如何鉴别对甲苯胺、N-甲基苯胺和N,N-二甲基苯胺
这三种胺分别叫伯、仲、叔胺,可以用兴斯堡实验鉴别。即各取少量,分别加入对甲苯磺酰氯,N,N-二甲苯胺不反应,余者产生沉淀;再分别向生成沉淀的两种物质中加入氢氧化钠溶液,沉淀溶解的为对甲苯按,不溶的为N-甲基苯胺。
1.加入Na2CO3,有气体产生的是苯甲酸或邻羟基苯甲酸
2.加入Fe3+,发生显色反应的是邻羟基苯甲酸,反之是苯甲酸.
3.另一组加入苯磺酰氯,再加氢氧化钠,产物溶于水的是N-甲基苯胺,反之是邻甲苯胺.
用亚硝酸。亚硝酸可以用亚硝酸钠和盐酸反应得到。先将样品水溶液冷却到0-5℃,加入亚硝酸钠固体,再滴入盐酸。
N-甲基苯胺是个仲胺,发生亚硝化反应,生成油状物。
2-甲基苯胺是芳香伯胺,生成重氮盐。向重氮盐溶液中加入苯酚并加入氢氧化钠溶液碱化,会生成非常鲜艳红色的偶氮化合物。
N,N-二甲基苯胺是叔胺,和亚硝酸可逆的生成亚硝酸盐,观察不到明显变化。
环己胺是脂肪伯胺,与亚硝酸反应先生成重氮盐,但脂肪胺重氮盐极不稳定,会立即分解生成氮气。
我摘录了其中的一种
尿有形成分检查又称尿沉淀检查(examination of urinary sediments),是将新鲜尿离心后,经显微镜检查尿沉淀物中种有形成分的检查方法[1]。由于仪器分析进展,现代的尿有形成分检查可采用不离心法,用激光荧光染色及流式分析方法,(Sysmex UF50,UF100)或使用计算机图像自动识别系统(Iris IQ200)来计数尿中各种颗粒,因而又可称为尿中颗粒计数法(particle analysis)[2]。目前国内大多数医院实验室仍习惯于传统的普通显微镜检查法,由于在尿中可存在多种有形成分如细胞类、管型类、微生物类、结晶类等,为了进一步识别及鉴别为些成分除用普通光学显微镜外还有相差显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、干涉显微镜及电子显微镜等检查,而在普通显微镜检查又可分为染色及非染色法。非染色法检查是最简单又最常用的检查法。尿有形成分检查的重要性在于它是尿分析中不可缺少的检查手段,对临床诊断,治疗监测及健康普查有重要的临床意义。可确定进入尿路中的细胞种类如红细胞增多提示尿路出血,进一步检查红细胞形态则有助于确定出血是来自肾小球或下尿路;白(脓)细胞增多提示尿路感染;不同的尿路上皮细胞增我有助判断各种尿路病变部位;管型增多常提示肾小球肾炎、肾小管(远端、集合管病变)及肾功能减退;发现代谢或药物来源的结晶也有重要的临床价值[3]。
一、尿有形成分检查方法
检查尿有形成有多种方法下面简述8种方法要点便于比较及选择:
1. 传统的离心法:1997年全国临床检验操作规程[4](第2版)对非染色尿沉渣镜检及染色沉渣镜检操作规程作了明确规定,但在操作中未注明离心机种类只规定了1500r/min离心5min,也未规定必须注明留尿时间送检时间,结果判断和报告方式,显微镜观察10×10看管型,10×40,10个视野中看到细胞的最低和最高值,而观察管型应用高倍镜鉴定,但计数数量按低倍镜观察20个视野,算出一个视野的平均值记录结果,笔者曾在三级、二级及基层医院查证尿液登记簿,发现多数医院仍用斜形离心机3~5min,有的医院不离心将尿杯或试管内尿液沉渣直接倒到玻片上(不加盖片)不采用定量玻板计数发报告,而报告方式仍采用传统的加号(-、+、++、+++、++++),管型、上皮细胞不分类,报告少许、+、++,病房尿液常可在送检前数小时留出(规程则明确规定清晨空腹1次尿,应在1h内送检)这种传统方法随意性、变动性大,受操作者主观影响,判断不标准、结果不统一,无可比性,由于报告方式因人而异,是应淘汰的缺乏标准化的实验方法。
