DNA分离中为什么要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次

苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

使用苯酚抽提细胞 DNA 时,苯酚的作用是使蛋白质变性,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而 DNA 溶于水相.

氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组 DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡 产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS（十二烷基磺酸钠）将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。

DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。

离心后有机溶剂在试管底层（有机相），DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚–氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

通常，氯仿与异戊基发酵的比例为24：1。 苯酚，氯仿和异戊醇的比例也可以按25：24：1的比例使用。

提取DNA时，为了均匀混合，必须将容器摇动几次，并且在混合溶液中容易产生气泡，并且气泡会阻止相互作用。 异戊醇的添加降低了分子的表面张力，因此减少了萃取过程中泡沫的产生。

酚:氯仿:异戊醇试剂是由水饱和酚、氯仿和异戊醇按125:24:1 的体积比混合而成的，主要用于RNA的提取等试验。苯酚使蛋白质变性，同时抑制了 RNase 的降解作用。

氯仿抽提加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。异戊醇减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。使用酚：氯仿：异戊醇抽提离心后的上层为含 RNA 的水相、中间为变性蛋白与 DNA，下层为有机溶剂相。静置后产品有分层现象，使用时将产品摇匀后用移液器吸取即可。

注意事项：酚:氯仿:异戊醇试剂有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤接触或吸入体内。如发现变为红色或棕色，表明已发生氧化，不能继续使用。

参考资料来源：百度百科-苯酚

参考资料来源：百度百科-氯仿

参考资料来源：百度百科-异戊醇

早上好，如果是苯酚的氯仿溶液不慎接触到皮肤上，可以尽快使用弱碱性如碳酸钠水溶液进行冲洗，高浓度的苯酚对皮肤有强烈的腐蚀能力，也可以用稀释至15%的DMF水溶液或者30%尿素水溶液来清洗，以尽快中和其酸性环境。请参考。如果确实已经造成了化学性损伤，尽快就医，使用医用尿素软膏或者皮炎平等碱性药膏对患部进行治疗。苯酚最大的问题是它的冷水水溶性极差，会随氯仿渗透进皮肤深层还原为晶体造成二次腐蚀，如果皮下组织被破坏了那里就永远恢复不过来了。

下午好，苯酚的液体和固体形式转变只受到周围环境温度条件影响是一种物理现象，其他比如乙酸、月桂酸和DMSO等化合物也有这种温差变化，是否去除水分和苯酚能否结晶并没有直接关系请参考。苯酚由液体变成固体是低温凝固造成的。

质粒基因组DNA提取与其他生物基因组DNA提取有主要的异同。

质粒DNA提取一般用沸水浴法和碱裂解法,现在一般都采用碱裂解法,并有试剂盒可用,它主要是将细胞内的环状质粒提取出来,一般需要用SDS裂解,RNA酶降解,然后过柱,再进行洗脱.过程比较简单。

而基因组DNA提取则较为复杂,也需要用SDS裂解和RND酶降解,但降解时间较长。

同时对有些革兰氏阳性细菌还要进行溶菌酶处理,最后用氯仿-苯酚进行除蛋白,这一步重复进行多次,在用氯仿除去多余的苯酚,用乙醇清洗烘干后溶于TE缓冲液中,整个过程比提质粒更复杂,耗时也更多。

扩展资料

DNA中的核苷酸中碱基的排列顺序构成了遗传信息。该遗传信息可以通过转录过程形成RNA，然后其中的mRNA通过翻译产生多肽，形成蛋白质。

在细胞分裂之前，DNA复制过程复制了遗传信息，这避免了在不同细胞世代之间的转变中遗传信息的丢失。

在真核生物中，DNA存在于细胞核内称为染色体的结构中。在没有细胞核的其它生物中，DNA要么存在于染色体中要么存在于其它组织（细菌有单环双链DNA分子，而病毒有DNA或RNA基因组）。

在染色体中，染色质蛋白如组蛋白、共存蛋白和凝聚蛋白将DNA在一个有序的结构中。这些结构指导遗传密码和负责转录的蛋白质之间的相互作用，有助于控制基因的转录。

参考资料来源：百度百科-质粒

用氢氧化钠溶液洗涤苯，因苯酚有酸性可与氢氧化钠反应得到溶于水而不溶于苯的苯酚钠，而可以将苯酚除去。

苯酚：又名石炭酸、羟基苯，是最简单的酚类有机物，一种弱酸。常温下为一种无色晶体，有毒。苯酚是一种常见的化学品，是生产某些树脂、杀菌剂、防腐剂以及药物的重要原料。苯酚有腐蚀性，常温下微溶于水，易溶于有机溶液；当温度高于65摄氏度时，能跟水以任意比例互溶。其溶液沾到皮肤上可用酒精洗涤，苯酚暴露在空气中呈粉红色。

苯：在常温下为一种高度易燃，有香味的无色的液体，为一种有机化合物，也是组成结构最简单的芳香烃。苯有高的毒性，也是一种致癌物质。它难溶于水，易溶于有机溶剂，本身也可作为有机溶剂。苯也是石油化工的基本原料，苯的产量和生产的技术水平是一个国家石油化工发展水平的标志之一。

酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性

蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层.

作

为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水想有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了

这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA.所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好.经酚第一次抽

提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走.也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用.

酚－氯仿方法是提取核酸的经典方法，主要原理是利用核酸、蛋白等杂质在水相和有机相中溶解度不同而重新分配。

试剂盒原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质（一般是硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中。

酚氯仿方法经典、便宜，用的都是实验室常用试剂，提纯效率和纯度都很高，但缺点是费时费力，苯酚和氯仿还有一定毒性，我见过的实验室很少有用这种方法的。

试剂盒严格来说也分好多种，经典的是离心柱的，就是把硅胶膜固定在离心管中，类似于超滤膜，用离心力或者负压让液体通过硅胶膜，核酸就留在膜上。在经过洗涤、洗脱的步骤得到核酸。这种方法的优点是操作简单、时间短，现在也能达到很高的质量，价格也不贵。缺点是不易放大，需要多次离心。

试剂盒基本步骤是先使样本裂解，在特定溶液中通过离心流过硅胶膜，再经过几次洗涤，最后加上洗脱液，离心后核酸就溶解到洗脱液中。具体的你可以根据你自己的需要到网上查一下说明书，现在做试剂盒公司的很多，步骤大同小异。

试剂盒也不是一定很便宜，对一些难度高（病毒核酸、法医样本核酸）或者要求高（去内毒素）的用途也比较贵。还有一种磁珠法提取，不需要离心，易于放大，可以用于自动化操作。这种高端一点的产品基本上是外国公司垄断的。

国内也有一批人在做这种磁珠，希望能打破这种垄断。上海交大的古宏晨教授和他创立的上海奥润微纳就是这批人的代表。（有点打广告的嫌疑，看在码了这么多字的份上也可以理解哈）

核酸提取试剂盒的学问很多，有兴趣的话还可以再交流。：）