沉淀法是溶胶的纯化方法吗

病毒为什么一定要纯化？

（1）病毒培养液中含有大量杂质，包括缺损颗粒、病毒外壳、细胞毒素、培养基、血清以及细胞碎片等，这些杂质若被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应；

（2）纯化有利于病毒悬浮于体内注射的缓冲液中。

病毒纯化的原则： 以保持病毒的生物活性和感染性为前提，去除非病毒杂质，提取出高纯度的病毒。

病毒纯化方法

1. 超过滤法： 利用超滤膜将水、盐和小分子滤除，将大分子或病毒等颗粒截留，从而达到纯化的目的，该方法主要用于大容量病毒样品的浓缩，且回收率高。常用的超滤膜是硝酸纤维素滤膜。

注意：超滤膜孔径一定要比病毒颗粒小，且只能去除比病毒小的细胞碎块

2. 吸附法： 利用病毒颗粒或杂质的表面离子与吸附剂之间的亲和作用，将病毒或杂质吸附后，用一定的盐溶液将病毒或杂质洗脱下来。常用的吸附剂有红细胞、磷酸钙、离子交换树脂等。

注意：吸附剂应有较大的表面积和吸附能力，性质稳定并便于洗脱

3. 层析法： 利用物质中各组分的理化性质差异，使各组分在固定相和流动相中的分布程度和移动速度不同，从而达到分离的目的。常用的层析法有凝胶层析法、离子交换层析法和亲和层析法。

（1）凝胶层析法：样品流经具有一定孔径大小的多孔葡聚糖凝胶时，各组分按分子的大小不同而被分离。常用的凝胶有磷酸钙凝胶、氢氧化锌凝胶和焦磷酸镁凝胶。

（2）离子交换层析法：在一定pH条件下，利用病毒颗粒所带电荷不同实现分离。适用于所有带电荷的样品的分离纯化。

（3）亲和层析法：利用样品与基质之间的特异性亲和力，实现分离。适用于纯化生物大分子。

4. 离心法： 根据物质的沉降系数或浮力密度的不同，利用离心力将物质分离纯化。常用于病毒纯化的方法有差速离心法和密度梯度离心法。

（1）差速离心法： 利用不同大小和比重的粒子的沉降速度不同，去除宿主细胞碎片等杂质，最后使病毒沉淀。该方法能迅速处理大量样品。

（2）密度梯度离心： 利用超速离心，将病毒颗粒分配到密度梯度介质中相等密度层中，吸出目的颗粒所在介质层，即可到达分离纯化的目的。常用的介质有氯化铯和蔗糖。

5. 沉淀法： 利用悬浮液中的病毒颗粒在重力作用下产生沉降作用，达到分离纯化的目的。用于病毒纯化的方法有聚乙二醇（PEG）沉淀法、等电点沉淀法和中性盐沉淀法等。

（1）聚乙二醇（PEG）沉淀法： 利用聚乙二醇与病毒颗粒形成多聚体，再离心即可沉淀。

（2）等电点沉淀法： 利用病毒粒子在等电点时，所携带的正负电荷相等，分子间相互作用减弱，溶解度降低，从而发生沉淀。

（3）中性盐沉淀法： 利用高浓度的中性盐使物质的溶解度降低，从而发生沉淀。

6. 电泳法： 利用病毒带电粒子在电场作用下，向着与电性相反的电极的移动速度不同，将组分分离成狭窄的区带，最后收集病毒区带部分。

固体从液体中析出,叫做沉淀.乙二醇是液体,谈不上沉淀不沉淀.乙二醇加入水中会降低水的凝固点,比如纯水的冰点是零度,加入乙二醇之后,冰点下降.比如含量50%的乙二醇水溶液,冰点下降到-35度.这就是水中加乙二醇可以作为防冻液的原因.温度低于冰点,乙二醇水溶液会凝固.

