谁知道硫酸咔唑法的具体操作步骤?望高手不吝赐教.
1 材料与仪器
0.1% 咔唑试液(50 mg咔唑溶于50 mL 95%乙醇)，葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、果糖(Fru)均为化学纯，枸杞多糖样品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2，LbP3由本课题组提供。722分光光度计。
2 方法与结果
2.1 常用的硫酸-咔唑法
2.1.1 标准曲线绘制：精确称取干燥的单糖标准样品10 mg，定容于25 mL容量瓶中。然后准确量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL单糖标准溶液于带塞试管中，各管加水至1 mL。在冰水浴中向各管加入6 mL浓硫酸，摇匀后，改在85 ℃水浴中保持20 min，取出后冷至室温，各管加0.2 mL咔唑液，在室温下保持2 h，测定吸收度(530 nm)，以浓度对吸收度作标准曲线。
2.1.2 测定各单糖在530 nm处的检测响应：分别准确吸取各种单糖溶液(10 mg/25 mL)0.4 mL，补水至1 mL用2.1.1项下方法测得其吸收值，结果如表1。
表1 咔唑法测定时各单糖在530 nm处的吸收值
Gal Glc Man Xyl Ara Rha Fru GalA GlcA
0.0493 0.1018 0.0503 0.0840 0.0251 0.0140 0.1245 0.2603 0.2498
上述结果表明，用咔唑法测定时，天然多糖化合物中常见的各种中性单糖在530 nm处也均有程度不同的吸收。
2.2 各单糖浓度与咔唑法测定时在530 nm处吸收值的线性关系：以常用咔唑法(参考2.1.1)测定各单糖吸收标准曲线(其中GalA和GlcA标准溶液的配制为精确称取干燥的糖醛酸10 mg溶于100 mL容量瓶)，其线性回归方程及相关系数如下。
Glc Y=0.4631X+0.004939(r=0.9996)
Gal Y=0.2358X+0.004567(r=0.9993)
Man Y=0.1587X+0.002963(r=0.9998)
Xyl Y=0.2559X+0.000884(r=0.9997)
Fru Y=0.1727X+0.001872(r=0.9960)
Rha 吸收值基本保持不变
GalA Y=0.5857X+0.005917(r=0.9998)
GlcA Y=0.4264X+0.000601(r=0.9999)
上述结果可知，各中性单糖在0.04～0.32 mg/mL范围内、GalA和GlcA在0.01～0.08 mg/mL范围内各单糖浓度与咔唑法检测吸收值呈线性。
2.3 定量考察各中性单糖对咔唑法测定糖醛酸含量的影响
2.3.1 分别准确量取GalA和GlcA(10 mg/100 mL)0.4 mL，各加入0.0，0.4，0.6 mL各中性单糖溶液(10 mg/25 mL)，分别补水至1 mL，按咔唑法测其吸收值。
2.3.2 分别准确量取各中性单糖溶液(10 mg/25 mL)0.0，0.4，0.6 mL，分别补水至1 mL，按咔唑法测其吸收值。得数据如表2。
表2 各种中性单糖对糖醛酸影响的定量考察结果
A530 加入标准中性糖体积(mL) A530 加入标准中性糖体积(mL)
0.0 0.4 0.6 0.0 0.4 0.6
GalA+Glc 0.2738 0.3732 0.3920 GlcA+Glc 0.2438 0.3506 0.4043
Glc 0.0000 0.1017 0.1377 Glc 0.0000 0.1183 0.1741
(GalA+Glc)Glc 0.2738 0.2715 0.2543 (GlcA+Glc)Glc 0.2438 0.2323 0.2302
GalA+Gal 0.2549 0.3059 0.3495 GlcA+Ga1 0.2603 0.3143 0.3406
Gal 0.0000 0.0513 .0914 Gal 0.0000 0.0473 0.1051
(GalA+Gal)Gal 0.2549 0.2546 0.2584 (GlcA+Gal)Gal 0.2603 0.2670 0.2355
