与其他分子生物学方法相比,用荧光探针RT-PCR法检测诺如病毒有什么优势

团体标准T/CVMA 5—2018

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法

Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus

中国兽医协会发布

前言

本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。

本标准由中国兽医协会提出并归口。

本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。

本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。

1、范围

本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。

本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

2、规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489 实验室 生物安全通用要求

NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3、试剂

3.1 DNA提取试剂

DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。

3.2 2 × PCR缓冲液

2 × PCR缓冲液的配制见附录A。

3.3 引物探针

3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：

上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'

下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'

荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'

3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：

上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'

下游引物ASF-OIE-rPCRR：

5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'

荧光探针ASF-OIE-Probe：

5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'

3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。

3.4 阴性及阳性对照

阴性及阳性对照的制备方法见附录C。

3.5 其他试剂

消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。

消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。

4、仪器和耗材

分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。

5、操作步骤

5.1 样品采集及运输

样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。

5.2 样品处理

检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。

5.3 样品保存

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

5.4 病毒DNA提取

5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。

5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。

5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。

5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。

5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。

5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。

5.5 实时荧光PCR操作

5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。

5.5.2 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。

5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。

5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。

6、结果判定

6.1 结果分析条件设定

实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。

6.2 结果描述及判定

当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。

7、实验室生物安全要求

7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。

7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。

一

附录 A (规范性附录) 试剂的配制

A.1 DNA提取液1

PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。

A.2 DNA提取液2

1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。

即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。

A.3 2×PCR缓冲液

灭菌去离子水 70 mL

三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g

氯化钾 1.865 g

曲拉通X-100 0.5 mL

dATP (100mmol/L) 2.5 mL

dTTP (100mmol/L) 2.5 mL

dGTP (100mmol/L) 2.5 mL

dCTP (100mmol/L) 2.5 mL

六水氯化镁 0.61 g

盐酸 调pH至9.0

灭菌去离子水 加至100 mL

A.4 消毒液

8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。

A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方

A.5.1 A液

0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。

A.5.2 B液

0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。

A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制

取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。

A.6 无DNA酶的灭菌去离子水

无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。

二

附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列

1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA

61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT

121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT

181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT

241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT

301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT

361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC

421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT

481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC

541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA

601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA

661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT

721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT

781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT

841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC

901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT

961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC

1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG

1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT

1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA

1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC

1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA

1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA

1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT

1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC

1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA

1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT

1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT

1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG

1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA

1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG

1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT

三

附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照

C.1阳性对照

阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。

C.2 阴性对照

阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。

四

附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方

实时荧光PCR反应液配方见表D.1。

表D.1 实时荧光PCR反应液配方

组 分

1个检测体系的加入量

2×PCR 缓冲液a

12.5μL

dNTP（2.5 mmol/L）

1.0 μL

上游引物（10 μmol/L）

1.0 μL

下游引物（10 μmol/L）

1.0μL

探针（10 μmol/L）

1.0 μL

Taq 酶b（5U/μL）

0.5μL

去离子水

3μL

总体积

20μL

2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。

Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。

五

附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考

图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。

图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图

(资料来源：中国兽医协会）

薄层色谱显色问题

常洪勋

显色剂可以分成两大类：一类是检查一般有机化合物的通用显色剂另一类是根据化合物分类或特殊官能团设计的专属性显色剂。显色剂种类繁多，本章只能列举一些常用的显色剂。

l.通用显色剂

①硫酸常用的有四种溶液：硫酸-水(1：1)溶液硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液1.5mol/L硫酸溶液与0.5-1.5mol/L硫酸铵溶液，喷后110oC烤15min，不同有机化合物显不同颜色。

②0.5%碘的氯仿溶液 对很多化合物显黄棕色。

③中性0.05%高锰酸钾溶液 易还原性化合物在淡红背景上显黄色。

④碱性高锰酸钾试剂 还原性化合物在淡红色背景上显黄色。

溶液I：1%高锰酸钾溶液溶液Ⅱ：5%碳酸钠溶液溶液I和溶液Ⅱ等量混合应用。

⑤酸性高锰酸钾试剂 喷1.6%高锰酸钾浓硫酸溶液(溶解时注意防止爆炸)，喷后薄层于180oC加热15～20min。

⑥酸性重铬酸钾试剂 喷5%重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150oC烤薄层。

⑦5%磷钼酸乙醇溶液 喷后120oC烘烤，还原性化合物显蓝色，再用氨气薰，则背景变为无色。

⑧铁氰化钾-三氯化铁试剂 还原性物质显蓝色，再喷2mol/L盐酸溶液，则蓝色加深。

溶液I：1%铁氰化钾溶液溶液Ⅱ：2%三氯化铁溶液临用前将溶液I和溶液Ⅱ等量混合。

2.专属性显色剂

由于化合物种类繁多，因此专属性显色剂也是很多的，现将在各类化合物中最常用的显色剂列举如下：

(1) 烃类

①硝酸银/过氧化氢

检出物：卤代烃类。

溶液：硝酸银O.1g溶于水lml，加2-苯氧基乙醇lOOml，用丙酮稀释至200ml，再加30%过氧化氢1滴。

方法：喷后置未过滤的紫外光下照射

结果：斑点呈暗黑色。

②荧光素/溴

检出物：不饱和烃。

溶液：I.荧光素0.1g溶于乙醇lOOmlⅡ.5%溴的四氯化碳溶液。

方法：先喷(I)，然后置含溴蒸气容器内，荧光素转变为四溴荧光素(曙红)，荧光消失，不饱和烃斑点由于溴的加成，阻止生成曙红而保留荧光，多数不饱和烃在粉红色背景上呈黄色。