2. 标准镜检法:鉴于以上情况中华医学会检验分会临床检验学组在2002年召开3次尿镜检检查标准化会议,提出了尿沉渣检验标准化建议[5]。建议对材料和器械、标本和收集及运送、尿沉渣检验的操作步骤、应报告的尿沉渣内容等均进行明确规定。如容器、离心管、尿沉渣计数板、离心机(水平式)相对离心力应在400×g左右,显微镜则要求有内置光源,光线强度可调,应具备40倍、10倍的物镜和10倍的目镜。并对标本收集运送,标本接收均用了明确规定,本法适合在各级医疗单位中推广,添置Fast-Read-10或Kova板即可完成。由于操作统一,结果准确,报告一致,因而是值得推荐的尿沉渣检查法,问题是如何建立质量保证体系,开展室内质控、紧密联系临床及室间质评,定期开展沉渣专业培训,使尿沉渣的识别达到熟练化,不漏掉病理有形成分的要求[5]。
3. 尿液有形成分染色检查法:尿液有形成分染色的作用是:(1)防止漏栓;(2)防止误诊;(3)防止因长期镜检而造成的疲劳;(4)为长期保存尿中典型的病理成分,为提供教学、科研的图谱创造条件。尿液有形成分的染色体方法,可分为:①单染法;②复合染色;③活休染色;④鉴别染色;⑤特殊染色等[6]。日本伊藤机一推荐标准采尿法及4种染色法。NCCLS公布的尿检查方案Gp16A[7]中提到“染色法非常有助于细胞及管型鉴别”提倡用Malbin染色(结晶紫与沙黄法)及0.5 %甲苯胺蓝(Toluidine),同时列出鉴别尿中万分的特殊染色法有:①脂肪及卵圆脂肪体:油红或苏丹III②细菌:格蓝染色及巴氏染色[7].欧洲尿分析小组引用了Sternheimer染色,阿利新蓝-派洛林(Alcian-blue-pyronin B)[2]优于Sternheimer-Malbin染色.我们的尿液实验室也证实了S染色能弥补S-M染色易沉淀多染色深的缺点,是6种染色法中最优者[8].文献中也有用过氧化物酶染色来鉴别粒细胞管型、单核淋巴管型、淋巴细菌管型及肾小管上皮细胞管型[9].
4. 尿中颗粒过滤法:将一定量尿液(20~100ml)通过特殊滤网可以滤过并在滤过网上留住管型、细胞等病理颗粒[10],也有通过滤过网将红细胞置电镜是观察形态[11]。我们也见到德国波恩大学医院泌尿实验室采用特殊注射器加滤过网的商用产品问世。可惜因滤过网的万分必须染色识别,某些细胞在染色后溶解,加上此法价昂,因此难以普及[12]。
5. 不离心尿在细胞计数池上计数的快速过筛法:直接将不离心尿液置于尿细胞计数池内,在全国临床检验操作规程中作为定量过滤法介绍,在欧洲不予推荐,因结果不敏感,加上不是标准化的检测方法,故结果不稳定[2]。但是笔者曾经在上海第六人民医院应泌尿滴入改良牛鲍(Neubauer)血球计数池内观察5大格×2得出每ul细胞数,可快速取得实验结果,泌尿科医师认为以病情观察、疗效判断、病情走向趋势有利。但是在国外强调全液检查可采用浓度为0.2mm(总面积0.0625mm2)的Fuchs-Rosenthal板,视野宽广而结果更为准确可靠[2].
6. 尿沉渣工作站:工作站是将摄像显微镜、尿沉渣计数板及电脑三者联合一体化,如普利生AMP-2000U,华鑫DiasysR/S、合肥新月SQ-3000、美德太增洋、重庆天海US2020、北京国联在线的QO-S染色尿沉渣分析仪及千盛QS8005型流程式尿沉渣分析仪等,近见朗克斯LX-3000,包括标准这亘流动计数室、全种键盘控制\标准条形码识别、自动清洗、自动进样、出报告时可拷贝出一个视野图片).不论那个厂商生产的尿沉渣工作站,应强调标准化,即在留尿标本量、离心力、离心时间、沉渣留取量、显微镜镜头(最好配相差镜头) 、报告方式与标准镜检法要求一致,此方法优点在电脑报告定量结果,存在问题是如何提高检测速度?流动计算机板的清洗干净,要去除蛋白污垢,计数和辨认完全自动化,避免主观因素影响等.