GalA+Man 0.2636 0.3152 0.3100 GlcA+Man 0.2403 0.3050 0.3101
Man 0.0000 0.0463 0.0552 Man 0.0000 0.0533 0.0854
(GalA+Man)Man 0.2636 0.2636 0.2548 (GlcA+Man)Man 0.2403 0.2517 0.2247
GalA+Xyl 0.2692 0.3455 0.3837 GlcA+Xyl 0.2600 0.3432 0.3710
Xyl 0.0000 0.0759 0.1275 Xyl 0.0000 0.084 0.1072
(GalA+Xyl)Xyl 0.2692 0.6296 0.2562 (GlcA+Xyl)Xyl 0.2600 0.2592 0.2638
GalA+Rha 0.2218 0.2400 0.2223 GlcA+Rha 0.2204 0.2370 0.2215
Rha 0.0000 0.0090 0.0170 Rha 0.0000 0.0100 0.0120
(GalA+Rha)Rha 0.2218 0.2310 0.2063 (GlcA+Rha)Rha 0.2204 0.2270 0.2095
GalA+Fru 0.2444 0.3721 0.4432 GlcA+Fru 0.2204 0.3585 0.4335
Fru 0.0000 0.1345 0.2191 Fru 0.0000 0.1103 0.2097
(GalA+Fru)Fru 0.2444 0.2376 0.2241 (GlcA+Fru)Fru 0.2204 0.2482 0.2338
GalA+Ara 0.2551 0.2678 0.3125 GlcA+Ara 0.2360 0.2619 0.28885
Ara 0.0000 0.0072 0.0539 Ara 0.0000 0.0254 0.0558
(GalA+Ara)Ara 0.2551 0.2606 0.2586 (GlcA+Ara)Ara 0.2360 0.2365 0.2327
上述实验结果表明样品的吸收值随中性糖的含量增加而增大(Rha除外)，而样品吸收值与中性糖吸收值之差和糖醛酸的吸收值基本一致。
2.4 改进的硫酸-咔唑法：根据2.3的实验结果，我们提出一种改进的硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量的方法，即样品的吸收值减去中性糖的吸收值为样品的吸收值。
2.4.1 标准溶液的配制
溶液1.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.2 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
溶液2.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.4 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
溶液3.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.6 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
中性单糖溶液.量取0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
2.4.2 方法改进前后糖醛酸测定结果的比较：上述中性单糖溶液按咔唑法测定在530 nm处的吸收值为0.0442。
表3所列结果表明，改进的咔唑法所测得的标准溶液中糖醛酸吸收值与实际测定值基本一致，因此这种改进的硫酸-咔唑法在测定各种样品中糖醛酸的含量时，排除了样品中中性糖对测定的影响，因而要比常用的硫酸-咔唑法准确。
表3 不同方法的糖醛酸测定结果
溶液1 溶液2 溶液3
咔唑法测定值 0.1497 0.2482 0.3628
改良咔唑法测定值 0.1055 0.2040 0.3186
糖醛酸实际值 0.1092 0.2058 0.3207
注：改进的咔唑法测定值为常用咔唑法测定值与标准配制溶液中中性单糖吸收值(0.0442)之差。
2.5 改进的咔唑法测定糖醛酸实例：从枸杞子中分离得到的多糖样品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2和LbP3中的糖醛酸含量测定，具体操作如下：