③四氯邻苯二甲酸酐

检出物：芳香烃。

溶液：2%四氯邻苯二甲酸酐的丙酮与氯代苯(10：1)的溶液。

方法：喷后置紫外光下观察。

④甲醛/硫酸

检出物：多环芳烃。

溶液：37%甲醛溶液O.2ml溶于浓硫酸l0ml。

(2)醇类

①3，5一二硝基苯酰氯

检出物：醇类。

溶液：I.2%本品甲苯溶液Ⅱ.0.5%氢氧化钠溶液Ⅲ.O.002%罗丹明溶液。

方法：先喷(I)，在中干燥过夜，用蒸气薰2min，将纸或薄层通过试液(Ⅱ)30s，喷水洗，趁湿通过(Ⅲ)15s，空气干燥，紫外灯下观察。

②硝酸铈铵

检出物：醇类。

溶液：I.1%硝酸铈铵的0.2mol/L硝酸溶液Ⅱ.N,N-二甲基-对苯二胺盐酸盐1.5g溶于甲醇、水与乙酸(128m1+25m1+1.5m1)混合液中，用前将(I)与(Ⅱ)等量混合。喷板后于105oC加热5min。

③香草醛/硫酸

检出物：高级醇、酚、甾类及精油。

溶液：香草醛1g溶于硫酸lOOml。

方法：喷后于120oC加热至呈色最深。

④二苯基苦基偕肼 ’

检出物：醇类、萜烯、羰基、酯与醚类。

溶液：本品15mg溶于氯仿25ml中。

方法：喷后于110oC加热5～lOmin。

结果：紫色背景呈黄色斑点。

(3)醛酮类

①品红/亚硫酸

检出物：醛基化合物。

溶液：I.0.01%品红溶液，通入二氧化硫直至无色Ⅱ.0.05mol/L氯化溶液

Ⅲ.O.05mol/L硫酸溶液。

方法：将I、Ⅱ、Ⅲ以1：1：10混合，用水稀释至l00ml。

②邻联茴香胺

检出物：醛类、酮类。

溶液：本品乙酸饱和溶液。

③2，4-二硝基苯肼

检出物：醛基、酮基及酮糖。

溶液：I.0.4%本品的2mol/L盐酸溶液Ⅱ.本品O.1g溶于乙醇l00ml中，加浓盐酸lml。

方法：喷溶液I或Ⅱ后，立即喷铁氰化钾的2mol/L盐酸溶液。

结果：饱和酮立即呈蓝色饱和醛反应慢，呈橄榄绿色不饱和羰基化合物不显色。

④绕丹宁

检出物：类胡萝卜素醛类。

溶液：I.1%～5%绕丹宁乙醇溶液Ⅱ.25%氢氧化铵或27%氢氧化钠溶液。

方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ，干燥。

(4)有机酸类

①溴甲酚绿

检出物：有机酸类。

溶液：溴甲酚绿0.1g溶于乙醇500ml和0.1mol/L氢氧化钠溶液5ml。

方法：浸板。

结果：蓝色背景产生黄色斑点。

②高锰酸钾/硫酸

检出物：脂肪酸衍生物。

溶液：见通用显色剂酸性高锰酸钾。

③过氧化氢

检出物：芳香酸。

溶液：0.3%过氧化氢溶液。

方法：喷后置紫外光(365nm)下观察。

结果：呈强蓝色荧光。

④2，6-二氯苯酚-靛酚钠

检出物：有机酸与酮酸。

溶液：0.1%本品的乙醇溶液。

方法：喷后微温。

结果：蓝色背景呈红色。

(5)酚类

①Emerson 试剂(4-氨基安替比林/铁氰化钾(Ⅲ))

检出物：酚类、芳香胺类及挥发油。

溶液：I.4-氨基安替比林1g溶于乙醇100mlⅡ.铁氰化钾(Ⅲ)4g溶于水50ml，用乙醇稀释至100ml。

方法：先喷溶液I，在热空气中干燥5min，再喷溶液Ⅱ，再于热空气中干燥5min，然后将板置含有氨蒸气(25%氨溶液)的密闭容器中。

结果：斑点呈橙-淡红色。挥发油在亮黄色背景下呈红色斑点。

②Boute 反应

检出物：酚类、氯、溴、烷基代酚。

方法：将薄层置有NO2蒸气(含浓硝酸)的容器中3～10min，再用NH2蒸气(浓氨液)处理。

③氯醌(四氯代对苯醌)

检出物：酚类。

溶液：1%本品的甲苯溶液。

④DDQ(二氯二氰基苯醌)试剂

检出物：酚类。

溶液：2%本品的甲苯溶液。

⑤TCNE (四氰基乙烯)试剂

检出物：酚类、芳香碳、杂环类、芳香胺类。

溶液：0.5%～1%本品的甲苯溶液。

⑥Gibb’s(2，6-二溴苯醌氯亚胺)试剂

检出物：酚类。

溶液：2%本品的甲醇溶液。

⑦氯化铁

检出物：酚类、羟酰胺酸。

溶液：1%～5%氯化铁的

ztlhy

4楼: Originally posted by Lee631015 at 2013-10-23 00:33:29

有共轭不是254nm荧光，是365nm，好好查查书吧

...

额，貌似是254nm显色是低共轭体系的有机物，365nm的是高共轭体系（某些聚合物）的有机物，关键是这程度，不是共轭的有无。

yi_wang

小木虫中应该有此类文章或者电子书下载吧。

yi_wang

发给你看看。

Lee631015

8楼: Originally posted by ztlhy at 2013-10-23 12:19:00

额，貌似是254nm显色是低共轭体系的有机物，365nm的是高共轭体系（某些聚合物）的有机物，关键是这程度，不是共轭的有无。...

