盐酸胍 的具体用途

避光低温保存。6mol/l盐酸胍溶液是常用的蛋白质变性剂需避光低温保存。盐酸胍用作医药、农药、染料及其它有机合成物的中间体，是制造磺胺类药物及叶酸的重要原料，还可用作合成纤维的防静电剂。

 由于外界因素作用，使天然蛋白质分子的构象发生异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化，这种现象称为蛋白质的变性。变性可以涉及次级键、二硫键的断裂，但不涉及一级结构上肽键的断裂。

 盐酸胍和尿素变性蛋白质包括两种机制：第一种机制是变性蛋白质与盐酸胍和尿素优先结合，形成复合物，当复合物被除去，反应平衡移动，随着变性剂浓度的增加，天然状态的蛋白质不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；第二种机制是盐酸胍和尿素对疏水氨基酸残基的增溶作用，因为盐酸胍和尿素具有形成氢键的能力，盐酸胍和尿素在高浓度(4～8mol/L)水溶液时能断裂氢键，结果盐酸胍和尿素就成为非极性残基的较好溶剂，使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加，从而使蛋白质发生不同程度的变性。

 二者在蛋白质变性中的差别：

 浓度 ：在室温下，3～4mol/L盐酸胍可使球状蛋白质从天然状态转变至变性状态的中点，通常增加变性剂浓度可提高变性程度，约6mol/L盐酸胍可以使蛋白质完全转变为变性状态。盐酸胍由于具有离子特性，因而比尿素的变性能力强。一些球状蛋白质，甚至在8mol/L尿素溶液中也不能完全变性，然而在8mol/L盐酸胍溶液中，它们一般以无规卷曲(完全变性)构象状态存在。

 溶解度 ：尿素溶解能力较盐酸胍慢而弱，溶解度为70%~90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但其具有不电离，中性，成本低等优点；盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰，但成本较尿素高、在酸性条件下易产生沉淀、可能对后续实验有干扰等缺点。

 总体而言，作为蛋白质变性过程中常用的试剂，盐酸胍和尿素的优缺点分别为：盐酸胍溶解能力和变性能力相对较强，不会造成重组蛋白质的共价修饰，但有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点；尿素溶解能力相对较弱，但具有不电离、呈中性、成本低、蛋白质复性后不会造成大量蛋白质沉淀等优点。在实际实验中，研究人员需要根据条件及目的进行选择，以获得最优的实验结果。

产品简介

DEAE Sephadex A-25是以交联葡聚糖为基质的弱阴离子交换剂，适合批量进行分离层析，具有很好的结合能力。葡聚糖离子交换剂是将功能基团通过醚键偶联到交联葡聚糖上。根据配基基团不同分为：DEAE、QAE和CM 3种，分别包括两种不同的孔径：A-25/C-25和A-50/C-50。

产品参数

产品名称： DEAESephadex A-25

货号： 17-0170-02

基质： 交联葡聚糖

颗粒大小： 40-120μm

配基： 二乙胺乙基

离子容量： 3-4mmol/g

每毫升蛋白载量： HSA-30mg；α-乳白蛋白-140mg

最大流速： 45cm/h

工作pH： 2-9；2-13（在位清洗）

化学稳定性： 在水溶液中稳定例如：8M 尿素和6M盐酸胍溶液

操作温度：室温

保存条件：4-30°C(干粉)；4-8°C（用过的柱子，保存在20%乙醇或者0.01M NaOH）

实验步骤

1.预处理

称取所需质量的DEAE Sephadex A-25干粉，溶于缓冲溶液中；不同缓冲溶液凝胶的膨胀系数不一样。一般1g DEAESephadex A-25溶于25mL的盐溶液中。选择后续实验相同的pH的缓冲液进行溶胀。室温溶胀一般需要2天，沸水浴溶胀一般需要2小时，同时还能够排除溶胶中的气泡。磁力搅拌时应注意不要破环凝胶颗粒。用布氏漏斗进行冲洗，使其保存在初始的缓冲液中。按凝胶：缓冲液=3:1比例配成匀浆。

2.装柱

（1）平衡所有试剂和填料平衡至室温。

（2）将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

（3）将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液体（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。

（4）用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意不要使用气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

（5）打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用2-3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。

3.平衡

让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。

4.上样

（1）样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心、过滤后上柱；

（2）一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡洗液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。