蛋白浓缩方法基本有： 丙酮沉淀法；免疫沉淀法；三氯醋酸沉淀法；硫酸铵沉淀法；（低温）有机溶剂沉淀法；聚乙二醇沉淀法；超滤法；透析法；离子交换层析和冷冻干燥法…… 1.丙酮沉淀法；三氯醋酸沉淀法 试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。 2.免疫沉淀法：得有特异性抗体！ 3.硫酸铵沉淀法：利用高浓度盐将蛋白质析出（盐析），选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济！ 4.（低温）有机溶剂沉淀法：强调低温（0-4度以下）是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性，可用乙醇，丙酮……注意：Mg2+离子，pH值 5.聚乙二醇沉淀法：使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性！他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀！ 6.超滤法：主要针对小体积蛋白质溶液（几ml）此法更不易引起变性！不过得有浓缩器，不是哪个实验室都有的！ 7.透析法：主要用于更换蛋白质的缓冲液！的有透析袋！不需要特殊的仪器！ 8.离子交换层析：可用阴离子交换树脂进行浓缩！ 9.冷冻干燥法：在冷冻状态下让扬品种的液体升华 参考网址on http://www.bio1000.com/experiment/biochemical/351804.html

固体从液体中析出，叫做沉淀。乙二醇是液体，谈不上沉淀不沉淀。乙二醇加入水中会降低水的凝固点，比如纯水的冰点是零度，加入乙二醇之后，冰点下降。比如含量50%的乙二醇水溶液，冰点下降到-35度。这就是水中加乙二醇可以作为

防冻液

的原因。温度低于冰点，乙二醇水溶液会凝固。

甲苯回流除水，如果有条件，可以用索式提取仪。把聚乙二醇溶于甲苯中，回流除水，然后把产品用乙醚沉淀，真空干燥。 这个方法可行，是利用共沸除水的，温度大约在130°左右能蒸出来，但是甲苯和水的共沸点只有七十几度，因此为什么这么高的温度我不清楚

(一)液相放射免疫测定

1．抗原一抗体反应

将抗原(标准品和受检标本)、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定温度下反应一定时间，使竞争抑制反应达到平衡。不同质量的抗体和不同含量的抗原对温育的温度和时间有不同的要求。

2．B、F分离技术

在RIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量极微，形成的结合态标记抗原(B)不能自行沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标记抗原(F)的分离。另外对小分子量的抗原也可采取吸附法使B与F分离。

(1)第二抗体沉淀法 这是RIA中最常用的一种沉淀方法。将产生特异性抗体(第一抗体)的动物(例如兔)的IgG，制得羊抗兔IgG血清(第二抗体)。由于在本反应系统中采用第一、第二两种抗体，故称为双抗体法。在抗原与特异性抗体反应后加入第二抗体，形成由抗原一第一抗体一第二抗体组成的双抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低，其复合物也极少，无法进行离心分离，为此在分离时加入一定量的与第一抗体同种动物的血清或Ig，使之与第二抗体形成可见的沉淀物。与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。经离心即可使含有结合态标记抗原(B)的沉淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原(F)分离。

(2)聚乙二醇(PEG)沉淀法 最近各种RIA反应系统逐渐采用了PEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。PE(；沉淀剂的主要优点是制备方便，沉淀完全。缺点是非特异性结合率比用第二抗体高，且温度高于30~C：时沉淀物容易复溶。

此外，B、F分离技术还有PR试剂法和活性炭吸附法等。．

3．放射性强度的测定

B、F分离后，即可进行放射性强度的测定。测量仪器有两类，即液体闪烁计数仪和晶体闪烁计数仪。

计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm(计数／min)，也可用cps(计数／s)表示。如果知道这个测量系统的效率，还可算出放射源的强度，即dpm(衰变／min)或dps(衰变／s)。

每次测定均需作标准曲线图，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图。放射性强度可任选B或F，也可用计算值B／(B+F)、B／F和B／B0。标本应作双份测定，取其平均值，在制作的标准曲线上查出相应的受检抗原浓度。