7. 荧光染色流式细胞分析法:Sysmex公司生产UF50、UF-100尿沉渣流式细胞仪是利用沉渣中有形成分DNA与细胞膜与菲啶、羰化氰两种荧光染料接触后通过鞘流进行激光照射,各胡形成分产生前向散射光强度和荧光脉冲宽度,又通过电阻抗测出红细胞、血细胞大小散点图、直方图,仪器可自动报告红细胞、白细胞、上皮细胞、管型、细菌5个定量参数及小圆上皮细胞、霉菌、病理管型、结晶及精子5个定性参数,还可测出尿液电导率指标。由于无须离心,检测速度快,病理成分敏感度及重复性好,再由于每份尿样本检测步骤模式一致便于质量控制(有标准检测颗粒)及标准化,如与干化学试条联合应用还可以通过计算机处理观察两者间符合程度,临床上用于血尿鉴别、确定泌尿感染、了解肾功能等受到重视。仪器不足之处价格偏高,不能检测出滴虫、脂肪滴、病理及药物结晶,也不能识别病毒包涵体或肿瘤细胞;当尿中存在大量细菌、酵母菌、结晶等颗粒可干扰红细胞计数结果;也不能在影像中识别影红细胞及各种病理管型[13]。
8. 体外诊断尿影像系统-全自动智能显微镜(AIM):1983年由IRIS公司推出Yellow IRIS显微镜工作站,将尿液中各种颗粒在AIM通过影像并经电脑处理在荧光屏上显示。该公司在2000年推出改进大型939UDX全自动尿液分析仪后于2002年通过美国食品药品管理局(FDA)认证的小型IQ-200系统。包括了专利的无玻片显微镜及独特的高速码软件,易观察(easy-to-view)屏幕上清楚地尿中常见各种颗泣即白细胞、白细胞团、红细胞、鳞状上皮细胞、非鳞状上皮细胞、透明管型,未分类管型、结晶、细菌、酵母菌、精子及黏液。并可根据操作人员需要对鉴定结果进行修改以区分尿中有形成分的亚类,IQ-200原理先进,它综合了尿中各种颗粒的大小、对比度、外形及质地等技术参数,由灵敏度高的计算机判断出该颗粒的性质,据初步报道IQ-200总体灵敏度为83%(其中红细胞89.4%、白细胞93.9%、细菌93.9),总体特异性为83.3%(其中红细胞89.2%、白细胞88.8%、细菌88.1).使用IQ-200显微镜复查率可<5%(UF常>20%),但本法对各种细胞管型是否需要进一步染色鉴定,如嗜酸粒细胞用Hansel染色.脂肪管型用苏丹III染色尚未解决.因用计算机处理染色后颗粒难度加大,本仪器体积小、轻便、屏幕上显示多种病理颗粒,也有相关质控粒子配套,但观察本仪器未见压力鞘流系统,缺少染色直观资料,厂商在展览会提示456份尿标本与UF-100对照检查.IQ-200发现14份病理管型UF-100检出12份,因而认为敏感度特异度更高,但是尚需较大范围同更严格的临床实验室对比观察[
二、尿有形成分的识别
尿中有成分多达45种以上,常见
1. 红细胞:尿中典型红细胞呈双凹圆盘形、浅黄色、直径约8um易于识别,但由于尿中颗粒复杂多样,尿红细胞可因温度高、时间长、pH改变、渗透压变化发生形态改变,对经验不足的检验人员应与酵母样真菌、真菌孢子、脂肪滴、淀粉颗粒、草酸钙结晶、尿酸盐结晶及精子头等鉴别.通过对新鲜红细胞用相差显微镜观察可将尿中红细胞分成均一型、变形型及混合型.