5.洗脱

对于DEAE Sephadex A-25一般使用增大盐离子浓度或者降低pH的连续或者梯度洗脱。

6.再生

一般用高盐浓度的缓冲液（1-2M NaCl）冲洗，洗10倍以上柱体积，接着用结合蛋白的平衡液洗到平衡，可再次使用。若有失活的蛋白或者脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗（CIP）除去。

7.在位清洗

（1）对于以离子键结合上去的蛋白，可以用0.5-1柱床体积的2M NaCl去除。

（2）对沉淀蛋白、以疏水作用结合的蛋白或者脂类物质，可用1柱床体积的0.1M NaOH去除。

（3）对强疏水性结合的蛋白、脂类等，可用4-10倍柱体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗，但要注意有机溶剂的浓度以梯度的方式逐渐增加，否则容易产生气泡。清洗完毕后，用至少3倍柱体积缓冲液平衡柱子。

注意事项

（1）用过的柱子密封贮存于4°C（保存溶液为20%乙醇或者0.01 M NaOH），通风、干燥的地方，不能冷冻。

（2）在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。

有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和dna脱离,dna进入水相.但是在rna的提取过程就要避免蛋白和dna脱离,否则dna会释放到水相.不管有酚也好,没有酚也好,氯仿本身也对蛋白有变性作用,剧烈的震荡,很容易使得dna的亲水基团,与水相接触.所以不要剧烈震荡.

异丙醇的作用是通过-oh的疏水作用使得rna

或者dna链中的亲水基团受到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾.

氯仿的作用有多个方面,一是作为有机溶剂变性蛋白,使其沉淀并通过离心除去,同时也通过变性作用抑制rnase活性；二是rna提取试剂中通常含有苯酚（trizol主要成分就是苯酚,很多自己配试剂提的方法也用苯酚,抽提蛋白时也会用到苯酚）,苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去会损伤核酸,需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等）,起到一定除杂作用

通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25）,减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫,影响后续操作,不过个人经验感觉加不加没什么太大区别,也许是我的样品里蛋白不多吧

异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样.只不过用量少一点,0.6v~1v就够了,不像乙醇沉淀需要至少2v,一般需要2.5倍体积.在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀.不过感觉效果不如乙醇,偶尔会有沉淀不出来东西的时候

为了进一步了解肌红蛋白Mb表面44位天冬氨酸对肌红蛋白结构和功能的影响，本论文以野生肌红蛋白表达质粒pGYM为模板，设计特异突变引物，通过PCR定点突变的方法将肌红蛋白(Mb)基因上的第44位酸性氨基酸天冬氨酸(D)的密码子GAT变成碱性氨基酸赖氨酸(K)的密码子AAA，获得肌红蛋白突变体D44K的基因。将带有突变体的目的基因克隆在肌红蛋白表达质粒pGYM上，经热激转化大肠杆菌BL21，大肠杆菌发酵使突变蛋白D44K大量表达、收集菌体。酶法裂解细菌，依次用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化突变蛋白，其纯度可达96﹪。用圆二色谱和紫外可见光谱分别研究野生型肌红蛋白及突变体(D44K)的耐热、耐酸及盐酸胍诱导的变性过程，实验结果表明：用碱性氨基酸Lys取代酸性氨基酸Asp44残基，增强了肌红蛋白耐热、耐酸变性能力，导致蛋白质的热变性中点温度Tm由71.9℃提高到75.1℃、酸变性中点(pH)1/2从3.95降到3.88，但在盐酸胍溶液中，突变体易变性，其变性中点浓度Cm从1.88mM降为1.75mM。以愈创木酚为底物分别测定了不同条件下Mb(WT)和Mb(D44K)的过氧化物酶活性，实验结果表明：以愈创木酚为底物时，Mb(D44K)的Km为1.9mM而Mb(WT)的Km为3.3mM。Mb(WT)和Mb(D44K)过氧化物酶的最适温度均为50℃，在相同温度下，Mb(D44K)的过氧化物酶活性高于Mb(WT)，且其过氧化物酶的热稳定性高于Mb(WT)。同时实验结果表明：Mb(D44K)过氧化物酶的最适pH为5.0，且在宽的pH范围内仍保持高过氧化物酶活性，而Mb(WT)过氧化物酶的最适pH5.5，在相同pH下，Mb(D44K)过氧化物酶对酸碱的稳定性高于Mb(WT)，且两者在碱性溶液中其酶活性受到抑制。

第一节 细胞DNA、RNA的分离鉴定技术

一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定

人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA，可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的DNA还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。