254nm时是薄层硅胶有荧光，暗点是物质；不共轭，含派键，230-270nm，荧光较微弱，越近真空紫外区的，肉眼越难看到；共轭，在270-400，显荧光；共轭体系更大，可见光显色，直接有颜色，不用紫外定位仪；以上数据均为大概，薄层定位254的暗点有弱荧光，但是定位靠的不是那弱荧光，是因为薄层板上其他荧光比它强，亮

792193347

11楼: Originally posted by Lee631015 at 2013-10-23 14:17:20

254nm时是薄层硅胶有荧光，暗点是物质；不共轭，含派键，230-270nm，荧光较微弱，越近真空紫外区的，肉眼越难看到；共轭，在270-400，显荧光；共轭体系更大，可见光显色，直接有颜色，不用紫外定位仪；以上数据均为 ...

这位是高手

chenyayun

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Lee631015

11楼: Originally posted by Lee631015 at 2013-10-23 14:17:20

254nm时是薄层硅胶有荧光，暗点是物质；不共轭，含派键，230-270nm，荧光较微弱，越近真空紫外区的，肉眼越难看到；共轭，在270-400，显荧光；共轭体系更大，可见光显色，直接有颜色，不用紫外定位仪；以上数据均为 ...

谢谢，你不知道我有多高兴，从未有人在这方面肯定过我，我只是个曾经在植化实验室呆过10个月的本科小喽啰，没发过一篇文章的小喽啰，真心感谢啊！

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薄层色谱法问题求助

1、关于薄层色谱法中用三用紫外仪观察薄层板的工作原理，尽量详细点；

2、如何判断薄层板上看到的深紫和亮紫哪条带是产物哪条是副产物,有没有经验可供分享。

廉洁考研必胜

一般来说共轭结构才能在紫外下显色，你可以看看紫外光谱的介绍。平时也不会根据颜色的深浅来判断产物与副产物的，再说紫外下判断颜色的深浅也没有那么容易，都是根据产物的极性大小来预判断的，然后会通过核磁等手段进行验证

xujun9998

紫外分析仪是荧光技术的应用　

首先了解一下什么是荧光，荧光又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 

荧光技术是某些物质受一定波长的光激发后，在极短时间内（10-8秒）会发射出波长大于激发波长的光，这种光称为荧光。这一发光现象在各方面的应用及有关的方法称为荧光技术（fluorescent technique）。 

物质经过紫外线照射后发出荧光的现象可分为两种情况，第一种是自发荧光，如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能发出红色的荧光，称为自发荧光；第二种是诱发荧光，即物体经荧光染料染色后再通过紫外线照射发出荧光，称为诱发荧光。 

紫外荧光技术应用主要包括以下几个方面： 　

1、物质的定性：不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。与吸收光谱法相比，荧光法具有更高的选择性。 　

2、研究生物大分子的物理化学特性及其分子的结构和构象：荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周围的环境，即对周围环境十分敏感。利用此特点可通过测定上述有关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位的微环境的特征及其变化。在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的荧光发色团（如色氨酸、酪氨酸、鸟苷酸等，此类荧光称为内源荧光）以外，可将一些特殊的荧光染料分子共价地结合或吸附在生物大分子的某一部位，通过测定该染料分子的荧光特性变化来研究生物大分子，这种染料分子被称为“荧光探针”，它们发出的荧光一般称为外源荧光。荧光探针的应用，大大地开拓了荧光技术在分子生物学中的应用范围。　 　

　 紫外灯功率：波长为365nm的紫外灯，功率为28W；波长为300nm的紫外灯，功率为8W；波长为254nm的紫外灯，功率为28W

薄层板上看到的深紫和亮紫哪条带是产物哪条是副产物,这个要根据具体结构，如果共轭双键多，荧光强度大，点浓而且会红移

dxddcl521520

4楼: Originally posted by xujun9998 at 2014-12-04 08:00:14

紫外分析仪是荧光技术的应用　

首先了解一下什么是荧光，荧光又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发 ...

波长为365nm的紫外灯，波长为300nm的紫外灯，波长为254nm的紫外灯，在什么情况下需要开哪种波长的紫外灯？

xujun9998

5楼: Originally posted by dxddcl521520 at 2014-12-04 22:30:14

波长为365nm的紫外灯，波长为300nm的紫外灯，波长为254nm的紫外灯，在什么情况下需要开哪种波长的紫外灯？...

我一般都开，只有一个苯环的254nm

dxddcl521520

6楼: Originally posted by xujun9998 at 2014-12-05 10:32:29

我一般都开，只有一个苯环的254nm...

对于同一块薄层板来说，你分别用上中波长的紫外灯，你没发现色带的位置、颜色会有区别吗？

sjq1234

一般只要化合物含有不饱和共轭键就会在紫外下显色，至于亮紫和深紫，这个不能单纯这样看，万一你做的实验产路很低杂质很多呢？

soulink

刮下来送LC－Ms 或送核磁啊，如果看颜色就能判断产物是哪个还要仪器干么

Call Rate >99%

单独针对某个点的质控，阈值为0.15（默认值）

修改阈值，可以改变整体的Call Rate，但阈值越低准确性越差。

Staining controls主要用于检测X染色剂在染色阶段的敏感性和特异性，包括微珠被高强度和低强度(背景)生物素和二硝基苯酚覆盖情况，以及微珠与绿色荧光链霉亲和素和红色荧光抗二硝基苯酚抗体的结合情况。该control不只取决于DNA的杂交效率，还可反映单碱基延伸的情况。

