酵母双杂交的具体过程是什么？（中文）
菌株与质粒AH109酵母菌株(MATa，trp1．
901，leu2—3，112，ura3-52，his3-200，gal4A，gal8O~X，
LYS2：：G地1U^s-GALlT^T^-HIS3， G U^s—GAI2T^T^-
ADE2，URA3：：h吐1U^s．h吐1T^T^．1acZ)，YM187酵母
菌株(NATQ，um3-52，his3-200，ade2—101，trpl-901，
leu2-3，112，g △，met， O△，URA3：：GAL1U^s-
GAL1T^T^一laeZ，NE!,1)．I~BKT7-p53是编码鼠p53蛋
白(a．a．72—390)和GAL4 DNA BD(a．a．1—147)融合
蛋白的阳性对照质粒。pcArrr7．T是编码SV40大T
抗原(a．a．87—7O8)和GAL4 DNA．BD(a．a．1—147)融
合蛋白的阳性对照质粒，上述菌株与质粒均购自
CLONTECH公司。JIVl109大肠杆菌菌株购自promega
公司。
1．2 试剂鲑鱼精担体DNA，酵母培养用的YPD
Medium SD Minimal medium 一 DO Supplement 一Leu
DO Supplement、一Leu／一Trp DO Supplement、一Leu／Trp／His
DO Supplement、一Ade／一His／一L~aTrp 130 Supplement等
均购自CLONTECH。硫酸腺嘌呤(Adenine hemisul。
fate)购自Gibco。PEG 3250购自Sigma。DMSO购自
AMRESCO。硝酸纤维素膜购自Phamacia。X-Gal购
自BBI。QIAprep Miniprep Kit购自QIAGEN公司，其
它常规分子生物学试剂购自北京华美生物公司。
1．3 pGBKT7．ps3和t~alrr7．T质粒的制备用2
mL LB液体培养基扩增pGBKT7一p53和pGADT7一T质
粒。分别用小规模碱裂解法【7 (AIK法)和QtarREP
Miniprep Kit试剂盒(QIAGEN法)提取质粒。紫外分
光光度法测0D260／280，并计算质粒DNA含量。
1．4 酵母双杂交共转化实验按酵母操作手册
建议的方法进行转化，取不同量的上述两种方法提
取的pGBKT7—053和pGADT7．T质粒共转化到AH109
酵母菌株中，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：
10003种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／
Trp／一Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目
(cfu)。计算共转化效率：转化效率cfu／／．tg DNA=cfu
×悬浮细胞体积( )×稀释倍数／[铺板体积( )×
DAN‘](*这里的DNA的量指的是所用一份的
质粒量而非全部质粒总量)。
1．5 酵母双杂交顺序转化实验取不同量的上述
两种方法提取的pGBKT7—053转化于AH109酵母菌
株，用SD／ TW缺陷培养基筛选得到AH109[pGBKT7—
53]，挑取新鲜的直径为2—3 iran的AH109[pGBKT7一
p53]酵母单克隆4—8个，接种于1 ml SD／一Trp缺陷
液体培养基中，旋涡振荡1 mira，彻底打散菌团。将1
IIll菌液转移到5O IIll的sD液体缺陷培养基中。将
pGADT7一T转化于AH109[pGBKTT-53]，其余方法同
酵母操作手册，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：
1000三种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／一
Trp／．Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目