(一)DNA提取方法：

(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。

(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。

(3)50℃水浴2小时，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3分钟。

12000r/min离心15分钟（室温）

(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质

12000 r/min离心15分钟（室温）

(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次

(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀

12000 r/min离心15分钟（室温）

(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时

12000 r/min离心15分钟（室温）

(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。

(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。

(10)加入蛋白酶K至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入Nace至终浓度10mmol/L。

(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。

(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。

(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1小时。

(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。

(二)DNA纯度检测及含量计算

DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.75.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。

取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8

OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。

DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)

DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。

二、培养细胞总RNA的提取及鉴定

细胞中含有三类RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的mRNA的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的mRNA的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。

提取细胞总RNA的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总RNA，也可从总RNA中提取mRNA，从而分析mRNA表达量，建立cDNA文库，以及对mRNA的调控和进行反义RNA研究。

变性液：7mol/L盐酸胍，25m mol/L棕檬酸钠pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巯基乙醇。

水平衡酚：在饱和酚中加入等体积DEPC处理的三蒸水(或新鲜无菌的三蒸水)混匀后去除水相，再重复处理二次即可。

所用玻璃、塑料制品、金属器材可用0.1% DEPC水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用180℃干烤6小时，以去除被污染的RNA酶。

(一)总RNA的提取方法：

1、消化收集细胞方法同前。

2、向离心管中的细胞沉淀物中加1.5mL变性液，立即充分混匀。

3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸钠PH4.0、以及0.05mL氯仿，剧烈振荡混匀30秒后，立即置冰上放置15分钟，4℃ 12000r/min离心15分钟。

4、取水相，加入等体积酚/氯仿(1:1)混匀，剧烈振荡10分钟，4℃12000rpm离心15分钟。

5、取水相，加入等体积氯仿，剧烈振荡10分钟，再同上离心，再如此反复抽提一次后取水相，加入等体积的预冷的异丙醇(或异戊醇)混匀，低温放置20分钟，再同上离心。

6、取沉淀用70%预冷乙醇洗两次，干燥10分钟，溶于DEPC处理的三蒸水中以溶解RNA，分装,-20℃冻存。

(二)总RNA的鉴定及含量计算

1、RNA纯度及含量测定

取少量提取的RNA，经紫外线扫描，吸收峰位于波长260nm处，RNA纯度为OD260/OD280=1.8～2。

OD260值为1的RNA溶液约含有40μg/mL，故RNA浓度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀释倍数。

2、RNA分子量大小鉴定

2.1 配液：

(1)10×MOPS电泳缓冲液配制

将41.2g[2-(N-玛琳代)丙磺碱，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶于800mL经DEPC处理的50mmol/L乙酸钠液中，用2mol/L NaoH调整pH至7.0，加入20mL经DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加经DEPC处理的水至总体积为1000mL过滤除菌，避光室温保存。

(2)甲醛加样缓冲液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青FF、

50%甘油

2.2 操作步骤：

(1)制平板胶：1.2%琼脂糖煮沸，冷却至60℃，加入10×MOPS缓冲液及甲醛溶液，使三者的比例为3.5:1.1:1，或三者的终浓度分别为1.2%、1及10%，于室温放置30分钟或更长时间，使胶凝固。

(2)在无菌离心管中混合下列液体。

RNA(最多30μg) 4.5uL

10×MOPS电泳缓冲液 1.0uL

甲醛 3.5uL

65℃温育15分钟，水浴冷却、离心

(3)加入2ul DEPC处理的加样缓冲液上样，进行电泳，5V/cm电压，3小时直到溴酚兰至胶的中部，可用已知RNA标本作分子量标准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。

(4)电泳完毕，取出凝胶，浸泡在溴化乙锭溶液中(终浓度0.5g/L)染色30～45分钟，紫外透射仪观察分子量大小。

第二节 核酸蛋白转移电泳及杂交

一、DNA Southern Blot及杂交

本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。

(一)样品DNA内切酶水解

限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37℃ 1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。

1、配液：10×限制性酶消化缓冲液

10×buffer O—无盐：100mmol/L Tris HCL pH7.4

1mg/mL BSA

100mmoL/L MgCL2

10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)