Staining controls检测通道分为红色和绿色荧光信号两部分。红色荧光信号代表二硝基苯酚，绿色荧光信号代表生物素。左图中可看出，红色荧光信号值明显高于其他荧光信号值，其他荧光信号值均在背景信号值范围内；右图片绿色荧光信号值明显高于其他荧光信号值，其他荧光信号值均在均在背景信号值范围内。

图片结果表明本次实验染色正常。

Extension Controls主要用于检测X染色阶段单碱基延伸的效率。Extension Controls由发夹寡核苷酸组成，必须成功进行单碱基延伸和染色方能体现荧光信号。

Extension Controls检测通道为红色和绿色荧光信号两部分. 其中，红色荧光代表延伸碱基为A或T，绿色荧光代表延伸碱基为C或G。左图中红色荧光信号值(A,T碱基的荧光值)明显高于其他荧光信号值，其他荧光信号值均在背景信号值范围内；右图中绿色荧光信号值(C,G碱基的荧光值)明显高于其他荧光信号值，其他荧光信号值均在背景信号值范围内。

图片结果表明本次单碱基延伸情况正常。

Target Removal Controls主要用于检测单碱基延伸后DNA模板的分离效率。Target Removal controls产生的信号应该在背景信号值范围内。如果靶DNA分离效率很低将会导致信号强度超过背景信号值。

Removal controls检测通道为绿色荧光信号。右图中绿色荧光信号值均在背景值范围内。

图片结果表明DNA模板分离正常。

Hybridization Controls主要用于检测芯片杂交的效率。该control使用靶向合成序列DNA（主要有高5 pM、中1 pM、低0.2 pM三种水平量）代替基因组扩增DNA与微珠进行杂交。其结果不仅取决于杂交效率，还取决于染色阶段的单碱基延伸是否成功。

Hybridization Controls检测通道为绿色荧光信号。右图中高中低三个的信号值呈现三个明显的梯度，且都在正常范围内。

图片结果说明芯片杂交效率没有问题。

（如果没有用FFPE Restore kit处理的样本可以不关注本部分）

Restoration Control主要用于检测FFPE样本降解DNA的修复情况。Restoration Control将短的寡核苷酸加入到Infinium HD FFPE restore kit中，通过Infinium HD FFPE restore kit的化学反应，在修复正常的情况下，样本中的寡核苷酸就可以和微珠上的探针相结合，产生荧光信号。

Restoration Control检测通道为绿色荧光信号。右图中绿色荧光信号值在背景范围内。

图片结果说明芯片实验没有经过FFPE Restore kit处理。

Stringency Controls 主要用于检测杂交的严谨性。严谨的探针杂交主要以靠升高温度和优化杂交缓冲液来完成。该control探针设计包括完美匹配探针（PM，序列与目的基因完美匹配）和错配探针（MM，序列与目的基因不完全匹配）两种。

Stringency Controls检测通道为红色荧光信号。左图中PM探针荧光信号值在正常范围内， MM探针荧光信号值在背景信号值范围内。

图片结果说明芯片杂交的严谨性极高。

Non-Specific Binding Controls主要用于检测DNA扩增产物杂交的特异性，判断样本DNA的质量，对非人类DNA进行识别。Non-specific Binding Controls中的探针和细菌的序列互补但不能与人类的序列杂交，如果样本有细菌污染将会与control探针（细菌探针）结合而使信号值增强。

Non-Specific Binding Controls检测通道包括红色和绿色荧光信号。下图中，红色荧光信号通道和绿色荧光信号通道中的所有信号值均在背景信号值范围内。

图片结果说明样本质量较好，无细菌污染。

Non-Polymorphic Controls主要用于检测DNA的扩增情况。该control通过人类基因组非多态区域的特定位点来评估芯片的整体性能（从扩增情况到缺失情况）。

non-polymorphic control检测通道包括红色和绿色荧光信号。其中，A和T使用红色荧光通道检测，C和G使用绿色荧光通道检测。左图中A和T碱基的信号值明显高于其他信号值，其余信号值均在背景值范围内；右图中C和G碱基的信号值明显高于其他信号值，其余信号值均在背景值范围内。

图片结果说明DNA扩增正常。

分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术微生物基因环境污染物降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 1.1PCR及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 1.2FISH技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 1.3基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 1.4生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 2.1土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤(2)分离细胞与土壤(3)细胞裂解(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 2.2采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 2.3基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在E.eoli中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 2.4FISH技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW，etal.Basieloealalign- mentsearehtool . JMolBiol，1990，215(3):403一410 3魏志琴，曾秀敏，宋培勇 . 土壤微生物DNA提取方法研 究进展 . 遵义师范学院学报，2006，8(4):53一56 4FaegriA，TorsvikVL，GoksoyrJ.Baeteria]andfunga] aetivitiesin5011:seParationofbacteriaandfungibyaraPid fraetionatedeentrifugationteehnique5011BiolBioehem， 1977，9(2):105一112 5SelvaratnamS，SehoedelBA，MeFarlandBL，etal APPlieationofreversetranseriPtasePCRformonitoring exPressionoftheeataboliedmPNgeneinaPhenol- degradingsequencingbatehreaetor . APPIEnviron Microbiol，1995，61(11):3981一3985 6徐玉泉，张维，陈明等 . 一株苯酚降解菌的分离和鉴 定 . 环境科学学报，2000，20(4):450一455 7MarshTL，LiuWT，ForneyLJ . Beginningamoleeular analysisoftheeukiU洲aleollllllunityinaetivatedsludge. WaterSeiTechnol，1998，37(4一5):455一460 8王峰，傅以钢，夏四清等.PCR一DGGE技术在城市污 水化学生物絮凝处理中的特点 . 环境科学，2004，25 (6):74一79 9涂书新，韦朝阳 . 我国生物修复技术的现状与展望 . 地 理科学进展，2004，23(6):20一31 10VainioEJ，MoilanenA，KoivulaTT，etal . ComParison ofpartial165rRNAgenesequeneesobtainedfromactiva- tedsludgebaeteria . APPIMierobiolBioteehnol，1997，48 (l):73一79 11罗如新，张素琴，李顺鹏 . 邻苯二酚1，2一双加氧酶