2.5.1 样品中中性糖吸收值的测定：要求得样品中中性糖对检测的吸收干扰值，首先必须知道其中中性糖的含量和组成比。根据蒽酮-硫酸法〔4〕可测得中性糖的含量。组成比的测定需先将样品全水解〔5〕，然后再用HPLC或GC测得样品中各中性单糖的组成比。以此称取各种相应标准中性单糖配成混合液，然后取1 mL溶液于带塞试管中，然后按2.1.1所述的标准曲线制备操作，测得其吸收值。
2.5.2 样品的吸收值测定：按咔唑法(方法同2.1.1)，测得样品吸收值(注：样品中中性糖浓度应在其线性范围内)。
2.5.3 样品中糖醛酸含量的测定：样品中糖醛酸的吸收值为样品吸收值与中性糖吸收值之差，再根据对应标准的回归方程，计算出该样品中糖醛酸含量。实验结果如表4所示。
表4 常用的与改进的咔唑法测定糖醛酸含量结果的比较
糖醛酸含量(%)
多糖样品 常用咔唑法 改进咔唑法
LbGP3 5.3 3.4
LbGP4 10.4 6.4
LbP1 8.8 5.9
LbP2 8.1 6.7
LbP3 8.7 5.7
从表4结果可以看出常用咔唑法测定糖醛酸的含量其值偏高。
3 讨论
在咔唑法所规定的测定波长下，中性戊糖和中性己糖均有吸收，影响糖醛酸含量测定的准确性。为此我们对7种不同的中性糖分别进行了考察，测得其浓度与吸收值的线性范围。实验结果表明Xyl，Man，Glc，Gal，Fru分别找到了各自的线性范围，Rha随着浓度的改变其吸收值基本保持不变，Ara较难判断。各种单糖线性范围的测得，不仅证实了中性糖的存在对咔唑法测定糖醛酸的结果产生干扰，而且为提出一种比常用咔唑法准确性高的糖醛酸测定方法提供了实验依据。
用咔唑法测定各种中性单糖对糖醛酸影响的定量考察实验表明，糖醛酸和各中性单糖在其各自的线性范围内取样，样品的吸收值与中性糖吸收值之差与不含中性糖的糖醛酸实际测得吸收值基本一致。
就知道这么多了
查看文献和资料，加上自己的理解，觉得原理可能是：葡萄糖醛酸在浓硫酸的作用下水解成带
-COOH的糠醛或糠醛衍生物，而与咔唑发生缩合反应生成紫红色的化合物，该类化合物一般在～ 530nm处有吸收，其浓度与吸光度成正比关系，通过A-C曲线即可求出相应的含量了。
1、将葡萄糖和GA配成一系列混合糖，比较硫酸咔唑法和间羟联苯法测定GA含量的准确度；
2、分别建立葡萄糖和GA对硫酸蒽酮的标准曲线以扣除GA对中性糖测定的干扰。
结果：
1、葡萄糖的存在对用硫酸咔唑法测定GA有干扰，而用间羟联苯法测定几无干扰；
2、GA的存在对用硫酸蒽酮法测定中性糖有一定干扰。
结论：
应采用间羟联苯法测定酸性多糖中的GA含量，同时扣除GA在硫酸蒽酮法中的干扰以得到中性糖的含量。
世界上90%的咔唑是从煤焦油中得到的 ；也可由邻氨基联苯合成，然后用二甲苯重结晶精制。
（1）合成法：以邻氨基二苯胺为原料，经亚硝酸处理，制得1-苯基-1，2，3-苯并三唑，加热后，失去氮而生成咔唑。
（2）硫酸法：将粗蒽用氯苯或其他溶剂溶解，粗蒽中的菲、芴等物质因不溶解而和蒽、咔唑分开，将蒽和咔唑加入硫酸中进行反应，咔唑则与硫酸形成硫酸咔唑而和蒽分开，将硫酸咔唑水解后，经过滤、烘干即得成品。
（3）溶剂-精馏法：将粗蒽用炼焦副产重苯（160~200℃）馏分溶解，粗蒽中的菲、芴等物质和蒽、咔唑分开，将蒽和咔唑在精馏塔中进行高温精馏，经一次精馏，可得含咔唑85%~90%的产品，收率65% 。
硫酸法：将粗蒽用氯苯或其他溶剂溶解，粗蒽中的菲、芴等物质因不溶解而和蒽、咔唑分开，将蒽和咔唑加入硫酸中进行反应，咔唑则与硫酸形成硫酸咔唑而和蒽分开，将硫酸咔唑水解后，经过滤、烘干即得成品。
所以C是硫酸铜
无色气体里，氢气、氧气、氨、氮氧化物等都不可能
只有可能是二氧化碳和二氧化硫
最有可能是二氧化碳，那么A就是碱式碳酸铜