10×bnffer L—低盐：缓冲液O

0.5mol/L Nacl

10×bnffer H—高盐：缓冲液O

1.0mol/L Nacl

2、操作步骤：

(1)将DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入适量H2O总体积为18μL，混匀。

(2)加入2mL 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。

(3)加1～2U限制性内切酶充分混合。

(4)37℃温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。

(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使达到终浓度为10mmol/L终止反应。

(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。

(二)Southern Blot及杂交。

将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。

1、配液：

(1)变性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH

(2)中和溶液：200mL 20×SSC

100mL 1mol/L HCL

100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。

(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaoH调pH至7.0加水至1000ml，高压消毒灭菌。

(4)预杂交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4

125mL 20×SSC

25mL100×Denhardt'S溶液

5mL 5mg/mL鱼精DNA

250mL 100%去离子甲酰胺

82.5mL H2O(总体积为500mL)

(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)

10g聚乙烯吡咯烷硐

10g牛血清白蛋白(组分V)

加H2O至500ml

2、操作步骤(如图20-1)：

图20-1 Southern Blot装置图

(1)内切酶消化的DNA，总体积为50uL，加入10uL加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。

(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。

(3)将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动：

500mL 0.2mol/L HCL 10分钟，水洗若干次

500mL变性液中浸泡15分钟×2

500mL中和溶液浸泡30分钟。

(4)剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶3mm。

(5)剪3～5层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长30～40cm，在一盘中加入数百毫升20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。

(6)逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移24～36小时

(7)取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入2×SSC中5分钟，用滤纸吸干,80℃烘烤2小时。

(8)将该转移膜放在塑料袋中，加入6～10mL预杂交液，排出气泡，封口，42℃ 3小时或过夜。

(9)将标记的DNA探针煮沸5分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为5×105 CPM/ML。

(10)倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42℃ 6h或过夜。

(11)取出转移膜，按以下条件洗膜

1×SSC，0.1%SDS室温2×15分钟

0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分钟，气中干燥。

(12)将杂交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自显影2～7天，-70℃。

(13)X片显影、定影，然后读片

结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。

二、RNA Northern Blot及杂交

此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行DNA-RNA杂交，此法是研究RNA(特别是mRNA)的主要方法之一，可测量RNA的含量和大小。

1、配液：Northern 预杂交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4

125mL 20×SSC

25mL100×Danhardt's液

5mL 5mg/mL 鱼精DNA

250mL 100%去离子甲酰胺

加H2O 至500mL-20℃贮存

Northern 杂交液：500mL预杂交液加入标记探针及10%磷酸葡聚糖。

2、操作步骤：

(1)RNA变性电泳方法同前

(2)待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于500mL 10×SSC中浸泡45分钟，轻轻摇动。

(3)测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为①横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至20×SSC溶液；②胶；③硝酸纤维素滤膜；④亲和层吸纸；⑤吸水纸；⑥重物、转移4～6小时。

(4)取出滤膜80℃烘烤2小时。

(5)用6～10mL Northern预杂交液，42℃预杂交过夜。

(6)将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入6～10mL Northern杂交液。

(7)去除预杂交液，加入含探针的杂交液，42℃，杂交过夜。

(8)按下列条件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟

0.25×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟

(9)曝光于X光片暗盒中放射自显影1天。显影，定影，根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序，也可测含量。

三、蛋白Western Blot及分析

此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。

1、配液：

(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH8.0

150mmol/L 甘氨酸

加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL

甲醇，加水至6L

(2)丽春红S溶液：0.5%丽春红S

1%乙酸

2、操作步骤（如图20-2）：

图20-2 Western Blot装置图

(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。

(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。

(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。

(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。

(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4小时或过夜。

(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。

(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。

(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。

(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。

(10)将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。

结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小，而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量。

第三节 细胞的原位杂交技术

原位杂交(ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，此方法原理是由DNA或RNA的序列与互补的标记单链DNA/RNA探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。

一、探针的制备原则和选择

探针为RNA或双链、单链DNA，双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性，降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组DNA杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。

探针的获得常采用随机引物延伸法的PCR合成和扩增，可获大量的DNA探针，或利用带有噬菌体强启动子多克隆位点的质粒载体来合成RMA探针，也可利用质粒菌扩增质粒，经酶切后纯化的基因片断，均可以获得制备探针原料。这些探针可以用同位素标记，也可以用非同位素标记，即光敏生物标记或地高辛配基标记于脱氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通过随机引物或缺口平移法与探针的核酸分子相连，构成地高辛一配基标记的核酸探针。比探针可用抗地高辛抗体偶联酶或荧光素通过松体结合和底物显色或产生荧光来检测。