常温下，染色体用醋酸洋红溶液或龙胆紫溶液染色；低温时，低温会影响龙胆紫溶液或醋酸洋红液的作用，所以在低温时会选择改良苯酚品红染液对染色体染色。

染色体的成分就是是细胞内具有遗传性质的物体,易被碱性染料染成深色,所以叫染色体（染色质）；其本质是脱氧核甘酸,是细胞核内由核蛋白组成、能用碱性染料染色、有结构的线状体,是遗传物质基因的载体，用醋酸洋红溶液、龙胆紫溶液、改良苯酚品红染液等进行染色。

染色体：

染色体的超微结构显示染色体是由直径仅100埃（Å，1埃=0.1纳米）的DNA-组蛋白高度螺旋化的纤维所组成。每一条染色单体可看作一条双螺旋的DNA分子。有丝分裂间期时，DNA解螺旋而形成无限伸展的细丝，此时不易为染料所着色，光镜下呈无定形物质，称之为染色质。有丝分裂时DNA高度螺旋化而呈现特定的形态，此时易被碱性染料着色，称之为常染色体。

1970年后陆续问世的各种显带技术对染色体的识别作出了很大贡献。中期染色体经过DNA变性、胰酶消化或荧光染色等处理，可出现沿纵轴排列的明暗相间的带纹。按照染色体上特征性的标志可将每一个臂从内到外分为若干区，每个区又可分为若干条带，每条带又再分为若干个亚带，例如“9q34.1”即表示9号染色体长臂第3区第4条带的第1个亚带。由于每条染色体带纹的数目和宽度是相对恒定的，根据带型的不同可识别每条染色体及其片段。

80年代以来根据DNA双链互补的原理，应用已知序列的DNA探针进行荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）可以识别整条染色体、染色体的1个臂、1条带甚至一个基因，因而大大提高了染色体识别的准确性和敏感性。染色体是遗传物质—基因的载体，控制人类形态、生理和生化等特征的结构基因呈直线排列在染色体上。2000年6月26日人类基因组计划（HGP）已宣布完成人类基因组序列框架图。2001年2月12日HGP和塞雷拉公司公布了人类基因组图谱和初步分析结果。人类基因组共有3～3.5万个基因，而不是以往认为的10万个。由此可见，染色体和基因二者密切相关，染色体的任何改变必然导致基因的异常。

氨基酸中参与和金属离子配位的主要基团有：半胱氨酸的巯基，组氨酸的咪唑基，谷氨酸和天东氨酸的羧基，酪氨酸的苯酚基以及蛋氨酸的甲硫基等

DNA中鸟嘌呤，腺嘌呤的N7位置电负性最低，是金属离子结合的主要位点

中国科学院兰州化学物理研究所绿色催化课题组在离子液体结构与溶剂极性的相关研究方面取得新进展。最新成果发表在近期出版的《物理化学B》

该课题组揭示了基于咪唑的羟基离子液体的独特的极性特征，发现羟基对离子液体的极性呈现出明显的区分效应。通过溶剂显色化染料和荧光探针分子表征，发现对于具有不同阴离子的非羟基的咪唑类离子液体，其极性都很相接近（ET(30) = 50.7–52.6 Kcal/mol）。与非羟基离子液体相比较，羟基离子液体的极性范围变宽（ET(30) = 51.2–61.7 Kcal/mol），且呈现出较强的阴离子依赖性。Kamlet-Taft溶剂参数和密度泛函理论计算表明这种羟基诱导的极性区分效应主要是因为阳离子上引入羟基后，阴离子与羟基之间存在的离子氢键作用因为阴离子种类的不同而得到区分，由此导致离子液体与极性探针分子的作用强弱不同。进一步研究发现，螺吡喃-部花青平衡（Spiropyran-Merocyanine）作为一种极性敏感的探针反应，在此类羟基离子液体中呈现出明显极性响应的溶剂化显色、光致变色和热回复行为。

研究发现的“超极性”的羟基离子液体（[PF6]，[NTf2]和[ClO4]），可以作为单一物质而非混合物，用于填补介于水与普通溶剂间的极性空白，这种高极性的非酸和非水的离子介质可广泛用于合成与催化。本研究表明通过引入较高活性的基团（例如羟基）能促进阳离子-阴离子间的相互作用，并提供了一种设计和合成极性-特定离子液体的思路和方法。

4- (4- 戊基反式环己基) 苯甲酸4- ( (2 ,3 ,4-

三氟苯胺亚甲基) 苯酚酯(5 CAPE) 的合成

将3178 g (10 mmol) 4- (4- 戊基反式环己基) 苯

甲酸4- 醛基苯酚酯和1147 g (10mmol) 2 ,3 ,4- 三氟

苯胺溶于80 mL 无水乙醇,加入几滴冰醋酸,加热至

回流反应5 h ,冷却,静置过夜. 过滤,所得白色粉末

用无水乙醇重结晶,即得目标化合物,产率87 % ,纯

度9912 %.