下面将简单介绍化学方法和物理分析方法。⑴化学方法测定多糖结构还是目前最常用的方法，测定的手段很多，其中经典而有效的是甲基化分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解以及乙酰解和甲醇解等。① 乙酰解：多糖的乙酰解反应是在由乙酸酐、乙酸和硫酸组成的混合液中加热进行的，在一定的糖苷键处裂解。研究表明，相同糖苷键在酸水解和乙酰解中的速度是不同的。乙酰解是酸水解的一种有用的补充，多糖可从这两种不同的方法中获得不同的片段，从不同的角度获得多糖的结构信息。甲醇解：多糖在80-100℃条件下与无水甲醇氯化氢反应能将多糖变成组成单糖的甲基糖苷，这些甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，然后进行GC分析并与标准单糖对照，可得到组成多糖的各单糖的定量数据。⑵物理分析法 ①IR法：IR在多糖结构分析上主要是确定吡喃糖的苷键构型，以及常规观察其他官能团。一般主要观察730-960cm-1的范围，如对于α-吡喃糖，δC1-H在 845 cm-1，而β-吡喃糖，δC1-H在890cm-1有最大吸收峰。②MS、GC-MS：GC分析多糖虽受样品挥发性和热稳定性的限制，但GC-MS是多糖结构分析不可缺少的工具，特别是对水解单糖、甲基化单糖及甲基化寡糖的分析，而且能鉴别出糖的异构体。MS在多糖结构分析中不仅在鉴别各种甲基衍生物的碎片，确定各种单糖残基的连接位置时必不可少，而且由于FAB-MS、ESI-MS和 MALDI-MS等技术的出现，利用质谱还可以测定多糖的分子量及一级结构。③NMR：用NMR技术研究多糖结构的一个特点是不破坏样品，对多糖的结构特征可通过化学位移、偶合常数、积分面积、NOE及驰豫时间等参数来表达。一维、二维图谱 NMR在分析糖的构型、相互连接的位置及顺序等方面具有广阔的应用前景。2、分子量及分子量分布多糖具有分子大小不均一的特点，近年来发现这些生物大分子的某一分子量范围成分具有药理活性，而另一分子量范围的成分不具有药理活性或具有一定的毒副作用，因此分子量及其分布既是这类药物的有效性控制的指标又是安全性控制的指标，质量标准中制订该项检查十分必要，这也是近年来大分子聚合物药物质量标准发展的一个明显的特点。多糖分子量只是代表相似链长的平均配布，不同方法所测得的分子量不同，即使是同一多糖，其重均分子量与数均分子量也相差较大，通常采用凝胶色谱法控制这类药物的分子量及其分布，应经研究选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂；使用的流动相通常为水或缓冲液，其pH值不应超过填充剂的耐受范围，可加入适量的有机溶剂，但浓度不应超过30%，流速以 0.5-1.0ml/min为宜，因这类分子多无紫外吸收，一般采用示差折光检测器，选用对照品的分子量范围及颗粒形状应与供试品匹配，测定数据经适宜的GPC软件处理求得相关参数。3、含量测定一般来讲，多糖不含蛋白和氨基酸，蛋白或氨基酸检测应呈阴性或符合限度检查要求，如为糖蛋白或糖肽，应提供其证据，以保证产品不是多糖与蛋白的混合物；并提供其氨基酸构成及蛋白含量范围，以保证质量稳定可控。对从天然植物中得到的多糖，在结构研究中尤其对糖组成分析，确定其中是否含有糖醛酸残基具有很重要的意义。糖醛酸的含量测定目前较常用的是硫酸咔唑法，但容易受中性糖残基的干扰。为了消除测定的干扰，可先测定样品中中性糖的吸收度，然后从样品的吸收度减去中性糖的吸收度，即为样品中糖醛酸的吸收度值。间羟基联苯法也是一种常用的多糖中糖醛酸含量测定方法，该法较硫酸咔唑法受中性糖残基的干扰更小。多糖的含量测定可分为两大类：一类是直接测定多糖本身，如高效液相色谱法和酶法；另一类是利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。前者需要多糖的纯品和特定的酶，后者测定时方法学干扰较大，现有的比色重现性差，受影响因素多。但由于目前国内的实验条件，多糖的含量仍然主要采用这种方法，其原理为：多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量，所用的单糖对照品尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖，这样测得的值较准确。需要强调的是，这种方法所测定的是总糖的含量而不是总多糖的含量，因此首先应测定样品中游离的单糖含量，然后将总糖的含量减去游离单糖的含量，即为总多糖的含量。另外还可以采用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法），它是在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可消除还原性杂质的干扰。