这些探针基本均有市售，无需自行制备，只要根据说明书使用即可。

二、载玻片和盖玻片预处理

为了防止探针的非特异贴附而保证细胞粘附而需处理：

1、用于检测RNA的载玻片的处理

(1)用0.1mol/L HCL洗载玻片20分钟，再用无水乙醇洗数次使其干燥。

(2)在下列溶液中，65℃处理2小时

3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。

(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分钟，180℃烘烤2小时。

2、用于检测DNA的载玻片的处理

以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂载玻片。

3、对于盖玻片：于0.1mol/L HCL中浸泡20分钟，用无水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小时。

三、组织细胞固定

理想的细胞固定过程应该保护细胞形态，同时确保目的基因DNA或RNA序列暴露。对于RNA-RNA原位杂交有效的固定剂是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸缓冲液PBS、赖氨酸、过碘酸盐及重酪酸盐）。

1、涂片细胞原位杂交固定

(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗涤细胞，于0.1%胰蛋白酶消化，收获细胞计数，涂载玻片上。

(2)若检测RNA，固定于4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分钟，PBS洗5分钟，系列乙醇脱水干燥，-20℃保存。

(3)若检测DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小时，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟，浸泡在下述溶液中2×5分钟：

0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟。

(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃处理10分钟，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。

(5)在20%(v/v)乙酸中40℃处理15分钟，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。

注意：对于DNA-DNA原位杂交多聚甲醛或福尔马林均可，但对于地高辛检测法必须用4%多聚甲醛，固定至少16小时，而且用蛋白酶K处理，这样可明显减少背景染色。

四、原位杂交

原位杂交与盐浓度、温度、甲酰胺浓度、pH等有关，DNA复性的温度是16～32℃，DNA-RNA原位杂交，25℃最佳，RNA-DNA杂交，可用较高温度，在pH5～9范围内复性率基本上与pH无关。最好选用温和的碱性条件。甲酰胺有机溶剂可降低双链核酸的稳定性，可避免杂交过程中处于过高的温度，防止高温破坏组织。

(一)同位素标记DNA探针的原位杂交

同位素标记的DNA探针，敏感性高，但要注意非特异结合，如35S标记探针在杂交前，用未经标记的dUTP预杂交，可减少非特异，可获较好的细胞内定位，此外还常用3H或125I标记探针，但3H放射线弱，自显影需100天曝光，不太理想，方法如下：

(1)取已形成单层的细胞的盖玻片，悬浮细胞可采用离心法，将细胞粘附到涂有明胶的载玻片上。组织印片，冰冻切片等标本。

(2)将标本浸入甲醇固定5分钟，再过3次4℃预冷的10%三氯醋酸。

(3)将细胞片标本浸入70%乙醇脱水，空气干燥，这时培养细胞盖玻片应该用中性树胶固定于载玻片上，注意细胞面向上。

(4)将细胞片放置在金属盘内，并将托盘放入43℃水浴箱中预热。

(5)直接向固定的细胞面滴加5mL含探针杂交液，然后用16mm盖玻片覆盖，其边缘用橡胶液封闭。

(6)43℃恒温水浴箱内培养18小时，此间保持箱内高湿度，防止因盖玻片封闭不严导致杂交缓冲液干涸。

(7)反应结束后，将玻片置于冰块上，用镊子小心剥下盖玻片周边的橡胶，将载玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使盖玻片脱落。

(8)将载玻片放入湿盒中，加2×SSC溶液浸没玻片，加盖玻片并用胶带封闭湿盒。然后，将湿盒移入水浴箱中53℃处理30分钟。

(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分钟。

(10)玻片浸入70%乙醇脱水，空气干燥。

(11)将干燥后的干燥标本浸入新配制的核4乳胶液（核4乳胶液蒸馏水=1:1），垂直取出玻片，用滤纸擦去背面多余胶，室温干燥5小时（在暗室中进行）。

(12)用黑纸包裹标本放在4℃冰箱曝光（3H标记的探针通常需2～4周，有时需长达100天，可造成高背景，而不理想）。

(13)按常规显影、定影、水洗。

(14)对标本进行Giemsa或HE染色、脱水、封片。

结果分析：镜下观察，如需定量，可在镜下计数银颗粒或拍摄显微照片，用图象分析仪进行灰度分析。

(二)同位素标记RNA探针的原位杂交

RNA探针容易制备，合成率较高，成本低，易纯化，可提高检测敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA杂交比DNA-DNA杂交稳定，能适应更多的条件。