ML28-1 杯芳烃化合物的合成及其在氟化反应中的相转移催化作用

ML28-2 高效液相色谱分离硝基甲苯同分异构体

ML28-3 甲烷部分氧化反应的密度泛函研究

ML28-4 硝基吡啶衍生物的结构及其光化学的研究

ML28-5 酰胺衍生的P，O配体参与的Suzuki偶联反应及其在有机合成中的应用

ML28-6 磺酰亚胺的新型加成反应的研究

ML28-7 纯水相Reformatsky反应的研究

ML28-8 一个合成邻位氨基醇化合物的绿色新反应

ML28-9 恶二唑类双偶氮化合物的合成与光电性能研究

ML28-10 CO气相催化偶联制草酸二乙酯的宏观动力学研究

ML28-11 三芳胺类空穴传输材料及其中间体的合成研究

ML28-12 光敏磷脂探针的合成、表征和光化学性质研究

ML28-13 脱氢丙氨酸衍生物的合成及其Michael加成反应研究

ML28-14 5-（4-硝基苯基）-10，15，20-三苯基卟啉的亲核反应研究

ML28-15 醇烯法合成异丙醚的研究

ML28-16 手性螺硼酸酯催化的前手性亚胺的不对称硼烷还原反应研究

ML28-17 甾类及相关化合物的结构与生物活性关系研究

ML28-18 金属酞菁衍生物的合成与其非线性光学性能的研究

ML28-19 新型手性氨基烷基酚的合成及其不对称诱导

ML28-20 水滑石类化合物催化尿素醇解法合成有机碳酸酯研究

ML28-21 膜催化氧化正丁烷制顺酐

ML28-22 甲醇选择性催化氧化制早酸甲酯催化剂的研制与反应机理研究

ML28-23 甲酸甲酯水解制甲酸及其动力学的研究

ML28-24 催化甲苯与甲醇侧链烷基化反应制取苯乙烯和乙苯的研究

ML28-25 烯胺与芳基重氮乙酸酯的新反应研究

ML28-26 核酸、蛋白质相互作用研究及毛细管电泳电化学发光的应用

ML28-27 H-磷酸酯在合成苄基膦酸和肽衍生物中的应用

ML28-28 微波辐射下三价锰离子促进的2-取代苯并噻唑的合成研究

ML28-29 铜酞菁—苝二酰亚胺分子体系的光电转换特性研究

ML28-30 新型膦配体的合成及烯烃氢甲酰化反应研究

ML28-31 肼与羰基化合物的反应及其机理研究

ML28-32 离子液体条件下杂环化合物的合成研究

ML28-33 超声波辐射、离子液体以及无溶剂合成技术在有机化学反应中的应用研究

ML28-34 有机含氮小分子催化剂的设计、合成及在不对称反应中的应用

ML28-35 金属参与的不对称有机化学反应研究

ML28-36 黄酮及噻唑类衍生物的合成研究

ML28-37 钐试剂产生卡宾的新方法及其在有机合成中的应用

ML28-38 琥珀酸酯类内给电子体化合物的合成与性能研究

ML28-39 3-甲基-4-芳基-5-（2-吡啶基）-1，2，4-三唑铜（II）配合物的合成、晶体结构及表征

ML28-40 直接法合成二甲基二氯硅烷的实验研究

ML28-41 中性条件下傅氏烷基化反应的初步探索IIβ-溴代醚新合成方法的初步探索

ML28-42 几种氧化苦参jian类似物的合成

ML28-43 环丙烷和环丙烯类化合物的合成研究

ML28-44 基于甜菜碱的超分子设计与研究

ML28-45 新型C2轴对称缩醛化合物合成研究

ML28-46 环状酰亚胺光化学性质研究及消毒剂溴氯甘脲的制备

ML28-47 蛋白质吸附的分子动力学模拟

ML28-48 富硫功能化合物的分子设计与合成

ML28-49 ABEEM－σπ模型在Diels-Alder反应中的应用

ML28-50 快速确定丙氨酸-α-多肽构象稳定性的新方法

ML28-51 SmI2催化合成含氮杂环化合物的研究及负载化稀土催化剂的探索

ML28-52 新型金属卟啉化合物的合成及用作NO供体研究

ML28-53 磁性微球载体的合成及其对酶的固定化研究

ML28-54 甾体—核苷缀合物的合成及其性质研究

ML28-55 非键作用和库仑模型预测甘氨酸-α-多肽构象稳定性

ML28-56 多酸基有机-无机杂化材料的合成和结构表征

ML28-57 5-芳基-2-呋喃甲醛-N-芳氧乙酰腙类化合物的合成、表征及生物活性研究

ML28-58 氟喹诺酮类化合物的合成、表征及其生物活性研究

ML28-59 手性有机小分子催化剂催化的Baylis-Hillman反应和直接不对称Aldol反应

ML28-60 多核铁配合物通过水解途径识别蛋白质a螺旋

ML28-61 一种简洁地获取结构参数的方法及应用

ML28-62 水杨酸甲酯与硝酸钇的反应性研究及其应用

ML28-63 脯氨酸及其衍生物催化丙酮与醛的不对称直接羟醛缩合反应的量子化学研究

ML28-64 新型荧光分子材料的合成及其发光性能研究

ML28-65 枸橼酸西地那非中间体1-甲基-3-丙基-4-硝基吡唑-5-羧酸的合成研究

ML28-66 具有生物活性的含硅混合二烃基锡化合物的研究

ML28-67 直接法合成三乙氧基硅烷的研究

ML28-68 具有生物活性的含硅混合三烃基锡化合物的研究

ML28-69 过氧钒有机配合物的合成及其对水中有机污染物氧化降解的催化性能研究

ML28-70 查耳酮化合物的合成与晶体化学研究

ML28-71 二唑衍生物的合成研究