2. 白细胞:尿中细胞主要为中性粒细胞,偶见单核细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞.新鲜尿中,白细胞外形完整,圆形直径10um~14um,胞质内颗粒可见,胞核清晰常可分散存在,在低渗及碱性尿中白细胞常胀大,约半数可在2h内溶解,在高渗及酸性尿中白细胞常皱缩,陈旧尿中白细胞浆因均质化呈明胶状,炎症时变性死亡白细胞外形多不整齐,结构模糊,胞质内可充满粗大颗粒,核结构不清,细胞常粘成团、胞界不清,称脓细胞.白细胞通过活体染色可区分为:(1)浓染细胞:着色深为老化或死亡白细胞(2)淡染细胞:细胞着色较浅为活性白细胞.可见于尿比重>1015时(3)闪光细胞:在低渗尿中,中性粒细胞变大,胞质内有分子运动,因光折射时可见闪光现象,尿有形成分中白细胞,肾小管上皮细胞与底层移行上皮细胞的鉴别 3. 管型:为尿有形成分中有重要意义成分,其数量种类组成形成大小与肾实质性病变的诊断、治疗观察、予后判断有一定价值.常见的3种细胞管型即红细胞管型、白细胞管型及上皮细胞管型
血、尿、便常规检验的影响因素
随着医学科学技术的飞速发展,临床检验的自动化程度的不断提高,检验项目更是日趋完善。但是临床检验最基本的血、尿、便三大常规却越来越不受到重视。为了能出据更准确的检验报告和让临床医生对数据有一定的分析能力。下面是我为大家带来的血、尿、便常规检验影响因素的知识,欢迎阅读。
1、血常规1.1不同采血方法的影响 血常规检验有末梢血和静脉血两种。末梢血的血样实际上是动静脉血、毛细血管血、组织间液和细胞内液组成,不能反映循环血液的真实情况。而静脉血则能很好的反映患者的实际情况。有研究表明,末梢血和静脉血的血常规结果有明显差异,末梢血白细胞(WBC)计数增高,血小板(PLT)计数明显偏低,原因是采末梢血时速度慢,出血不畅,组织液混入或血小板黏附于皮肤穿刺处形成微血块所致。末梢血测定的红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞比积(HCT)都低于静脉血。
1.2血样放置时间的影响 根据洪宗之的报道,血常规标本放置30min,WBC、PLT测定结果都明显低于即刻测定的结果,而RBC、HCT则无明显差异。但是也不能采血后立即检测,至少应放置5min以上,方能使血液与抗凝剂很好的融合。
1.3其他因素的影响 WBC的波动较大,受影响因素较多。正常情况下运动、饮食、疼痛、情绪都会对WBC产生影响。若想连续观察患者的WBC变化情况,应尽量选择静脉采血,保证抽血的顺利,每次在相同时间段,同一台仪器上检测,尽量减少各种干扰因素的存在。对于一些特殊情况应及时询问患者,如是否在化疗,是否服用了某些影响血液指标的药物,是否有某种疾病,对首次出现异常的患者应重新采血复查。
2、尿常规现在绝大数医院都是采用干化学法进行尿中葡萄糖(GLU)、胆红素(BIL)、酮体(KET)、比重(SG)、潜血(BLD)、酸碱度(PH)、蛋白质(PRO)、尿胆原(URO)、亚硝酸盐(NIT)、白细胞(LEU)、抗坏血酸(Vc)的测定。
2.1葡萄糖
干化学法的特异性强,试剂块只与葡萄糖反应。而班氏法则与尿中所有还原性糖(葡萄糖、乳糖和半乳糖)和所有还原性物质都反应。在稀释的尿液中,当比重偏高时,葡萄糖测试的反应灵敏度降低。当Vc浓度大于或等于2.8mmol/L或KET浓度高于4mmo/L时,能使低浓度的葡萄糖尿液呈假阴性反应。大剂量青霉素,左旋多巴都可出现假阴性。