(1)标本处理同前

(2)将RNA标记探针溶于杂交缓冲液中（5×107CPM/ml放射强度）。

50～70%去离子甲酰胺 2×SSC

0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0

200μg/mL变性鱼精DNA 85℃ 5分钟

(3)每张载玻片上滴加杂交液，使每张载玻片探针总量为2×105CPM，用一硅化的盖玻片盖住，封以不透性矿物油，在利于探针的温度下（常为42℃）杂交7～18小时。

(4)用氯仿洗数次，去除矿物油，室温下使盖玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC液，杂交温度下60分钟，室温2×SSC洗5分钟，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除单链RNA，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC,室温15分钟，室温下用0.1×SSC洗5分钟。

(5)将切片脱水，浸入由1%甘油稀释的放射自显影乳剂（1:1）中，放入暗盒中，在有硅胶干燥剂存在下-70℃，存放5天（或者曝光于X光胶片24～48小时），随后浸于液体乳剂。

(6)用HE染色。

(三)地高辛标记的DNA探针原位杂交

放射性同位素标记探针缺点是有放射损伤，易污染环境，需特殊防护和实验条件，有半衰期受限、标记不稳定及曝光时间长。若改用生物素、乙酰氨基、荧光或地高辛标记可避免，其中以地高辛标记探针最敏感，随机引物标记地高辛，其标记率很高，此探针用于原位杂交可获高敏感性，好的细胞定位以及低背景。非同位标记探针还可以通过双标记原位杂交法，同时测多条DNA序列。

(1)配液：①杂交缓冲液：2×SSC

5%（W/V）磷酸葡聚糖

50%去离子甲酰胺

②缓冲液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5

0.5mol/L Nacl

③缓冲液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5

0.1mol/L Nacl

5mmol/L MgCl2

(2)操作步骤：

①组织标本处理同前。

②将140ng/mL地高辛标记的探针加到杂交缓冲液中，每张滴加50μL杂交缓冲液，用盖玻片盖住，四周封以树胶。

③将目的DNA和DNA探针放入90℃，进行变性10分钟，双链打开，42℃，在潮湿环境中杂交16小时。

④去除盖玻片，按下列条件洗涤：

2×SSC室温10分钟→2×SSC室温10分钟→0.2×SSC室温10分钟→0.2×SSC 42℃ 20分钟。

⑤再按以下方法处理：

1) 在缓冲液I中洗30分钟。

2) 在含有20%羊血清的缓冲液I中洗30分钟。

3) 滴加1:5000标有碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的地高辛抗体，在装有缓冲液I的湿盒中温育20分钟。

4) 在缓冲液I中洗2×20分钟。

5) 在缓冲液II中洗60分钟。

6) 加入下述溶液：缓冲液II

0.33mg/mL 四唑氮兰

0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate

7) 将切片浸于20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA终止反应。

⑥ 用底物显色、复染、脱水、封片，按免疫组化常规法进行。

说明：

(1)用不同浓度和不同温度的盐溶液洗涤是为了去除探针与不完全同源序列杂交，减少非特异性显色，其原则盐浓度由高到低，温度由低到高洗涤，洗涤过程中切勿使切片干燥。

(2)应该有阳性和阴性对照，阳性对照：用该探针与已知含互补序列的组织细胞标本进行杂交。阴性对照：①应用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未标记探针；③不加核酸探针进行杂交（空白对照）；④用不含探针DNA的无关质粒DNA替代探针进行杂交；⑤同义RNA（Sense probe）进行杂交。

（1）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。

用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。

（2）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。

（3）污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。

（二）已经污染，可以加入RNA酶的抑制剂

（1）RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物(mammalmammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。

（2）氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。

（3）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。

（三）提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，从而免受RNA酶的干扰。

羧基在水中部分电离；而胍基接近强碱，几乎完全形成阳离子。所以此时胍基上的氮难有亲核的力量。又：羧基和胍基的反应是要脱去水的，在水溶液中因为有水，平衡大大向反应物偏移。

因此醋酸和盐酸胍在不太浓的水溶液中是不易反应的。

如试图合成羧基和胍基缩合的产物，须用醋酸胍在醋酸条件下加热回流脱水。一般而言羧基和胍基的缩合反应，其条件都在无水体系里（甚至是熔融），常需酸催化脱水；但因胍基在酸性条件下主要以盐的形式存在，反应速率不快，需长时间回流，还要避免副产物。

注：可用羧酸酯同醇溶的游离胍基进行亲核反应，速率稍快，可以作为代替。