(cfu)。按上述公式计算转化效率。
1．6 酵母双杂交交配实验 将pGBKT~．p53和
pGADTrT质粒分别转化于酵母菌株AH109和
YM187中，待在相应SD缺陷培养基平板上生长出
克隆后，分别各挑取一个2—3 nl／n酵母单克隆共放
置于一个含有0．5 ml YPDA液体培养基的1O IIll离
心管中，涡流震荡1 min，彻底打散菌团，3ocI=、200rpm过夜培养(20—24 h)。100 交配培养物铺于
SD／一 一Leu培养基平板，200 交配培养物铺于
SD／一His／一I~u／Tw(TDO )培养基平板。检测二倍体数
目：将交配产物按照1：10、1：100、1：1000三种不同浓
度稀释，然后取100 铺于SD／一Trp／．Leu平板。待长
出克隆后计数cfu。计算二倍体细胞数目：cfu×悬
浮细胞体积(ta)×稀释倍数／铺板体积(ta)。
1．7 窖a1分析实验
1．7．1 8一半乳糖苷酶的定性分析 检测AH109
[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，挑
酵母克隆(新鲜直径为2—3 mm)划双斜线于平铺在
相应培养基平板上的灭菌的硝酸纤维素膜上，3ocI=
倒置培养24小时。将膜于液氮中冷冻，冷冻时间分
别为10 s、30 s、1 rain、2 rain，30cI=放置10 mill，置于浸
没于Z bufer／X．gal(100 ml Z bufer、0．27 ml f≥I巯基乙
醇、1．67 ml 20 mg／m~的X—ga1)溶液的滤纸上(z bufedX．
gal溶液以刚刚浸湿滤纸为佳)，放置于3OcI=下
进行观察，15 rain记录一次，以后可每隔1 h记录一
次。观察不同条件下菌落的颜色变化，划线的酵母
菌落颜色在8 h内显色变蓝的即为阳性结果。同时
没定液氮冷冻时间为1 min，比较处于不同显色温度
(25℃、30℃、37℃)下f；-半乳糖苷酶的活性。
1．7．2 8一半乳糖苷酶的定量分析定量分析AH109
[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，同
时以AH109[pCL1]为阳性对照，AH109[pGBKT7—053
+pG~rr7一T]和AH109[pGBKT~+pGADT~一T]为空载
体对照，AH109为阴性对照。AH109[pCL1]的稀释
倍数为3，其余的稀释倍数为1。具体步骤参照酵母
操作手册。计算p半乳糖苷酶的单位：1000×OD∞／
(t×V×ODao)，其中t为反应时间，V=0．1 ml×稀
释倍数。
YPD和YPDA的用途区别?
两者均用于酵母菌的培养和扩
繁。其中“A”表示腺嘌呤
(Adenine)，可以防止含有 ADE2突变等位基因的酵母菌株变成粉红色或红色。YPD不可以代替YPDA使用，反之可以。
YPD和YPDA的成分以及含量?
YPD含蛋白胨(2%)、酵母提取物(1%)、葡萄糖(2%)YPDA额外加入硫酸腺嘌呤
(0.012%)配置固体培养基额外加入琼脂粉(2%)。
YPD和YPDA是否需要调pH值?
酵母生长的pH值范围较广，5~7
都是其最适pH，YPD和YPDA溶
解后的pH值在6.0-6.5之间，无需调整。
序号 化合物名称 含量 (mg/L) 序号 化合物名称 含量 (mg/L)
1 无水氯化钙 185.00 31 维生素 D2 0.010
2 硝酸铁 0.72 32 氯化胆碱 0.500
3 氯化钾 400.00 33 叶酸 0.010
4 无水硫酸镁 97.6734 肌醇 0.050
5 乙酸钠 50.0035 维生素 K 0.016
6 氯化钠 6800.00 36 烟酰胺 0.025
7 无水磷酸二氢钠 122.00 37 烟酸 0.025
8 L-丙氨酸50.0038 对氨基苯甲酸 0.050
9 L-盐酸精氨酸 70.00 39 泛酸钙 0.010
10L-门冬氨酸 60.00 40 盐酸吡哆醇 0.025
11L-盐酸半胱氨酸 0.11 41 盐酸吡哆醛 0.025