ML28-72 2-噻吩甲酸-2,2’-联吡啶二元、三元稀土配合物的合成、表征及光致发光

ML28-73 3’,5’-二硫代脱氧核苷的合成及其聚合性质的研究

ML28-74 β-烷硫基丁醇和丁硫醇类化合物及其衍生物的合成研究

ML28-75 新型功能性单体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵合成与研究

ML28-76 5-取代吲哚衍生物结构和性能的量子化学研究

ML28-77 新型水溶性手性胺膦配体的合成和在芳香酮不对称转移氢化中的应用

ML28-78 大豆分离蛋白的接枝改性及其溶液行为研究

ML28-79 N-（4-乙烯基苄基）-1-氮杂苯并-34-冠-11的合成和其自由基聚合反应的研究

ML28-80 稀土固体超强酸催化合成酰基二茂铁

ML28-81 硒（硫）杂环化合物与金属离子的合成与表征

ML28-82 新型二阶非线性光学发色团分子的设计、合成与性能研究

ML28-83 对△～4-烯-3-酮结构的甾体选择性脱氢生成△～（4，6）-二烯-3-酮结构的研究

ML28-84 对苯基苯甲酸稀土二元、三元配合物的合成、表征及荧光性能研究

ML28-85 D-π-A共轭结构有机分子的设计合成及理论研究

ML28-86 羧酸酯一步法嵌入式烷氧基化反应研究

ML28-87 分子内电荷转移化合物溶液及超微粒分散体系的光学性质研究

ML28-88 手性氨基烷基酚的合成

ML28-89 酪氨酸酶的模拟及酚的选择性邻羟化反应研究

ML28-90 单分子膜自组装结构与性质的研究

ML28-91 氯苯三价阳离子离解势能面的理论研究

ML28-92 香豆素类化合物的合成与晶体化学研究

ML28-93 离子液体的合成及离子液体中的不对称直接羟醛缩合反应研究

ML28-94 五元含氮杂环化合物的合成研究

ML28-95 ONOO～-对胰岛素的硝化和一些因素对硝化影响的体外研究

ML28-96 酶解多肽一级序列分析与反应过程建模及结构变化初探

ML28-97 一系列二茂铁二取代物的合成和表征

ML28-98 N2O4-N2O5-HNO3分析和相平衡及硝化环氧丙烷研究

ML28-99 光催化甲烷和二氧化碳直接合成乙酸的研究

ML28-100 N-取代-4-哌啶酮衍生物的合成研究

ML28-101 电子自旋标记方法对天青蛋白特征分析

ML28-102 材料中蛋白质含量测定及蛋白质模体分析

ML28-103 具有不同取代基的偶氮芳烃化合物的合成及其性能研究

ML28-104 非光气法合成六亚甲基二异氰酸酯（HDI）

ML28-105 邻苯二甲酸的溶解度测定及其神经网络模拟

ML28-106 甲壳多糖衍生物的合成及其应用研究

ML28-107 吲哚类化合物色谱容量因子构致关系ab initio方法研究

ML28-108 全氯代富勒烯碎片的亲核取代反应初探

ML28-109 自催化重组藻胆蛋白结构与功能的关系

ML28-110 二茂铁衍生的硫膦配体的合成及在喹啉不对称氢化中的应用

ML28-111 离子交换电色谱纯化蛋白质的研究

ML28-112 氨基酸五配位磷化合物的合成、反应机理及其性质研究

ML28-113 手性二茂铁配体的合成及其在碳—碳键形成反应中的应用研究

ML28-114 水溶性氨基卟啉和磺酸卟啉的合成研究

ML28-115 金属卟啉催化空气氧化对二甲苯制备对甲基苯甲酸和对苯二甲酸

ML28-116 简单金属卟啉催化空气氧化环己烷和环己酮制备己二酸的选择性研究

ML28-117 四苯基卟啉锌掺杂8-羟基喹啉铝与四苯基联苯二胺的电致发光性能研究

ML28-118 可降解聚乳酸/羟基磷灰石有机无机杂化材料的制备及性能研究

ML28-119 大豆分离蛋白接枝改性及应用研究

ML28-120 谷氨酸和丙氨酸在Al2O3上的吸附和热缩合机理的研究

ML28-121 常压非热平衡等离子体用于甲烷转化的研究

ML28-122 纳米管/纳米粒子杂化海藻酸凝胶固定化醇脱氢酶

ML28-123 蛋白质在晶体界面上吸附的分子动力学模拟

ML28-124 微乳条件下氨肟化反应的探索性研究

ML28-125 微波辅助串联Wittig和Diels-Alder反应的研究

ML28-126 谷氨酸和丙氨酸在Al2O3上的吸附和热缩合机理的研究

ML28-127 3-乙基-4-苯基-5-（2-吡啶基）-1，2，4-三唑配合物的合成、晶体结构及表征

ML28-128 水相中‘一锅法’Wittig反应的研究和手性P，O-配体的合成及其在不对称烯丙基烷基化反应中的应用

ML28-129 具有生物活性的1，2，4-恶二唑类衍生物的合成研究

ML28-130 树枝状分子复合二氧化硅载体的合成及其脂肪酶的固定化研究

ML28-131 PhSeCF2TMS的合成及转化

ML28-132 离子液体中脂肪酶催化（±）-薄荷醇拆分的研究

ML28-133 脂肪胺取代蒽醌衍生物及其前体化合物合成

ML28-134 萘酰亚胺类一氧化氮荧光探针的设计、合成及光谱研究

ML28-135 微波条件下哌啶催化合成取代的2-氨基-2-苯并吡喃的研究

ML28-136 镍催化的有机硼酸与α，β-不饱和羰基化合物的共轭加成反应研究

