT-PCR）的发展很快，所以对耐热的依赖于RNA的DNA多聚酶的研究也有进展。有实验表明Taq DNA多聚酶有依赖于RNA的DNA聚合酶活性，但活性较弱。Cetus公司于1991年推出一种rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，二种活性分别依赖于Mn2 Mg2 ，这样就可分别控制酶活性。利用该酶只需250ng的总RNA即可有效地进行RT-PCR，得到特异的DNA片段，从而非常有利于逆转录PCR的发展。

耐热DNA聚合酶的研究得到长足的发展，这在PCR发展中起到了重要的作用。相信随着进一步的研究，将使人们对耐热DNA聚合酶的认识和应用更进一步地发展。

我国的PCR研究发展很快，其关键试剂-耐热DNA聚合酶-也已有几个实验室能够分离纯化，如复旦大学遗传学研究所、华美公司、中国医学科学院基础医学研究所。后二者的菌株为Thermus aquaticus YT-1。前者则是从自己筛选的嗜热菌中分离纯化，复旦大学遗传所亦已成功地克隆了该聚合酶的基因并获得了耐热F4DNA聚合酶，其酶学性质非常接近于Taq DNA聚合酶，为中国PCR的开展提供了保证。

四、影响PCR特异性的因素

通过上述内容。可以看出有许多因素可以影响PCR的特异性，在此我们作一归纳，供大家参考：①退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。②减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。③引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。④改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。

五、扩增平坡

扩增反应并不是可以无穷地进行下去的，经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进入平坡；进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.3～1pmol时，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。造成PCR进入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完毕、Taq酶失活，这几中因素在标准反应中均不会出现。此外，还有几种可能：

1．底物过剩因DNA合成量多于反应液中存在的Taq酶，在100μl反应液中含2.5Utaq酶而DNA合成量达1μg（3nmol脱氧核苷酸）时，开始变为底物过剩。延长延伸时间或添加Taq酶，可以克服之。但不实用，因每进行下一循环就要延长延伸时间一倍及多加一倍Taq酶，才能继续保持指数增长。

2．非特异性扩增产物的竞争与上述情况密切相关，此时不需要的DNA片段与需要的片段同时竞争聚合酶，要克服这一情况是要提高反应特异性，使不需要片段不能大量积聚。

3．退火时产物的单链自己缔合两条单链的DNA片段在退火时除了与引物缔合外，也可以自行缔合，这也会阻止产品增多。当产物浓度到达10pmol/100μl时即可发生此现象，除稀释外无法克服。

4．变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链DNA）。

总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。