(二)固相放射免疫测定方法(以双层非竞争法为例)

1．抗体的包被

先将抗体吸附于固相载体表面，制成免疫吸附剂。常用的固相载体为聚苯乙烯，形状有管、微管、小圆片、扁圆片和微球等。还可根据自己的工作设计新的形状，以适应特殊的需要。

2．抗原抗体反应

免疫吸附剂与标本一起温育时，标本中的抗原与固相载体上的抗体发生免疫反应。当加入标记的抗体后，由于抗原有多个结合点，又同标记抗体结合，最终在固相载体表面形成抗体一抗原一标记抗体免疫复合物。

3．B、F分离

用缓冲液洗涤除去游离的标记抗体，使B、F分离。

4．放射性强度的测定

测定固相所带的放射性计数率(cpm)：设样品cpm值为P，阴性对照标本cpm值为N，P／N≥2．1为阳性反应。标本中的抗原越多，最终结合到固相载体上的标记抗体越多，其pm值也就越大；反之则小。当标本中不存在抗原时；其cpm值应接近于仪器的本底计数。

蛋白质分离鉴定的常用方法：

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沉淀法

沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。

1、盐析法

盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。

3、蛋白质沉淀剂

蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

5、选择性沉淀法

根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。

吸附层析

1、吸附柱层析

吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

2、薄层层析

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。

3、聚酰胺薄膜层析

聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。

离子交换层析

离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。

凝胶过滤

凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

糖链抗原72-4——检查细节、注意事项、步骤、结果解读

糖链抗原72-4——检查项目的不适宜人群：

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糖链抗原72-4——检查项目的注意细节：

CA72-4对诊断胃癌的特异性优于糖链抗原19-9和CEA。

糖链抗原72-4——检查项目的一般步骤：

本法分三个步骤，即抗原与抗体反应、B和F分离和放射性测定。

（1）抗原与抗体反应：将标本（非标记抗原）、标记抗原和抗血清顺序定量加入小试管内，置室温（15～30℃）作用24h，使其充分竞争结合。

（2）B、F分离：分离技术多种多样，常用沉淀法。①第二抗体沉淀法：又称双抗体法，在受检抗原与第一抗体特异性反应后加入相应的第二抗体，使形成的抗原-第一抗体-第二抗体的复合物共沉，一经离心即可使结合标记抗原B与游离抗原F分离。本法是特异性沉淀，分离完全，非特异性结合力低。但第二抗体用量较大，成本较高。此外血清浓度、抗凝剂的有无因素可在一定程度上影响结果。②聚乙二醇（PEG）沉淀法：使蛋白质处于等电点状态，水化层破坏而导致蛋白质沉淀。本法优点是PEG制备方便、价廉、分离快速，缺点是非特异沉淀物较多，分离不完全。③第二抗体-聚乙二醇沉淀法：本法既有PEG法的快速沉淀优点，且保持第二抗体特异性沉淀的作用，又减少第二抗体用量，并降低PEG浓度，使非特异沉淀物减少。④活性炭吸附法：利用活性炭表面活性将小分子的游离部分吸附。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖，使它表面具有一定孔径的网眼，从而允许小分子游离抗原或半抗原逸入而被吸附，而大分子复合物则被排斥在外。在抗原与抗体反应后，加入葡聚糖-活性炭，放置5～10min，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。

（3）放射性强度测定：B和F分离后，即可测定其放射性强度。测量仪器有两类：液体闪烁计数仪（测β射线）和晶体闪烁计数仪（测γ射线）。计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm（脉冲数/min）。

每次测定均需作一标准曲线图，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以测到的相应放射性强度为纵坐标作图。放射性强度可任选B或F，亦可采用计算值B/B＋F、B/F或B/B0。标本应作双份测定，取其平均值，在标准曲线上查出相应的受检抗原浓度。