ML28-137 茚满二酮类光致变色化合物的制备与表征

ML28-138 新型手性螺环缩醛（酮）化合物的合成

ML28-139 芳醛的合成及凝胶因子的设计及合成

ML28-140 固定化酶柱与固定化菌体柱耦联—高效拆分乙酰-DL-蛋氨酸

ML28-141 苯酚和草酸二甲酯酯交换反应产品的减压歧化反应研究

ML28-142 有机物临界性质的定量构性研究

ML28-143 3-噻吩丙二酸的合成及卤代芳烃亲核取代反应

ML28-144 α，β-二芳基丙烯腈类发光材料的合成及发光性质的研究

ML28-145 L-乳醛参与的Wittig及Wittig-Horner反应立体选择性的研究

ML28-146 亚砜为催化剂和酰亚胺氯为氯化剂的醇的氯代反应的初步研究

ML28-147 功能性离子液的合成及在有机反应中的应用

ML28-148 DMSO催化三聚氯氰转化苄醇为苄氯的新反应的初步研究

ML28-149 气相色谱研究β-二酮酯化合物的互变异构

ML28-150 二元烃的混合物过热极限的测定与研究

ML28-151 芳杂环取代咪唑化合物的合成及洛汾碱类过氧化物化学发光性能测定

ML28-152 卤代苯基取代的咪唑衍生物的合成及其荧光性能的研究

ML28-153 取代并四苯衍生物的合成及其应用

ML28-154 苯乙炔基取代的杂环及稠环化合物的合成

ML28-155 吸收光谱在有机发光材料研发材料中的应用

ML28-156 水相中‘一锅法’Wittig反应的研究和手性P，O-配体的合成及其在不对称烯丙基烷基化反应中的应用

ML28-157 苯并噻吩-3-甲醛的合成研究

ML28-158 微波辅助串联Wittig和Diels-Alder反应的研究

ML28-159 超声辐射下过渡金属参与的药物合成反应研究

ML28-160 呋喃酮关键中间体—3，4-二羟基-2，5-己二酮的合成研究

ML28-161 树枝状分子复合二氧化硅载体的合成及其脂肪酶的固定化研究

ML28-162 吡咯双希夫碱及其配合物的制备与表征

ML28-163 负载型Lewis酸催化剂的制备及催化合成2，6-二甲基萘的研究

ML28-164 PhSeCF2TMS的合成及转化

ML28-165 纳米管/纳米粒子杂化海藻酸凝胶固定化醇脱氢酶

ML28-166 多取代β-CD衍生物的合成及其对苯环类客体分子识别

ML28-167 多取代_CD衍生物的合成及其对苯环类客体分子识别

ML28-168 柿子皮中类胡萝卜素化合物的分离鉴定及稳定性研究

ML28-169 毛细管电泳研究致癌物3-氯-1，2-丙二醇

ML28-170 超临界水氧化苯酚体系的分子动力学模拟

ML28-171 甲烷和丙烷无氧芳构化反应研究

ML28-172 2-取代咪唑配合物的合成、晶体结构及表征

ML28-173 气相色谱研究β-二酮酯化合物的互变异构

ML28-174 DMSO催化三聚氯氰转化苄醇为苄氯的新反应的初步研究

ML28-175 二元烃的混合物过热极限的测定与研究

ML28-176 氨基酸在多羟基化合物溶液中的热力学研究

ML28-177 分子印迹膜分离水溶液中苯丙氨酸异构体研究

ML28-178 杯[4]芳烃酯的合成及中性条件下对醇的酯化反应研究

ML28-179 亚砜为催化剂和酰亚胺氯为氯化剂的醇的氯代反应的初步研究

ML28-180 双氨基甲酸酯化合物的合成及分子自组装研究

ML28-181 由芳基甲基酮合成对应的半缩水合物的新方法

ML28-182 取代芳烃的选择性卤代反应研究

ML28-183 吡啶脲基化合物的合成、分子识别及配位化学研究

ML28-184 丙烯（氨）氧化原位漫反射红外光谱研究

ML28-185 嘧啶苄胺二苯醚类先导结构的发现和氢化铝锂驱动下邻位嘧啶参与的苯甲酰胺还原重排反应的机理研究

ML28-186 酰化酶催化的Markovnikov加成与氮杂环衍生物的合成

ML28-187 多组分反应合成嗪及噻嗪类化合物的研究

ML28-188 脂肪酶构象刻录及催化能力考察

ML28-189 L-乳醛参与的Wittig及Wittig-Horner反应立体选择性的研究

ML28-190 烯基铟化合物与高碘盐偶联反应的研究及其在有机合成中的应用

ML28-191 α，β-二芳基丙烯腈类发光材料的合成及发光性质的研究

ML28-192 邻甲苯胺的电子转移机理及组分协同效应研究

ML28-193 负载型非晶态Ni-B及Ni-B-Mo合金催化剂催化糠醛液相加氢制糠醇的研究

ML28-194 含吡啶环套索冠醚及配合物的合成与性能研究

ML28-195 芳烃侧链分子氧选择性氧化反应研究

ML28-196 多组分复合氧化物对异丁烯制甲基丙烯醛氧化反应的催化性能研究

ML28-197 多孔甲酸盐[M3（HCOO）6]及其客体包合物的合成、结构和性质

ML28-198 纳米修饰电极的制备及其应用于蛋白质电化学的研究

ML28-199 对于几种蛋白质模型分子的焓相互作用的研究

ML28-200 氨基酸、酰胺、多羟基醇化合物相互作用的热力学研究

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