12L-盐酸胱氨酸 26.00 42 维生素 A醋酸盐 0.100
13DL-谷氨酸 133.6043 核黄素 0.100
14L-谷氨酰胺 100.00 44 盐酸硫胺 0.010
15甘氨酸 50.0045 D 2 -磷酸生育酚钠盐 0.010
16L-盐酸组氨酸 21.88 46 硫酸腺嘌呤 10.00
17L-羟脯氨酸 10.0047 腺嘌呤三磷酸 1.00
18DL-异亮氨酸 40.00 48 腺嘌呤一磷酸 0.2385
19DL-亮氨酸 120.0049 胆固醇 0.200
20L-盐酸赖氨酸 70.00 50 脱氧核糖 0.500
21DL-甲硫氨酸 30.00 51 葡萄糖 1000
22DL-苯丙氨酸 50.00 52 还原谷胱甘肽 0.050
23L-脯氨酸 40.00 53 盐酸鸟嘌呤 0.300
24DL-丝氨酸 50.00 54 次黄嘌呤 0.300
25DL-苏氨酸 60.00 55 吐温 80 5.00
26DL-色氨酸 20.00 56 核糖 0.500
27L-酪氨酸.钠盐57.66 57 胸腺嘧啶 0.300
28DL-缬氨酸 50.00 58 尿嘧啶 0.300
29维生素 C 0.0566 59 黄嘌呤钠盐 0.300
30D-生物素 0.010 60 酚红 20.00 可以到生物帮那里找到啊。那里有大量的实验领域的精品技术文件，会对你有帮助的，我平时比较喜欢去那里找想要的东西，生物产品和技术信息都挺丰富的。可以到 www.bio1000.com/zt/cell/45828.html 了解细胞培养基成分的信息。序号 化合物名称 含量 (mg/L) 序号 化合物名称 含量 (mg/L)
1 无水氯化钙 185.00 31 维生素 D 2 0.010
2 硝酸铁 .9H 2 O 0.72 32 氯化胆碱 0.500
3 氯化钾 400.00 33 叶酸 0.010
4 无水硫酸镁 97.6734 肌醇 0.050
5 乙酸钠 50.0035 维生素 K 0.016
6 氯化钠 6800.00 36 烟酰胺 0.025
7 无水磷酸二氢钠 122.0037 烟酸 0.025
8 L-丙氨酸 50.00 38 对氨基苯甲酸 0.050
9 L-盐酸精氨酸 70.00 39 泛酸钙 0.010
10 L-门冬氨酸 60.00 40 盐酸吡哆醇 0.025
11 L-盐酸半胱氨酸 0.1141 盐酸吡哆醛 0.025
12 L-盐酸胱氨酸 26.00 42 维生素 A醋酸盐 0.100
13 DL-谷氨酸 133.60 43 核黄素 0.100
14 L-谷氨酰胺 100.00 44 盐酸硫胺 0.010
15 甘氨酸 50.00 45 D 2 -磷酸生育酚钠盐 0.010
16 L-盐酸组氨酸 21.88 46 硫酸腺嘌呤 10.00
17 L-羟脯氨酸 10.00 47 腺嘌呤三磷酸 1.00
18 DL-异亮氨酸 40.00 48 腺嘌呤一磷酸 0.2385
19 DL-亮氨酸 120.00 49 胆固醇 0.200
20 L-盐酸赖氨酸 70.00 50 脱氧核糖 0.500
21 DL-甲硫氨酸 30.00 51 葡萄糖 1000
22 DL-苯丙氨酸 50.00 52 还原谷胱甘肽 0.050
23 L-脯氨酸 40.00 53 盐酸鸟嘌呤 0.300
24 DL-丝氨酸 50.0054 次黄嘌呤 0.300
25 DL-苏氨酸 60.0055 吐温 80 5.00
26 DL-色氨酸 20.0056 核糖 0.500
27 L-酪氨酸.钠盐 57.6657 胸腺嘧啶 0.300
28 DL-缬氨酸 50.0058 尿嘧啶 0.300
29 维生素 C 0.056659 黄嘌呤钠盐 0.300
30 D-生物素 0.010
adenine hemisulfate（腺嘌呤硫酸盐）：白色结晶或结晶性粉末,易溶于热水；微溶于冷水。水溶性 0.4 g/100 mL。
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