2.2胆红素
正常情况下就是利用最敏感的方法也很难检测到尿液中有胆红素存在。所以当尿中存在胆红素,即使微量也提示其异常性。当病人服用氯丙嗪或尿中有某些药物的代谢物(如吡啶乙哚酸)在酸性条件下可致假阳性。当Vc浓度大于或等于1.4mmol/L,可造成假阴性。
2.3酮体
酮体是由乙酰乙酸、丙酮、β-羟丁酸三种组成的。酮体带对乙酰乙酸最敏感,丙酮次之,对β-羟丁酸不反应。而酮尿病患者尿中三种酮体的比例是:乙酰乙酸20=30%、丙酮1=2%、β-羟丁酸70%左右。所以,酮体带测定的是尿中乙酰乙酸与丙酮的总量。如果能测定β-羟丁酸,那灵敏度将会更高。正常尿液一般是呈阴性结果,含有色素或大量左多巴代谢物的尿液可能会出现假阳性(微量)。丙酮和乙酰乙酸都具有挥发性,更易受热分解,所以要防止出现假阴性或结果偏低。
2.4比重
比重测试可测定尿液中1.000-1.030之间的比重,高度缓冲的碱性尿会使检测结果较其它方法所得比重偏低,尿液存在一定数量蛋白时(1-7.5g/L)可使比重偏高。
2.5潜血
干化学法对完整的RBC,破损的RBC和游离血红蛋白或肌红蛋白均发生反应。潜血带测定的是这三者总和。大多数含RBC的尿液中都会含有溶解的RBC和游离的Hb.这是临床反映隐血二至三个“+”,而镜检仅发现少量RBC的主要原因。高比重尿可使测试结果偏低。Vc浓度大于或等于1.4mmol/L时,可使“微量”潜血呈假阴性。次氯酸、尿道感染产生的微生物中的过氧化物酶可使测试结果呈假阳性。所以,尿沉渣镜检是绝对要做的。而且红细胞的形态对鉴别肾小球源性和非肾小球源性血尿有重要价值。变形红细胞血尿多见于肾小球疾病而非肾小球疾病的血尿,红细胞多为均一的常规形态。因此,在出具化验单时,增加上红细胞的形态描述,对医生是有一定帮助的。
2.6酸碱度
尿液中的PH值在5=8.5范围内。尿标本时间过长,细菌分解尿液成分,使尿PH值呈减低趋势。
2.7蛋白质
干化学法对白蛋白敏感。对球蛋白、本周氏蛋白和黏液蛋白不敏感。因此“阴性”结果不排除其他蛋白的存在。璜基水杨酸定性、双缩脲定量,可以对白蛋白、球蛋白显示同样的敏感性。若疾病发展过程中需要系统观察尿蛋白的病例,最好使用上述的两种方法。大剂量静脉滴注青霉素的患者,易出现假阴性。尿液PH值小于3时易出现假阴性。当病人服用奎宁、奎宁丁和嘧啶药物或其他原因引起的碱性尿(PH>8)时,会出现假阳性。有文章报道,尿常规检测中,单纯RBC、WBC与蛋白质阳性者都存在不同程度的假阳性,而含两项指标以上异常者,几乎没有假阳性。
2.8尿胆原
尿胆原经空气氧化及空气照射后,转变成黄色的尿胆素(粪胆素)。因此,尿液必须新鲜,否则尿胆原氧化成尿胆素而致假阴性结果。甲醛的.存在会使尿胆原呈假阴性。干化学法不能检测尿胆原的消失。
2.9亚硝酸盐
此检测的意义是提示细菌感染,是基于尿液中革兰氏阴性菌将硝酸盐转化为亚硝酸盐的原理,但阴性的结果并不表示尿液中不存在细菌,阴性结果可见于非硝酸盐转化型细菌的尿道感染或尿液在膀胱中没有留足4小时以上使硝酸盐被还原。饮食中缺乏硝酸盐或高比重尿液可降低亚硝酸盐敏感度。对于含有少量亚硝酸盐(少于或等于13umol/L)的尿液,Vc浓度大于或等于1.4mmol/L时可产生假阴性。标本存放时间过长可呈假阳性。
2.10白细胞
干化学法测定白细胞的原理是检测粒细胞脂酶,与淋巴细胞、单核细胞不发生反应。白细胞破裂并不影响仪器检测。这就可以解释为什么仪器检测检出+、++、+++,却与镜检不符的现象。较多的白细胞不是粒细胞,仪器将报阴性或低值。例如:肾结核及肾移植病人发生排斥反应时,尿中以淋巴细胞为主,而致假阴性。可见尿液镜检的重要性。尿中含有大剂量的头孢霉素、庆大霉素或当尿蛋白大于3g/L,尿液中高浓度葡萄糖(160mmol/L)高比重尿都可使结果偏低或出现假阴性。而尿若被阴道分泌物污染,或含有甲醛,或含有高浓度胆红素,或某些药物如呋喃妥因,可产生假阳性。任何颜色异常的尿液均可影响试纸颜色的反应。
2.11抗坏血酸
通过检测可以了解到人体的Vc对葡萄糖、胆红素、潜血、亚硝酸盐等项目的影响程度。强还原性金属粒子,如亚铁、亚锡、亚铜、亚硫酸盐等会使测定值偏高。
2.12尿沉渣
虽然干化学法镜检快捷,对某些项目的灵敏度还很高,但管型、结晶、上皮、霉菌等无法识别。所以尿沉渣镜检是尿检时必须与干化学法一同做的项目。
3、粪便常规粪便常规是最直接、最简单易行的检测方法。要想得出最真实的结论,就要从下列几方面着手。
3.1常规标本留取
粪便标本留取的得当与否直接关系到结果的准确性。要叮嘱病人留便时不要与尿液或白带等其它分泌物混在一起。一般挑取六个部位的标准放入一次性便盒中,立即送检。若粪便为稀便、不成型便,要用干净容器接取,不要从便池中舀取,以免混有污水及尿液等其他分泌物,影响了检验结果。
3.2便潜血实验标本
便隐血实验提倡用胶体金法即单克隆抗体法,此法灵敏度高,样品中Hb浓度0.03mg/g就可检测出,不易漏检,而且不受饮食、药物等因素的干扰。但需注意一个问题,在肉眼可见的血便或柏油样便时,挑取标本制备悬液时应减少取样量,以防悬液浓度过高,而呈假阴性。以制备的悬液呈极淡的黄色透明液体为佳。
化学法即邻甲苯胺法,检测前三天病人不可食动物血、肉类、含过氧化酶的新鲜蔬菜(如韭菜、菠菜、西红柿、木耳等),铁剂和某些药物。而且此法灵敏度低,便中Hb达到5mg/g的量才能检测出。
3.3虫卵的检查
随着生活条件的改善,人们卫生习惯的良好养成,虫卵在常规检查中已很少看到。近几年已有大量文献报告灵芝孢子与吸虫卵极相似。但对于有外周血嗜酸性粒细胞增多,小细胞低色素性贫血的病人,应高度重视粪便虫卵的检查,应多次多部位涂片,或让患者留取一次全部粪便送检,进行硫酸锌浮采卵法,以提高阳性检出率。
对阿米巴滋养体及包囊,检测应注意便标本的保温和及时送检。有典型果酱样便,或痢疾症状的患者在便中若发现类似于阿米巴包囊样的物质应进行碘染色,进行仔细鉴别,切勿轻易下结论。
3.4粪便标本的检测
玻片上滴生理盐水一大滴,挑取粪便中有黏液、脓血等异常成分的部分,黏液不易涂开,尽多涂抺几次。但涂片也不宜太厚,以视野中的成分都均匀分开为一层,没有重叠复盖为宜。先用低倍镜观察至少10个视野,对红、白细胞、虫卵、原虫、结晶、脂肪滴等有形成分,可转换成高倍镜鉴别。对镜检就可看到大量球、杆菌的标本,可报出球、杆菌比例,提供给医生一个帮助。
3.5细菌学检查
霍乱弧菌的检查是直接涂片检查,即以悬滴法观察其特有的鱼群样的形态及运动方式。其它的肠道致病菌则需要依靠培养分离与鉴定。酶免疫法检测粪便幽门螺旋杆菌敏感度和特异性均达到90%以上。
总之,三大常规的检测,是检验学中最基本的项目。绝大多数医院对住院病人都要求必做。其实,是否可以考虑减少这样盲从的规定。据资料介绍,美国耶鲁大学医学院纽海芬医院有800多张床位,但每天进行的便常规检查仅3=4份。相比较而言,我们的这种普查,太缺乏针对性,对患者和检验人员都没有益处。